3.2基因工程的基本操作程序第1課時(shí)課件-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第三章第2節(jié)基因工程的基本操作程序復(fù)習(xí)回顧限制酶DNA連接酶載體基因工程的基本工具磷酸二酯鍵特點(diǎn)：作用部位：具有專一性結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作為載體的條件種類：①有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；②有特殊的標(biāo)記基因；③能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上。質(zhì)粒、病毒任務(wù)一：說(shuō)出基因工程的操作水平、操作對(duì)象。操作水平：分子水平操作對(duì)象：

基因（DNA）結(jié)合轉(zhuǎn)基因抗蟲棉案例回答以下問(wèn)題：（1）轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因是：（2）轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的受體細(xì)胞是：抗蟲基因—蘇云金桿菌的Bt基因棉花植株細(xì)胞1.目的基因：用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。（P76第2段）主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因。第2節(jié)

基因工程的基本操作程序結(jié)合轉(zhuǎn)基因抗蟲棉案例回答以下問(wèn)題：（3）結(jié)合轉(zhuǎn)基因抗蟲棉案例概括“基因工程的操作程序”：抗蟲棉

（有抗蟲特性）

普通棉花（無(wú)抗蟲特性）棉花細(xì)胞導(dǎo)入與載體(質(zhì)粒)拼接重組DNA分子一、目的基因的篩選與獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測(cè)與鑒定獲得抗蟲基因Bt基因（核心）第2節(jié)

基因工程的基本操作程序二2、目的基因的篩選：

思考1：自然界中抗蟲基因種類多如：Bt基因、蛋白酶抑制基因、凝集素基因等，如何選擇合適的基因？（1）從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選掌握了Bt基因的序列信息用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑，廣泛用于防治棉花蟲害已有多年歷史。Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物--Bt抗蟲蛋白破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)。(P77相關(guān)信息欄）蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因第一步、目的基因的篩選與獲取DNA測(cè)序儀

明確了目的基因后，該怎么獲得它?序列數(shù)據(jù)庫(kù)（如GenBank）核苷酸序列比對(duì)氨基酸序列比對(duì)序列比對(duì)工具（如BLAST）(2)認(rèn)識(shí)基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法：2、目的基因的篩選：二測(cè)序技術(shù)測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)序列第一步、目的基因的篩選與獲取(1).通過(guò)化學(xué)方法直接人工合成目的基因獲取目的基因的方法DNA合成儀要求：①基因比較小

②核苷酸序列已知的基因(2).通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)獲取目的基因基因文庫(kù)種類：①基因組文庫(kù)（包含一種生物的所有基因）

②部分基因文庫(kù)（只包含一種生物的部分基因，如cDNA文庫(kù)）第一步、目的基因的篩選與獲取拓展：基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程某生物體全部DNA許多DNA片段受體菌群體限制酶與載體連接、導(dǎo)入受體菌群體cDNA某生物體發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA逆轉(zhuǎn)錄與載體連接、導(dǎo)入基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)第一步、目的基因的篩選與獲取PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（3）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3、目的基因的獲取PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。二第一步、目的基因的篩選與獲取【重溫】DNA體內(nèi)復(fù)制的過(guò)程及條件合成子鏈解旋形成新DNA條件在DNA復(fù)制中的作用DNA模板鏈4種脫氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶引物提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開(kāi)DNA雙鏈催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸任務(wù)二：說(shuō)出“DNA體內(nèi)復(fù)制”需要滿足的條件:二任務(wù)三：思考與探究—引物：1.為什么需要設(shè)計(jì)引物？引物設(shè)計(jì)時(shí)是否需要知道整個(gè)目的基因的堿基序列？2.要保證DNA的兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增，至少現(xiàn)需要幾種引物？3.由于DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，新鏈合成的方向?’端向3’端延伸，引物的結(jié)合位置是（）3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2①④③②②③DNA聚合酶不能從頭合成DNA，只能從引物的3′端開(kāi)始延伸DNA鏈2種用于PCR的引物通常長(zhǎng)度為20~30個(gè)核苷酸的DNA單鏈。體內(nèi)的DNA復(fù)制通常以RNA單鏈為引物。P77“相關(guān)信息欄”第一步、目的基因的篩選與獲取只需要知道目的基因兩側(cè)的核苷酸序列即可任務(wù)三：思考與探究：4.請(qǐng)你為Bt基因設(shè)計(jì)合適的引物。Bt基因CT???GGT-5’引物1引物25'-TCC???AA①②①②二第一步、目的基因的篩選與獲取小結(jié)：1.結(jié)合體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，思考PCR的進(jìn)行需要哪些條件？體內(nèi)DNA復(fù)制在DNA復(fù)制中的作用PCR中參與的組分和條件打開(kāi)DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸4種脫氧核苷酸引物（通常為小的單鏈RNA）DNA（目的基因）模板4種脫氧核苷酸(dNTP)引物（通常為小的單鏈DNA）反應(yīng)還需要其它條件，如能量、緩沖液（一般添加Mg2+）、和控溫設(shè)備DNA聚合酶DNA模板鏈解旋酶二用高溫代替（90℃變性）耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）第一步、目的基因的篩選與獲取利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因：過(guò)程模板DNA變性

復(fù)性延伸

方法：利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因5’5’3’3’95℃3.目的基因的獲取【任務(wù)一】2.閱讀課本77頁(yè)第4-6段和表3-1及第二個(gè)相關(guān)信息，閱讀78和79頁(yè)，明確目的基因獲取的方法，并對(duì)這種方法的概念、條件和過(guò)程進(jìn)行詳細(xì)分析第一步、目的基因的篩選與獲取過(guò)程95℃變性：加熱至超過(guò)90℃，雙鏈DNA間的氫鍵斷裂，解旋為單鏈?！肞CR獲取和擴(kuò)增目的基因5’3’5’3’使用耐高溫的Taq酶保證高溫條件下仍具有活性。一、目的基因的篩選與獲取3.目的基因的獲取變性

復(fù)性延伸

第一步、目的基因的篩選與獲取50℃引物1引物2DNA引物復(fù)性：冷卻至50℃左右，兩條引物與單鏈DNA結(jié)合過(guò)程5’3’5’3’引物結(jié)合在模板DNA鏈的3’端，新合成的子鏈方向?yàn)?’到3’。3.目的基因的獲取—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因一、目的基因的篩選與獲取變性

復(fù)性延伸

第一步、目的基因的篩選與獲取過(guò)程引物1引物272℃Taq酶Taq酶3.延伸：加熱至72℃左右，以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈。5’3’5’3’3’5’5’3’—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3.目的基因的獲取一、目的基因的篩選與獲取變性

復(fù)性延伸

第一步、目的基因的篩選與獲取第1輪結(jié)束第2輪開(kāi)始第一輪結(jié)束：此時(shí)目的基因的量是原始的2倍。過(guò)程5’3’5’3’3’5’3’5’—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3.目的基因的獲取一、目的基因的篩選與獲取變性

復(fù)性延伸第一步、目的基因的篩選與獲取過(guò)程95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3.目的基因的獲取一、目的基因的篩選與獲取變性

復(fù)性延伸

第一步、目的基因的篩選與獲取過(guò)程95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3.目的基因的獲取一、目的基因的篩選與獲取變性

復(fù)性延伸

第一步、目的基因的篩選與獲取第2輪結(jié)束第二輪結(jié)束：此時(shí)目的基因的量是原始的22倍。過(guò)程—利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3.目的基因的獲取一、目的基因的篩選與獲取變性

復(fù)性延伸

第一步、目的基因的篩選與獲取TaqDNA聚合酶引物1原料模板DNA目的基因3＇5＇5＇3＇引物2955072℃PCR過(guò)程(三輪擴(kuò)增)第一步、目的基因的篩選與獲取955072℃3＇5＇5＇3＇第一輪:高溫變性第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第一輪:低溫復(fù)性第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第一輪:中溫延伸第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第二輪:高溫變性第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第二輪:低溫復(fù)性第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第二輪:中溫延伸第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第三輪:高溫變性第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第三輪:低溫復(fù)性第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第三輪:中溫延伸第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第三輪:中溫延伸第一步、目的基因的篩選與獲取獲取了足夠量的目的基因后，能直接把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞嗎？就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無(wú)法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)直接被分解不能原因那怎樣才能讓基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代呢？閱讀教材P80，思考以下問(wèn)題：1.基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的？載體還需要哪些結(jié)構(gòu)？各個(gè)元件有什么作用？2.用文字和箭頭表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程。3.目的基因插入什么位置？目的基因插入位點(diǎn)是隨意的嗎？4.使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，是否只會(huì)得到一種重組DNA？如果不能，怎么改進(jìn)？基因工程的核心第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.目的：2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因：能控制表達(dá)所需要的特殊性狀啟動(dòng)子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。復(fù)制原點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)終止子：位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：便于重組DNA分子的篩選和鑒定。（啟動(dòng)子=起始密碼?）第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)位置功能DNA片段DNA片段mRNA上三個(gè)相鄰的堿基mRNA上三個(gè)相鄰的堿基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)翻譯的起始信號(hào)（編碼氨基酸）翻譯的結(jié)束信號(hào)（不編碼氨基酸）目的基因應(yīng)該插入什么位置？目的基因插入位點(diǎn)不是隨意的：基因表達(dá)載體需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入

，若目的基因插入啟動(dòng)子部位，啟動(dòng)子將失去原功能。第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建啟動(dòng)子和終止子之間的部位誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)物作用激活或抑制目的基因表達(dá)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：載體≠表達(dá)載體。都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)，表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子。第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.構(gòu)建的過(guò)程質(zhì)粒限制酶限制酶切割位點(diǎn)首先，用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口；01第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建限制酶限制酶切割位點(diǎn)獲取目的基因目的基因然后用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段023.構(gòu)建的過(guò)程第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.構(gòu)建的過(guò)程DNA連接酶重組DNA分子獲取目的基因質(zhì)粒利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，這樣就形成了一個(gè)重組DNA分子。03目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.構(gòu)建的過(guò)程質(zhì)粒限制酶限制酶DNA連接酶同種限制酶或產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶切割重組DNA分子限制酶切割位點(diǎn)目的基因限制酶切割位點(diǎn)獲取目的基因使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，會(huì)得到幾種重組DNA？有何缺點(diǎn)？怎么改進(jìn)？第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割（單酶切），是否只會(huì)得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接111111111111選擇兩種不同的限制酶同時(shí)對(duì)目的基因和質(zhì)粒切割（雙酶切），防止目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接。第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建①不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。②保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。若載體上有兩個(gè)及以上的標(biāo)記基因，則可合理對(duì)其中一些標(biāo)記基因進(jìn)行酶切破壞，從而達(dá)到比1個(gè)標(biāo)記基因更高的篩選成功率，防止只有1個(gè)標(biāo)記基因時(shí)出現(xiàn)的“假陽(yáng)性”(即未成功導(dǎo)入目的基因的載體也能正常表達(dá)標(biāo)記基因，造成無(wú)效篩選)。限制酶的選擇原則第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建限制酶的選擇原則(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來(lái)源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當(dāng)不適合選擇某種限制酶時(shí)，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端。③善用“雙酶切”，注意方向性：其優(yōu)點(diǎn)和作用是：①防止目的基因環(huán)化；

②避免目的基因與載體反向連接，即DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動(dòng)子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動(dòng)方向”)必須是相同的，否則目的基因?qū)牒鬅o(wú)法正常轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。即時(shí)練習(xí)1.請(qǐng)結(jié)合下圖，回答問(wèn)題：（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能因?yàn)镾maⅠ切割會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。質(zhì)粒上的抗性基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無(wú)法進(jìn)一步篩選。即時(shí)練習(xí)（2）只使用EcoRⅠ分別切割質(zhì)粒和外源DNA，能否構(gòu)建基因表達(dá)載體？如果能有何弊端？能①質(zhì)粒、目的基因發(fā)生自身環(huán)化；②質(zhì)粒與目的基因會(huì)發(fā)生反向連接。1.請(qǐng)結(jié)合下圖，回答問(wèn)題：即時(shí)練習(xí)1.請(qǐng)結(jié)合下圖，回答問(wèn)題：（3）與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)是什么？①可以防止質(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接；②還可以防止目的基因與載體的反向連接。即時(shí)練習(xí)1.圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述不正確的是A.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用PstⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNAB.在酶切過(guò)程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因C.若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，無(wú)法避免自身環(huán)化和反向連接D.導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)√2.(2023·新課標(biāo)，6)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是（）

A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接

B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接

C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接

D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接質(zhì)粒用酶3切割后得到的是平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接。C酶3切割后得到的是平末端，常用T4DNA連接酶連接。質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此方案最合理且高效。若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達(dá)載體缺少標(biāo)記基因，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的篩選。即時(shí)練習(xí)3.(2023·湖北，4改編)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是（

）

A.若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同

B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因

C.若用ScaⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Tet(四環(huán)素)的培養(yǎng)基中能形成菌落

D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落D若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同。若用PvuⅠ酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因。SphⅠ的酶切位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因(TetR)中，若用SphⅠ酶切，重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落。若用ScaⅠ酶切，重組質(zhì)粒中不含氨芐青霉素抗性基因（Amp），但含有四環(huán)素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環(huán)素)的培養(yǎng)基中能形成菌落。即時(shí)練習(xí)目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)__________和_____的過(guò)程受體細(xì)胞維持穩(wěn)定表達(dá)（二）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法Ca2+轉(zhuǎn)化法（我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）（一）轉(zhuǎn)化的概念（常用）（單子葉植物常用）第三步、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞【任務(wù)三】1.閱讀課本80頁(yè)第4段和81頁(yè)，明確轉(zhuǎn)化的概念是什么？將目的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的方法有哪些？1.操作方法②在植物授粉后一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液(含目的基因）滴在花柱切面，使目的基因通過(guò)花粉管通道進(jìn)入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。2.實(shí)例我國(guó)“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉”3.優(yōu)缺點(diǎn)簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)（優(yōu)點(diǎn)）要求花朵較大（缺點(diǎn)）花粉管通道法【任務(wù)三】2.試分析花粉管通道法的操作方法、實(shí)例和優(yōu)缺點(diǎn)；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)、轉(zhuǎn)化原理和轉(zhuǎn)化過(guò)程以及顯微注射法和Ca2+轉(zhuǎn)化法的原理第三步、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

能在自然條件下感染_______植物和_______植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物______________。隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種__________植物也取得了成功。雙子葉裸子沒(méi)有感染能力單子葉2.轉(zhuǎn)化原理農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有________，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞時(shí)，Ti質(zhì)粒的_______可轉(zhuǎn)移至被侵染的細(xì)胞，并整合到該細(xì)胞的_____________。Ti質(zhì)粒T-DNA染色體DNA上[思考]構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因該插到Ti質(zhì)粒哪里？T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞【任務(wù)三】2.試分析花粉管通道法的操作方法、實(shí)例和優(yōu)缺點(diǎn)；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)、轉(zhuǎn)化原理和轉(zhuǎn)化過(guò)程以及顯微注射法和Ca2+轉(zhuǎn)化法的原理。1.農(nóng)桿菌的特點(diǎn)：3.轉(zhuǎn)化過(guò)程農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入①兩次拼接第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上。第二次拼接(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上。②兩次導(dǎo)入第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌。第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞第三步、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將含目的基因的表達(dá)載體提純科學(xué)家用病毒DNA與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動(dòng)物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi)，如腺病毒載體等?！狙a(bǔ)充】病毒侵染法受精卵顯微注射含目的基因的受精卵具有新性狀的動(dòng)物雌性動(dòng)物輸卵管或子宮胚胎移植早期胚胎顯微注射法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞【任務(wù)三】2.試分析花粉管通道法的操作方法、實(shí)例和優(yōu)缺點(diǎn)；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)、轉(zhuǎn)化原理和轉(zhuǎn)化過(guò)程以及顯微注射法和Ca2+轉(zhuǎn)化法的原理。Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞

感受態(tài)細(xì)胞

細(xì)胞吸收DNA分子基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合使細(xì)胞處于一種能夠吸收周圍環(huán)境中的DNA分子的生理狀態(tài)?！咀⒁狻吭松镒鳛槭荏w細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒(méi)有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。（因?yàn)闆](méi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)一步加工。）Ca2+轉(zhuǎn)化法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞【任務(wù)三】2.試分析花粉管通道法的操作方法、實(shí)例和優(yōu)缺點(diǎn)；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的特點(diǎn)、轉(zhuǎn)化原理和轉(zhuǎn)化過(guò)程以及顯微注射法和Ca2+轉(zhuǎn)化法的原理?！拘〗Y(jié)】將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞核心方法比較種類項(xiàng)目植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法

受體細(xì)胞

轉(zhuǎn)化過(guò)程農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2＋處理法體細(xì)胞或受精卵受精卵原核細(xì)胞目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA中→表達(dá)目的基因表達(dá)載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2＋處理細(xì)胞→能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)細(xì)胞→重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中第三步、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞Bt基因mRNABt抗蟲蛋白害蟲死亡抗蟲棉只有一部分Bt基因能成功導(dǎo)入棉花細(xì)胞并表達(dá)Bt抗蟲蛋白,這需要檢測(cè)和鑒定才能知道,如何進(jìn)行檢測(cè)和鑒定呢?請(qǐng)你回顧基因表達(dá)的過(guò)程,推測(cè)可以從哪些方面進(jìn)行檢測(cè)與鑒定。培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的最終目的就是要賦予棉花抗蟲特性,怎樣檢測(cè)棉花是否具有抗蟲特性呢?思考討論閱讀課本P82，思考如下問(wèn)題：四、目的基因的檢測(cè)與鑒定(1)檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入如：檢測(cè)棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因——通過(guò)PCR等技術(shù)檢測(cè)提取DNAPCR操作是否擴(kuò)增出目的基因M：marker；1-陽(yáng)性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)Bt品系；電泳操作1.分子水平的檢測(cè)害蟲死亡抗蟲棉PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(2)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄如：檢測(cè)Bt基因是否翻譯出mRNA——通過(guò)PCR等技術(shù)檢測(cè)BtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010個(gè)PCR陽(yáng)性棉花植株中，有四株Bt基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄1.分子水平的檢測(cè)提取mRNAPCR操作是否擴(kuò)增出目的基因?qū)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)害蟲死亡抗蟲棉逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA(3)檢測(cè)目的基因是否翻譯如：檢測(cè)Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白——通過(guò)抗原-抗體雜交檢測(cè)蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交1.分子水平的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實(shí)驗(yàn)）害蟲死亡病毒（菌）接種實(shí)驗(yàn)未染病鹽水澆灌正常生長(zhǎng)噴灑除草劑正常生長(zhǎng)提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正?？剐澡b定、活性鑒定等2.個(gè)體水平的鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定歸納類型檢測(cè)內(nèi)容方法分子水平的檢測(cè)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個(gè)體是否具有相應(yīng)性狀抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等1.實(shí)驗(yàn)原理（1）利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理①PCR利用了DNA的_________原理，通過(guò)_________來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠______________的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷____次循環(huán)；熱變性調(diào)節(jié)溫度自動(dòng)調(diào)控溫度30②PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了_____________的原理。DNA半保留復(fù)制DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理（2）DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在_____的作用下，這些_______________會(huì)向著__________________的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是________。可解離的基團(tuán)pH電場(chǎng)帶電分子電泳與它所帶電荷相反②PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)____________________來(lái)鑒定。③在凝膠中DNA分子的遷移速率與_________________、________________和_____等有關(guān)④凝膠中的DNA分子通過(guò)_____，可以在波長(zhǎng)為_(kāi)_______的________下被檢測(cè)出來(lái)。瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構(gòu)象DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定2.材料用具①PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定PCR儀微量離心管微量移液器電泳裝置推動(dòng)桿調(diào)節(jié)旋鈕卸槍頭按鈕體積刻度吸液桿槍頭（注意：加不同樣品時(shí)，需要更換槍頭）DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定2.材料用具10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑧PCR反應(yīng)體系的配方⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無(wú)菌水。⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等注意：酶和緩沖液要在冰塊上緩慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和緩沖液一般分裝成小份，避免反復(fù)融化導(dǎo)致活性降低甚至失活。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定3.PCR實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。3.方法步驟（1）DNA片段的擴(kuò)增①移液：用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說(shuō)明書，在微量離心管中依次加入各組分②離心：待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）③反應(yīng)：參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。預(yù)變性：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定可根據(jù)目的片段長(zhǎng)度適當(dāng)調(diào)整延伸時(shí)間循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min（2）DNA片段的電泳鑒定①配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在