DB12-T1148-2022-綿羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程-天津市

ICS65.020.30CCSB4312天津市地方標(biāo)準(zhǔn)DB12/T1148—2022綿羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程Technicalregulationsforembryotransferofmeatsheep天津市市場監(jiān)督管理委員會發(fā)布DB12/T1148—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委提出并歸口。本文件起草單位：天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本文件主要起草人：張金龍、張效生、郭曉飛、葛慎鋒、李義海、馮婧、姚大為、李玉鵬、董春曉、王彪、陳龍賓。IDB12/T1148—2022綿羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了綿羊胚胎移植技術(shù)中實驗室準(zhǔn)備、供體羊沖胚、檢胚及胚胎質(zhì)量鑒定、受體羊胚胎移植等技術(shù)要求。本文件適用于綿羊胚胎移植。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T816肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)DB12/T137肉用綿羊飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。將一頭母畜（供體）的受精卵取出，移植到另一頭母畜（受體）體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育至分娩產(chǎn)仔。44.14.24.32DB12/T1148—20224.3.3室內(nèi)環(huán)境溫度保持在20℃～25℃，避免陽光直射。5供體羊沖胚5.1供體羊選擇5.1.15.1.2供體羊譜系清楚、遺傳穩(wěn)定，品種優(yōu)良、生產(chǎn)性能好；體質(zhì)健壯，年齡在1歲～4歲；5.2供體羊飼養(yǎng)管理保持穩(wěn)定的飼養(yǎng)環(huán)境，避免應(yīng)激，飼養(yǎng)符合DB12/T137、NY/T816規(guī)定。5.35.45.55.6同期發(fā)情在母羊發(fā)情周期的任意一天放置孕酮栓，具體參見附錄D。超數(shù)排卵母羊放置孕酮栓后第10天開始注射促卵泡素（FSH），2次/天，連續(xù)4天，具體見附錄D。發(fā)情鑒定取出陰道栓后每隔8小時用公羊試情1次，以母羊站立接受公羊爬跨為母羊發(fā)情標(biāo)準(zhǔn)。人工授精5.7供體羊在手術(shù)前12小時空腹、禁水。乳房前，腹部備皮，范圍20cm×20cm。備皮后用5%碘酊棉球消毒，再用75%酒精棉球脫碘。供體羊仰臥保定于手術(shù)床上，肌肉注射麻醉，麻醉后,使手術(shù)床與地面成45℃。在乳房前2cm～3cm，腹中線側(cè)面做5cm的縱向切口，依次切開皮膚、肌肉和腹膜。從切口處取出子宮角，記錄卵巢黃體的數(shù)量。在子宮角大彎處用止血鉗尖扎孔，將沖胚管插入，用注射器充氣使沖卵管的氣囊封閉一側(cè)子宮角，沖卵管的另一端接90㎜平皿。沖卵針從子宮角末端向子宮角大彎方向刺入，使沖卵針、子宮角和沖卵管形成通路。用注射器吸30ml沖胚液注入沖卵針沖洗子宮角，將液體經(jīng)過沖卵管回收至90㎜培養(yǎng)皿中。3DB12/T1148—20225.7.5創(chuàng)口縫合5.7.5.15.7.5.25.7.5.3沖胚完成后，將子宮送回腹腔?？p合創(chuàng)口，肌肉腹膜連續(xù)縫合、皮膚結(jié)節(jié)縫合，皮膚前創(chuàng)口撒消炎粉。縫合完成后進行創(chuàng)面整理，碘酊消毒，注射抗生素和解麻藥物，解除保定。6檢胚及胚胎質(zhì)量鑒定6.1檢胚6.1.16.1.26.1.3在35mm的培養(yǎng)皿中注入胚胎保存液，放在恒溫臺上預(yù)熱。將收集到的沖胚液移至實體顯微鏡下，檢出胚胎，移入35mm的培養(yǎng)皿中。每個平皿在顯微鏡下重復(fù)檢查3次，檢出平皿中所有胚胎。6.2胚胎質(zhì)量鑒定6.2.16.2.2胚胎發(fā)育階段和質(zhì)量鑒定，參見附錄E。鑒定后的胚胎做好記錄，包括羊號、胚胎發(fā)育階段、質(zhì)量等信息，見附錄F。6.3胚胎裝管6.3.16.3.2在體視顯微鏡下，將鑒定后的胚胎裝入胚胎移植槍中，準(zhǔn)備移植。胚胎裝入移植槍按照三段液滴兩段空氣，胚胎液滴位于移植槍的中間段。77.1受體羊組群加強飼養(yǎng)管理，保持環(huán)境相對穩(wěn)定，避免應(yīng)激，飼養(yǎng)符合DB12/T137、NY/T816規(guī)定。手術(shù)法：參考供體羊手術(shù)5.7.2，取出子宮和卵巢，觀察黃體數(shù)量和顏色，進行記錄；腹腔內(nèi)窺鏡法：在受體羊乳房前2cm～3cm腹中線兩側(cè)做各做一個創(chuàng)口，通過腹腔內(nèi)窺鏡觀察黃體數(shù)量、大小和顏色，并取出有黃體測的子宮角，進行記錄。在子宮角細(xì)段扎孔，將裝有胚胎的移植槍通過該孔導(dǎo)入子宮角，推出胚胎，將子宮角送回腹腔4DB12/T1148—2022移植胚胎后的受體羊，避免應(yīng)激反應(yīng)，飼養(yǎng)管理符合DB12/T137、NY/T816規(guī)定。7.4.75DB12/T1148—2022附錄A（資料性）同期發(fā)情、超數(shù)排卵耗材同期發(fā)情、超數(shù)排卵耗材見表A.1。表A.1同期發(fā)情、超數(shù)排卵耗材序號名稱孕酮栓用途123456供、受體羊同期發(fā)情供體羊超數(shù)排卵供、受體羊同期發(fā)情供體羊同期排卵子宮角沖胚促卵泡素（FSH）孕馬血清促性腺激素（PMSG）促黃體素釋放激素（LH）沖胚液胚胎保存液（Holding）胚胎體外保存6DB12/T1148—2022附錄B（資料性）常規(guī)耗材常規(guī)耗材見表B.1。表B.1常規(guī)耗材序號1名稱手術(shù)器械1套消炎粉用途供、受體羊手術(shù)手術(shù)創(chuàng)口消炎手術(shù)創(chuàng)口縫合子宮角沖胚23縫合線4沖卵管5沖卵針子宮角沖胚6胚胎移植槍90mm培養(yǎng)皿35mm培養(yǎng)皿75%酒精碘酊受體羊移植胚胎用收集沖胚液用78胚胎保存和質(zhì)量鑒定手術(shù)部位消毒91011手術(shù)部位消毒供、受體羊手術(shù)后抗感染7DB12/T1148—2022附錄C（資料性）胚胎移植設(shè)備胚胎移植設(shè)備見表C.1。表C.1胚胎移植設(shè)備序號名稱用途1234567移動紫外燈水浴鍋實驗室消毒生理鹽水和沖胚液加熱、保溫供、受體羊保定手術(shù)床生物顯微鏡腹腔內(nèi)窺鏡體視顯微鏡恒溫臺精子活力檢查輸精和移植胚胎用檢胚和胚胎質(zhì)量鑒定胚胎恒溫操作8DB12/T1148—2022附錄D（資料性）綿羊胚胎移植方案綿羊胚胎移植方案見表D.1。表D.1綿羊胚胎移植方案序號名稱用途第0天第10天第11天第12天第13天第14天第15天第21天埋植孕酮栓肌注FSH埋植孕酮栓肌注FSH肌注FSH肌注FSH，撤去孕酮栓肌注PMSG，人工輸精發(fā)情羊肌注促黃體素（LH）、人工輸精胚胎收集撤去孕酮栓，肌注PMSG觀察發(fā)情移植胚胎9DB12/T1148—2022附錄E（資料性）胚胎鑒定E.1胚胎的發(fā)育階段鑒定：a)b)c)桑椹胚：5天～6天，只能觀察到球狀細(xì)胞團，分不清分裂球，細(xì)胞團占據(jù)卵黃腔大部分；致密桑椹胚：6天～7天，細(xì)胞團變小，占卵黃腔的60%-70%；早期囊胚：7天～8天，細(xì)胞團一部分出現(xiàn)光亮胚胞腔，細(xì)胞團占據(jù)70%-80%，難以分清內(nèi)細(xì)胞團和滋養(yǎng)層；d)e)囊胚：7天～8天，內(nèi)細(xì)胞團和滋養(yǎng)層界限清晰，胚腔明顯，細(xì)胞充滿卵黃腔；擴張囊胚：8天～9天，囊胚腔明顯擴大，體積增大到原來的1.5倍，與透明帶無間隙，透明帶變??；f)g)孵化胚：9天～11天，胚胞腔繼續(xù)擴張，致使透明帶破裂，卵細(xì)胞脫出；凡在6推薦～8天回收的16細(xì)胞以下的胚胎均列為非正常發(fā)育胚胎，不宜使用。E.2胚胎質(zhì)量鑒定：a)A級：胚胎形態(tài)完整，輪廓清晰，分裂球均勻，緊湊，色調(diào)、透明帶適中，無附著細(xì)胞和液泡；b)B級：輪廓清晰，色調(diào)及細(xì)胞密度良好，可見到少量附著細(xì)胞和液泡，變性細(xì)胞占10%～20%；c)C級：輪廓不