《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室》課件

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室概述微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室是研究微小生物的專(zhuān)業(yè)場(chǎng)所主要研究對(duì)象包括細(xì)菌、真菌、病毒和原生動(dòng)物結(jié)合理論與實(shí)踐，培養(yǎng)專(zhuān)業(yè)技能實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)程個(gè)人防護(hù)穿實(shí)驗(yàn)服，戴口罩、手套生物安全遵循生物安全分級(jí)管理制度緊急處理熟悉消防設(shè)備位置和逃生路線衛(wèi)生要求實(shí)驗(yàn)后立即洗手，不在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飲食微生物實(shí)驗(yàn)室的基本設(shè)備基礎(chǔ)觀察設(shè)備顯微鏡是基礎(chǔ)工具包括普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡培養(yǎng)設(shè)備培養(yǎng)箱維持恒溫環(huán)境超凈工作臺(tái)提供無(wú)菌操作區(qū)域滅菌設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋干熱滅菌箱處理耐熱物品顯微鏡的使用開(kāi)啟電源調(diào)整光源強(qiáng)度適中從低倍物鏡開(kāi)始先使用4×或10×物鏡定位粗調(diào)焦后精調(diào)焦小心轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)焦旋鈕避免鏡頭觸碰標(biāo)本調(diào)整目鏡間距適合操作者眼距以獲得清晰視野油鏡的正確操作方法準(zhǔn)備工作標(biāo)本染色并干燥，低倍鏡下先找到目標(biāo)區(qū)域旋轉(zhuǎn)至油鏡位置將轉(zhuǎn)換器旋轉(zhuǎn)，使100×油鏡對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本滴加浸油在玻片上滴一小滴浸油，避免氣泡精確對(duì)焦使用精調(diào)焦旋鈕，小心緩慢調(diào)整直至圖像清晰使用完畢清潔用鏡頭紙輕輕擦拭油鏡，不可用有機(jī)溶劑無(wú)菌操作技術(shù)洗手消毒實(shí)驗(yàn)前徹底清潔雙手滅菌器材接種環(huán)火焰滅菌至紅熱開(kāi)啟試管單手操作，試管口經(jīng)火焰消毒轉(zhuǎn)移微生物保持環(huán)境潔凈，快速完成操作超凈工作臺(tái)的使用使用前準(zhǔn)備開(kāi)啟紫外燈消毒20-30分鐘關(guān)閉紫外燈，開(kāi)啟風(fēng)機(jī)10分鐘用75%酒精擦拭工作臺(tái)面操作注意事項(xiàng)避免遮擋氣流路徑動(dòng)作輕緩，避免產(chǎn)生氣流擾動(dòng)器材放置有序，保持空間整潔使用后處理清理工作臺(tái)面所有物品用消毒液擦拭臺(tái)面關(guān)閉風(fēng)機(jī)，開(kāi)啟紫外燈消毒培養(yǎng)基的種類(lèi)基礎(chǔ)培養(yǎng)基適合大多數(shù)非苛養(yǎng)菌生長(zhǎng)選擇性培養(yǎng)基含特定抑制成分，抑制某些菌生長(zhǎng)鑒別培養(yǎng)基含指示劑，可區(qū)分不同代謝產(chǎn)物富集培養(yǎng)基含特殊營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)特定微生物生長(zhǎng)運(yùn)輸培養(yǎng)基維持微生物活力但限制增殖培養(yǎng)基的配制原則提供平衡營(yíng)養(yǎng)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子均衡適宜的水分活度保證微生物代謝所需水分合適的pH值大多數(shù)培養(yǎng)基pH6.8-7.2氧化還原電位滿(mǎn)足不同微生物的氧需求固體培養(yǎng)基的制備1.5-2%瓊脂濃度提供適當(dāng)硬度支持微生物生長(zhǎng)121°C滅菌溫度高壓蒸汽滅菌15-20分鐘45-50°C傾注溫度避免瓊脂凝固又不損傷熱敏成分4°C保存溫度防止水分蒸發(fā)和污染液體培養(yǎng)基的制備準(zhǔn)確稱(chēng)量按照配方精確稱(chēng)量各組分溶解混合在蒸餾水中充分溶解調(diào)整pH值使用pH計(jì)測(cè)量并調(diào)整至目標(biāo)值分裝均勻分裝入試管或燒瓶滅菌高壓蒸汽滅菌確保無(wú)菌高壓蒸汽滅菌鍋的使用使用前檢查檢查水位、壓力表和密封圈裝載物品合理擺放，確保蒸汽可充分接觸設(shè)置參數(shù)通常121°C，15-20分鐘等待完成壓力自然降至零后方可開(kāi)蓋取出物品使用隔熱手套避免燙傷干熱滅菌法適用物品玻璃器皿、金屬器械、耐熱粉末不適用物品液體、含水物質(zhì)、熱敏物品溫度時(shí)間160°C×2小時(shí)或180°C×30分鐘優(yōu)點(diǎn)徹底滅菌，無(wú)殘留，無(wú)腐蝕缺點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)，能耗高，應(yīng)用范圍有限過(guò)濾滅菌法原理利用微孔濾膜物理截留微生物適用范圍熱敏性液體、氣體、血清和抗生素溶液常用濾膜聚乙烯膜、醋酸纖維膜，孔徑0.22μm操作方式正壓或負(fù)壓過(guò)濾系統(tǒng)接種技術(shù)：劃線法滅菌接種環(huán)火焰滅菌至紅熱并冷卻取樣挑取少量菌懸液或單個(gè)菌落劃線一三象限密集劃線，二四象限逐漸稀釋培養(yǎng)倒置放入培養(yǎng)箱適溫培養(yǎng)接種技術(shù)：涂布法涂布法適用于定量分析，需準(zhǔn)確移取0.1-0.2mL菌液均勻涂布于瓊脂表面玻璃涂布棒需火焰滅菌并冷卻后使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿確保均勻分布接種技術(shù)：傾注法加入菌液將1mL稀釋好的菌液加入空培養(yǎng)皿傾注培養(yǎng)基加入45-50℃融化的瓊脂培養(yǎng)基混勻轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使菌液與培養(yǎng)基充分混合凝固培養(yǎng)待凝固后倒置培養(yǎng)細(xì)菌的單染色法常用染料：亞甲藍(lán)、龍膽紫、復(fù)紅、堿性品紅等優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單快速，能清晰觀察細(xì)菌形態(tài)和排列方式革蘭氏染色法原理革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁肽聚糖層厚結(jié)晶紫-碘復(fù)合物不易被脫色劑洗脫顯紫色革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖層薄外膜含脂質(zhì)，易被酒精脫色復(fù)染后顯紅色是細(xì)菌分類(lèi)和鑒定的重要依據(jù)，也是選擇抗生素的參考革蘭氏染色法操作步驟涂片固定制備細(xì)菌涂片，空氣干燥，火焰固定結(jié)晶紫染色加結(jié)晶紫染液1分鐘，水洗碘液處理加碘液1分鐘，形成結(jié)晶紫-碘復(fù)合物脫色95%酒精脫色10-20秒，立即水洗復(fù)染加沙黃或復(fù)紅復(fù)染30秒，水洗芽胞染色法制備涂片選取含芽胞菌種制備涂片并固定初染覆蓋孟加拉紅或堿性品紅，加熱至冒蒸汽5分鐘脫色水洗用水沖洗染液，再用0.5%鹽酸酒精脫色10秒4復(fù)染亞甲藍(lán)復(fù)染30秒，水洗，晾干莢膜染色法莢膜的意義保護(hù)細(xì)菌免受環(huán)境危害增強(qiáng)細(xì)菌毒力，抵抗吞噬幫助菌體附著于宿主表面染色原理負(fù)染法：背景著色而莢膜無(wú)色創(chuàng)造對(duì)比顯示莢膜輪廓常用墨汁或黑藍(lán)墨水作背景操作要點(diǎn)使用新鮮培養(yǎng)物避免加熱固定使用稀釋染料染菌體觀察時(shí)調(diào)節(jié)光圈獲得最佳對(duì)比細(xì)菌形態(tài)觀察球菌球形，直徑0.5-1.0μm可呈單個(gè)、成對(duì)或鏈狀排列桿菌桿狀，1-10μm長(zhǎng)兩端圓形或方形螺旋菌螺旋形或彎曲長(zhǎng)度和彎曲度各異真菌形態(tài)觀察4酵母菌單細(xì)胞卵圓形或橢圓形霉菌多細(xì)胞絲狀體，形成菌絲網(wǎng)絡(luò)孢子不同真菌產(chǎn)生特征性孢子二相性真菌在不同條件下可表現(xiàn)為酵母或霉菌形態(tài)原生動(dòng)物形態(tài)觀察制備濕片觀察活體運(yùn)動(dòng)特征注意調(diào)節(jié)光圈獲得最佳對(duì)比度觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)：核、偽足、纖毛、鞭毛等細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定時(shí)間(小時(shí))菌數(shù)(logCFU/mL)生長(zhǎng)曲線分為滯后期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和死亡期分光光度計(jì)的使用預(yù)熱儀器開(kāi)機(jī)預(yù)熱15-30分鐘2選擇波長(zhǎng)細(xì)菌通常選擇600nm波長(zhǎng)空白校正使用無(wú)菌培養(yǎng)基調(diào)零測(cè)量樣品記錄吸光度值(OD值)平板計(jì)數(shù)法梯度稀釋制備10^-1至10^-8系列稀釋液平板接種每個(gè)稀釋度接種2-3個(gè)平行平板培養(yǎng)適溫培養(yǎng)至菌落可數(shù)計(jì)數(shù)選取30-300個(gè)菌落的平板計(jì)數(shù)計(jì)算CFU/mL=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)最近似數(shù)法（MPN法）適用范圍水樣和食品中低濃度微生物計(jì)數(shù)原理統(tǒng)計(jì)學(xué)原理估計(jì)活菌數(shù)量操作步驟梯度稀釋?zhuān)喙馨l(fā)酵，記錄陽(yáng)性管數(shù)判讀方法參照MPN表，根據(jù)各組陽(yáng)性管數(shù)確定MPN值優(yōu)點(diǎn)可檢測(cè)低濃度微生物，適用不能形成菌落的微生物缺點(diǎn)精確度低，操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)細(xì)菌菌落形態(tài)觀察大小微小型、小型、中等、大型形狀圓形、不規(guī)則、絲狀、根狀邊緣整齊、波浪狀、齒狀、絲狀表面光滑、粗糙、顆粒狀、皺褶真菌菌落形態(tài)觀察生長(zhǎng)速度緩慢、中等或快速生長(zhǎng)質(zhì)地絨毛狀、粉末狀、棉絮狀、蠟質(zhì)顏色變化觀察正反面顏色，隨生長(zhǎng)階段變化表面特征放射狀褶皺、同心環(huán)、區(qū)域分化微生物的分離與純化獲得純培養(yǎng)物單一菌種的純培養(yǎng)分離培養(yǎng)將混合菌群分離為單個(gè)菌落3富集培養(yǎng)創(chuàng)造有利條件促進(jìn)目標(biāo)微生物生長(zhǎng)樣品采集正確采集并保存微生物樣品稀釋平板法10?1初始稀釋樣品與稀釋液1:9混合10??最終稀釋度連續(xù)稀釋至適宜濃度0.1mL接種量取適量稀釋液接種平板30-300理想菌落數(shù)易于計(jì)數(shù)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義劃線分離法第一象限接種環(huán)蘸取菌液密集劃線第二象限從第一象限邊緣少量菌液劃入第三象限同理從第二象限邊緣劃入第四象限最終獲得分散單菌落單菌落分離法初次分離混合培養(yǎng)物劃線或稀釋平板挑取單菌落選擇典型、分離良好的單個(gè)菌落二次劃線純化將單菌落再次劃線培養(yǎng)純度檢驗(yàn)顯微鏡觀察和培養(yǎng)特性驗(yàn)證菌種保藏確認(rèn)純度后進(jìn)行保存菌種保藏方法短期保藏斜面保藏：4℃冰箱，1-3個(gè)月礦物油覆蓋：防止水分蒸發(fā)水中保存：無(wú)菌蒸餾水中懸浮中期保藏凍干保存：-20℃，1-3年瓊脂塊保存：培養(yǎng)基塊浸入甘油硅膠干燥保存：孢子在硅膠中長(zhǎng)期保藏超低溫凍存：-80℃，5-10年液氮保存：-196℃，10年以上冷凍干燥：真空條件下，10年以上細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)：糖發(fā)酵試驗(yàn)原理檢測(cè)微生物分解糖產(chǎn)酸或產(chǎn)氣能力培養(yǎng)基含特定糖和pH指示劑操作方法接種待測(cè)菌于含糖發(fā)酵管適溫培養(yǎng)24-48小時(shí)結(jié)果判讀產(chǎn)酸：指示劑變色產(chǎn)氣：倒管中出現(xiàn)氣泡細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)：硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基TSI培養(yǎng)基或SIM培養(yǎng)基接種方法直刺和劃線接種于斜面培養(yǎng)條件37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)結(jié)果判定黑色沉淀為H?S陽(yáng)性細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)：吲哚試驗(yàn)1原理檢測(cè)色氨酸分解為吲哚的能力2培養(yǎng)接種于含色氨酸的肽水中3加試劑培養(yǎng)后添加柯瓦奇試劑結(jié)果判讀表層形成紅色環(huán)為陽(yáng)性細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)：甲基紅試驗(yàn)原理檢測(cè)混合酸發(fā)酵產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)的能力培養(yǎng)MR-VP培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)48小時(shí)加指示劑加入5滴甲基紅試劑結(jié)果判讀紅色為陽(yáng)性，黃色為陰性細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)：VP試驗(yàn)原理檢測(cè)丁二醇發(fā)酵產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的能力1培養(yǎng)基MR-VP培養(yǎng)基，與甲基紅試驗(yàn)共用試劑α-萘酚和40%KOH溶液3判讀15分鐘內(nèi)出現(xiàn)玫瑰紅色為陽(yáng)性細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)：檸檬酸鹽利用試驗(yàn)原理檢測(cè)微生物以檸檬酸鹽為唯一碳源的能力培養(yǎng)基西蒙檸檬酸鹽瓊脂(Simmonscitrateagar)指示劑溴麝香草酚藍(lán)，pH上升變藍(lán)色接種方法在斜面表面劃線接種培養(yǎng)條件35-37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)陽(yáng)性結(jié)果培養(yǎng)基從綠色變?yōu)樗{(lán)色陰性結(jié)果培養(yǎng)基保持原綠色細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)：尿素酶試驗(yàn)原理：檢測(cè)微生物分解尿素產(chǎn)生氨的能力判讀：pH升高導(dǎo)致指示劑從黃色變?yōu)榉奂t色為陽(yáng)性細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)：過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)原理：檢測(cè)微生物分解H?O?產(chǎn)生水和氧氣的能力方法：滴加3%H?O?于菌落上觀察氣泡產(chǎn)生結(jié)果：產(chǎn)生氣泡為陽(yáng)性，無(wú)氣泡為陰性細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)：氧化酶試驗(yàn)原理檢測(cè)細(xì)胞色素氧化酶存在與否傳遞電子給氧的末端氧化酶試劑1%對(duì)-氨基-N,N-二甲基苯胺或氧化酶試紙操作方法滴加試劑于新鮮菌落或?qū)⒕渫磕ㄓ谠嚰埳辖Y(jié)果判讀10-30秒內(nèi)變紫色為陽(yáng)性不變色為陰性細(xì)菌的鑒定方法分子生物學(xué)鑒定PCR、16SrRNA測(cè)序、基因芯片2蛋白質(zhì)分析鑒定質(zhì)譜分析、血清學(xué)方法3生化特性鑒定API系統(tǒng)、自動(dòng)化生化分析儀形態(tài)學(xué)鑒定顯微形態(tài)、染色特性、菌落特征抗生素敏感性試驗(yàn)：紙片擴(kuò)散法準(zhǔn)備培養(yǎng)基Mueller-Hinton瓊脂平板接種細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)濃度菌懸液均勻涂布放置抗生素紙片等距離放置含抗生素的紙片測(cè)量抑菌環(huán)培養(yǎng)后測(cè)量透明抑制圈直徑抗生素敏感性試驗(yàn)：最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定肉湯稀釋法系列稀釋抗生素于肉湯中瓊脂稀釋法抗生素與瓊脂混合制備梯度平板E-test法梯度濃度抗生素條帶直接讀取MIC值水質(zhì)微生物檢測(cè)樣品采集無(wú)菌容器，規(guī)范采樣膜過(guò)濾0.45μm濾膜過(guò)濾水樣培養(yǎng)檢測(cè)選擇性培養(yǎng)基檢測(cè)指示菌3計(jì)數(shù)分析菌落計(jì)數(shù)或MPN法定量空氣微生物檢測(cè)沉降平板法打開(kāi)培養(yǎng)皿暴露特定時(shí)間撞擊式采樣使用空氣采樣器收集微生物過(guò)濾采樣法抽濾空氣通過(guò)濾膜捕獲微生物培養(yǎng)計(jì)數(shù)適溫培養(yǎng)后計(jì)數(shù)分析土壤微生物檢測(cè)采樣無(wú)菌工具采集不同深度土樣處理土樣混勻，去除雜質(zhì)3懸浮稀釋土壤懸浮液系列稀釋分離培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)不同類(lèi)群鑒定分析形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定食品微生物檢測(cè)檢測(cè)對(duì)象病原菌：沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌指示菌：大腸菌群、菌落總數(shù)腐敗菌：假單胞菌、乳酸菌檢測(cè)方法傳統(tǒng)培養(yǎng)法：選擇性培養(yǎng)基分離快速檢測(cè)法：ATP生物發(fā)光法分子生物學(xué)方法：PCR、DNA雜交質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)規(guī)范操作陽(yáng)性和陰性對(duì)照確保結(jié)果準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)驗(yàn)證檢測(cè)能力PCR技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用DNA提取從樣品中提取微生物DNA引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)特異性引物靶向目標(biāo)區(qū)域PCR擴(kuò)增變性、退火、延伸30-40個(gè)循環(huán)電泳檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果分析根據(jù)特異性條帶判斷檢測(cè)結(jié)果酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）直接法間接法夾心法競(jìng)爭(zhēng)法原理：抗原抗體特異性反應(yīng)，酶標(biāo)記檢測(cè)應(yīng)用：病原微生物、毒素和抗體的檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)：高靈敏度、高特異性、操作簡(jiǎn)便微生物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：乳酸菌發(fā)酵菌種活化活化乳酸菌種子培養(yǎng)基制備含乳糖或葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基接種培養(yǎng)適宜接種量,37℃恒溫酸度監(jiān)測(cè)定期測(cè)量pH值變化產(chǎn)物分析檢測(cè)乳酸含量和活菌數(shù)微生物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：酵母發(fā)酵30°C最適溫度酵母發(fā)酵最佳溫度5.0最適pH略酸性環(huán)境有利發(fā)酵10%糖濃度初始糖濃度通常為8-12%48h發(fā)酵時(shí)間完全發(fā)酵所需時(shí)間生物反應(yīng)器的使用反應(yīng)器結(jié)構(gòu)發(fā)酵罐、攪拌裝置、控制系統(tǒng)參數(shù)監(jiān)控溫度、pH、溶氧、攪拌速度無(wú)菌操作嚴(yán)格滅菌和無(wú)菌接種采樣分析定期