廣西《水牛體細(xì)胞核移植技術(shù)操作規(guī)程》

ICS?FORMTEXT65.020.30FORMTEXTB43FORMTEXT?????DBFORMTEXT45DBFORMTEXT45/TFORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT?????FORMTEXT水牛體細(xì)胞核移植技術(shù)操作規(guī)程FORMTEXTThetechnicalprotocolforthesomaticcellnucleartransferinbuffaloFORMDROPDOWNFORMTEXT（本稿完成日期：）FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實施FORMTEXT廣西壯族自治區(qū)市場監(jiān)督管理局???發(fā)布DB45/TXXXXX—XXXX水牛體細(xì)胞核移植技術(shù)操作規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水牛體細(xì)胞核移植的術(shù)語和定義、試劑與儀器設(shè)備、體細(xì)胞核移植、核移植胚胎、胚胎發(fā)育特征與分級等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水牛體細(xì)胞核移植胚胎生產(chǎn)的規(guī)范化操作。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。術(shù)語與定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1體外成熟in-vitromaturation不經(jīng)超數(shù)排卵或應(yīng)用少量促性腺激素處理后，從活體或離體卵巢上獲取未經(jīng)體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞，經(jīng)過適宜的條件進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，使卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂到減數(shù)第2次分裂中期(MII期)并具備受精能力的發(fā)育過程。3.2體細(xì)胞核移植somaticcellnucleartransfer將供體細(xì)胞核移入除去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)過精子穿透即可被激活、分裂并發(fā)育成新個體，使得核供體的基因得到完全復(fù)制。試劑、耗材、設(shè)備和實驗室要求試劑所用試劑、藥品以及要求見附錄A。耗材所用耗材見附錄A。設(shè)備所用主要設(shè)備見附錄A。實驗室要求工作區(qū)由準(zhǔn)備室、緩沖間、無菌間、細(xì)胞保存室等組成。其中，緩沖間面積不得小于3m2，要求安置更衣柜和紫外燈，紫外燈強(qiáng)度不得低于1.5W/m3。紫外燈管距地面距離不應(yīng)超過2.5m，實驗操作前每次照射時間為20min～30min。無菌室無菌等級的最低標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到萬級，操作區(qū)應(yīng)達(dá)到百級。體細(xì)胞核移植的供體受體準(zhǔn)備卵母細(xì)胞的來源與收集母水牛屠宰后30min內(nèi)從屠宰場采集卵巢，置于30℃～37℃、含適量抗生素（如：100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的生理鹽水或磷酸鹽緩沖液(PBS)中，3h內(nèi)送至實驗室。在無菌條件下用37℃左右、含適量抗生素的生理鹽水或PBS洗滌卵巢，去除周圍結(jié)締組織后，用紗布吸干卵巢表面水分，用注射器套16號針頭抽吸卵巢表面直徑2mm～8mm的可見卵泡，回收卵泡液及其內(nèi)容物。將卵泡液轉(zhuǎn)入35mm或60mm的一次性塑料培養(yǎng)皿中，用自制的玻璃吸胚管或20μL加樣槍套吸頭，在體視顯微鏡下收集卵丘－卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus-oocytecompLexes,COCs，以下簡稱COCs），并轉(zhuǎn)入盛有新鮮洗卵液的培養(yǎng)皿中。卵母細(xì)胞的分級選擇卵母細(xì)胞分為A、B、C和D四級，其分級標(biāo)準(zhǔn)如下：——A級：胞質(zhì)均勻，外周包裹有三層以上致密卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞；B級：胞質(zhì)均勻，外周包裹卵丘細(xì)胞低于三層或部分脫落的卵母細(xì)胞；C級：卵丘細(xì)胞成蛛網(wǎng)狀擴(kuò)散或全部脫落、或胞質(zhì)不均勻的卵母細(xì)胞；D級：不規(guī)則、過成熟、死亡或退化的卵母細(xì)胞。注：一般選用A、B級卵母細(xì)胞用于培養(yǎng)；C、D級卵母細(xì)胞放棄不用。核移植胚胎的生產(chǎn)5.3卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)收集到的COCs用成熟培養(yǎng)液（見附錄B）洗滌3次后，轉(zhuǎn)入提前預(yù)熱2h、含1mL成熟培養(yǎng)液的20mm玻璃培養(yǎng)皿中。每個培養(yǎng)皿中放入的COCs不超過100個，并盡量集中在一起（亦可用50μL成熟培養(yǎng)液微滴覆蓋石蠟油培養(yǎng)，每個微滴放入約10個COCs）。在39℃、5%CO2、完全相對濕度、提前濕熱平衡24h以上的CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)22h～24h。5.4卵母細(xì)胞成熟的判定COCs培養(yǎng)22h～24h后，在體視顯微鏡下觀察，卵丘細(xì)胞擴(kuò)散，卵胞質(zhì)均勻、沒有空泡，在0.1%透明質(zhì)酸酶中吹打去除外周卵丘細(xì)胞后，輕輕翻轉(zhuǎn)卵母細(xì)胞可以觀察到第一極體（Pb1）則判定為成熟，否則視為未成熟。5.5供體細(xì)胞的準(zhǔn)備5.5.1卵丘細(xì)胞的培養(yǎng)將由通過OPU由供體水牛得到的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumuLus-oocytecompLexes,COCs），培養(yǎng)22h～24h后，吹打并收集卵丘細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)液（見附錄B），置于38.5℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)傳代至第3代～4代后，用0.25％胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，加入DMEM，260g離心5min，重復(fù)兩次，而后加入細(xì)胞冷凍液（DMEM＋10%DMSO+10%FBS），混勻，裝入細(xì)胞凍存管，在4℃冰箱中放置2h，-80℃存放過夜，而后投入液氮中保存。5.5.2成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)取少量（5g左右）水牛胎兒或耳部的部分組織，剪碎至小顆粒，而后均勻的放置在60mm培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿倒置在培養(yǎng)箱內(nèi)。待30min后其組織基本粘附于培養(yǎng)皿后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，5d～7d觀察細(xì)胞生長情況。100%匯集后用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，細(xì)胞培養(yǎng)傳代至第3代～4代后，用0.25％胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，用少量血清終止消化，260g離心5min，重復(fù)兩次。而后將細(xì)胞與冷凍液（DMEM＋10%DMSO+10%FBS）混勻，裝入細(xì)胞凍存管，在4℃冰箱中放置2h，-80℃存放過夜，而后投入液氮中保存。5.5.3供體細(xì)胞的準(zhǔn)備將體細(xì)胞于37℃水浴解凍后，加入DMEM離心洗滌去除DMSO后，用100μL細(xì)胞培養(yǎng)液微滴培養(yǎng)至80%～90%滿，而后加入DMEM＋0.5％FBS培養(yǎng)3天～5天，胰蛋白酶消化后用DMEM洗滌，作為供體細(xì)胞。6體細(xì)胞核移植胚胎的生產(chǎn)6.1卵母細(xì)胞的去核6.1.1紡錘體成像去核挑取含Pb1的卵母細(xì)胞。將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入30μL～40μL的去核操作液中（見附錄B），在配有紡錘體成像系統(tǒng)的倒置顯微鏡下，用外徑約120μm的固定管固定卵母細(xì)胞，內(nèi)徑約20μm的注射針翻轉(zhuǎn)卵母細(xì)胞，可見紡錘體區(qū)域較其它部位明亮，且不斷閃爍。吸取紡錘體、極體和周圍少量胞質(zhì)，在去核管中，清晰可見閃亮的紡錘體，確定去核。6.1.2熒光染色去核用含1μg/mLHochest33342的TCM199在培養(yǎng)箱孵育5min，轉(zhuǎn)入去核液操作液內(nèi)，在熒光顯微鏡下用顯微注射針吸取核和第一極體，之后再熒光照射，卵母細(xì)胞不見熒光染色則確定去核。6.1.3盲吸法去核挑取含第一極體的卵母細(xì)胞。將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入30μL～40μL的去核操作液中，吸取極體和其周圍約四分之一的胞質(zhì)。操作后的卵母細(xì)胞在去核操作液內(nèi)放置30min，而后在顯微鏡下挑出邊緣有小突起的卵母細(xì)胞，在顯微操作儀下去除小突起，即完成去核。6.2重組胚的構(gòu)建注射針吸取單個供體細(xì)胞，沿卵母細(xì)胞去核時留下的透明帶缺口注入卵周隙，整理透明帶，使體細(xì)胞膜與卵胞膜緊貼，便于融合。6.3重組胚的融合與激活將注核后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液中，培養(yǎng)30min，而后用融合液（見附錄B）洗滌一次，并在其中平衡5min，轉(zhuǎn)融合槽內(nèi)，轉(zhuǎn)動卵母細(xì)胞使供體細(xì)胞與卵母細(xì)胞的接觸面與電場方向垂直，施加電壓進(jìn)行融合（1.20KV/cm、10us、兩次脈沖）。將融合成功的重構(gòu)胚用5μmoL/L離子霉素（見附錄B）處理5min，而后轉(zhuǎn)入2mmoL/L6-DMAP（見附錄B）中處理3h～4h。6.4胚胎的體外培養(yǎng)胚胎用胚胎培養(yǎng)液（見附錄B）清洗2次后，移入已準(zhǔn)備好的水牛顆粒細(xì)胞單層微滴中，并置于含5％CO2，39℃及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48h更換半量胚胎培養(yǎng)液。培養(yǎng)48h后記錄卵裂數(shù)，6d～8d記錄囊胚數(shù)。7胚胎的分級與選擇水牛體外受精胚胎一般在發(fā)育到早期囊胚、囊胚或擴(kuò)張囊胚時用于移植或冷凍保存。體外生產(chǎn)的早期囊胚、囊胚或擴(kuò)張囊胚，根據(jù)其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和發(fā)育能力，及受精后的發(fā)育速度，分為A、B、C和D四級，如下：——A級胚胎：胚胎發(fā)育階段與胚齡一致。胚胎結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，輪廓清晰呈球形，分裂球大小均勻，胚細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊湊，透明度好，無附著細(xì)胞和液泡；——B級胚胎：胚胎發(fā)育階段與胚齡基本一致。胚胎輪廓清晰，色調(diào)和細(xì)胞密度良好，可見一些附著細(xì)胞和液泡，變形細(xì)胞約占10%～30%；——C級胚胎：胚胎發(fā)育階段與胚齡不太一致。胚胎輪廓不清晰，色調(diào)較暗，結(jié)構(gòu)較松散，游離細(xì)胞和液泡較多，變形細(xì)胞約占30%～50%；——D級胚胎：A、B、C級以外的胚胎。注1：第6d～7d的囊胚發(fā)育潛能要好于第8d及其后的囊胚。注2：A、B、C級胚胎均為可用胚胎，其中A級和B級胚胎可進(jìn)行冷凍，而C級胚胎只用于鮮胚移植，D級胚胎為不可用胚胎。

（規(guī)范性附錄）

試劑、耗材和設(shè)備主要試劑及要求試劑名稱碳酸氫鈉（NaHCO3）、乙二醇（(CH2OH)2,EG）、蔗糖、甘油、HEPES、肝素、TCM199、PBS（磷酸緩沖鹽溶液）、胎牛血清（FBS）、牛血清白蛋白（BSA）、山梨醇、乙酸鈣、乙酸鎂、細(xì)胞松弛素B、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶。試劑要求所用的試劑除特殊規(guī)定外，均為分析純及其以上純度的化學(xué)試劑，符合組織細(xì)胞培養(yǎng)要求。TCM199、胎牛血清等為推薦選用胚胎培養(yǎng)測試的產(chǎn)品。血清的滅活處理新購的胎牛血清，已注明滅活處理的，用0.45μm濾器過濾滅菌后，可以直接使用；未注明滅活處理的，需56℃水浴滅活30min，用0.45μm濾器過濾滅菌后使用。血清經(jīng)滅活及過濾滅菌后，分裝并于-20℃或-80℃超低溫冰箱中長期保存?zhèn)溆?。主要耗材玻璃培養(yǎng)皿：20mm塑料培養(yǎng)皿：35mm、60mm濾器：0.22μm、0.45μm移液器（2μL，20μL，200μL，1000μL）移液器盒（2μL，20μL，200μL，1000μL）0.25mL塑料胚胎麥管胚胎吸管玻璃細(xì)管：5mm透明硅膠軟管脫脂棉紗布封口膜標(biāo)簽紙記號筆一次性乳膠或PE手套主要設(shè)備體視顯微鏡(20×)CO2培養(yǎng)箱(38℃～39℃、5%CO2和100%最大飽和濕度)冰箱或冰柜（-20℃～4℃）高壓滅菌器超凈工作臺恒溫?zé)崤_（39℃）低溫冰箱（-80℃）電子分析天平（感量0.01mg）移液器（2μL，20μL，200μL，1000μL）超聲波清洗儀電熱鼓風(fēng)干燥箱雙重蒸餾器超純水儀液氮生物容器酒精燈顯微操作儀細(xì)胞融合儀

（規(guī)范性附錄）

工作液的配制去核液的配制取1mg的細(xì)胞松弛素B，加入1mL的DMSO溶解后制備成貯液。而后取75μL貯液加入10mL的TCM199+10%FBS內(nèi)，即為終濃度為7.5μg/mL的去核操作液。融合液的制備配比為250mM山梨醇+0.1mM醋酸鈣+0.5mM醋酸鎂+0.5mMHepes+0.1%BSA，一般每次配液的量為500mL，調(diào)PH值至7.2-7.4，過濾分裝待用。離子霉素的制備取1mg的離子霉素，加入0.2677mL的DMSO，混勻后分裝。每次激活取1μL貯液加入1mL的TCM199即為濃度為5μmoL/L工作液。6-DMAP的制備取16.318mg的6-DMAP，加入1mLDMSO，而后每10μL分裝入1.5mLEP管為貯液，加入990