《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》課件

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)歡迎各位同學(xué)參加分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課程。本課程旨在幫助大家掌握現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中的核心實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法，從基礎(chǔ)理論到實(shí)踐操作，全面提升實(shí)驗(yàn)技能。在接下來的課程中，我們將系統(tǒng)學(xué)習(xí)核酸提取、PCR技術(shù)、基因克隆、蛋白質(zhì)分析等實(shí)驗(yàn)方法，并探討最新的基因編輯和組學(xué)分析技術(shù)。課程注重理論與實(shí)踐結(jié)合，助力大家在未來的科研道路上打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。分子生物學(xué)基礎(chǔ)概念核酸結(jié)構(gòu)與功能核酸是生命的信息分子，包括DNA（脫氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）。DNA主要存在于細(xì)胞核中，是遺傳信息的載體。RNA則參與蛋白質(zhì)的合成過程，在信息傳遞中起關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)由氨基酸通過肽鍵連接而成，是細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能分子。蛋白質(zhì)參與生物體幾乎所有的生理活動，包括催化反應(yīng)、信號傳導(dǎo)、運(yùn)輸和免疫防御等。遺傳信息傳遞生物體通過中心法則進(jìn)行遺傳信息傳遞：DNA復(fù)制保證遺傳信息的穩(wěn)定傳遞；轉(zhuǎn)錄將DNA信息傳遞給RNA；翻譯則將RNA信息轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)序列。DNA的結(jié)構(gòu)與特性雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA由兩條多核苷酸鏈以反平行方式纏繞形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，外側(cè)的磷酸糖骨架支撐著內(nèi)側(cè)的堿基對。堿基配對原則腺嘌呤（A）與胸腺嘧啶（T）通過兩個氫鍵配對，鳥嘌呤（G）與胞嘧啶（C）通過三個氫鍵配對?；瘜W(xué)鍵作用DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性主要依賴氫鍵、疏水相互作用、π-π堆積作用以及磷酸骨架上的磷酸二酯鍵。RNA的結(jié)構(gòu)與種類信使RNA（mRNA）攜帶編碼蛋白質(zhì)的遺傳信息，從DNA轉(zhuǎn)錄而來，作為蛋白質(zhì)合成的模板。含有5'帽子結(jié)構(gòu)、編碼區(qū)（ORF）和3'多聚A尾巴，這些結(jié)構(gòu)對mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率至關(guān)重要。轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）負(fù)責(zé)將氨基酸運(yùn)送到核糖體，參與蛋白質(zhì)合成。具有特殊的三葉草結(jié)構(gòu)，一端能識別mRNA上的密碼子，另一端連接特定氨基酸。核糖體RNA（rRNA）構(gòu)成核糖體的主要成分，提供蛋白質(zhì)合成的結(jié)構(gòu)骨架和催化活性。在真核生物中主要有28S、18S、5.8S和5S四種rRNA。非編碼RNA包括microRNA、lncRNA等，不編碼蛋白質(zhì)但參與基因表達(dá)調(diào)控、染色質(zhì)修飾等重要生物學(xué)過程。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)中氨基酸的線性排列順序，由肽鍵連接形成多肽鏈。一級結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)和后續(xù)折疊方式。二級結(jié)構(gòu)由于氫鍵作用，多肽鏈局部形成的規(guī)則結(jié)構(gòu)，主要包括α螺旋和β折疊。這些局部結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)提供了初步的穩(wěn)定性和形狀。三級結(jié)構(gòu)整個多肽鏈在空間的三維折疊形態(tài)，由疏水相互作用、離子鍵、氫鍵和二硫鍵等維持。三級結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的功能特性。四級結(jié)構(gòu)多個蛋白質(zhì)亞基通過非共價鍵相互作用形成的復(fù)合物。血紅蛋白就是典型的四級結(jié)構(gòu)蛋白，由四個亞基組成。核酸的分離與純化意義實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)步驟高質(zhì)量的核酸提取是幾乎所有分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的第一步，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠的起始材料。提取質(zhì)量直接影響克隆、PCR、測序等下游應(yīng)用的成功率。診斷與分析依據(jù)在臨床應(yīng)用中，核酸提取純度決定了疾病診斷的準(zhǔn)確性。在法醫(yī)鑒定和親子鑒定領(lǐng)域，樣品制備的質(zhì)量尤為關(guān)鍵，直接影響鑒定結(jié)果的可靠性。純度要求不同實(shí)驗(yàn)對核酸純度要求各異?；蚪M測序要求DNA完整性高；RNA實(shí)驗(yàn)則需嚴(yán)格控制RNase污染；而蛋白質(zhì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)則需確保核酸不被蛋白質(zhì)污染。DNA提取的基本原理細(xì)胞裂解使用物理方法（如研磨、超聲波處理）或化學(xué)試劑（如SDS、蛋白酶K）破壞細(xì)胞膜和核膜，釋放DNA。裂解緩沖液通常含有EDTA，可以螯合金屬離子，抑制DNA酶活性。蛋白質(zhì)去除使用蛋白酶K消化蛋白質(zhì)，之后可用酚氯仿等有機(jī)溶劑將變性蛋白質(zhì)與DNA分離。在液液分離過程中，DNA留在水相，而蛋白質(zhì)則沉淀在有機(jī)相與水相的界面。DNA沉淀與收集使用乙醇或異丙醇沉淀DNA，通常在低溫環(huán)境下進(jìn)行。離心收集DNA沉淀，洗滌去除殘留的鹽后，用適當(dāng)?shù)木彌_液（如TE緩沖液）溶解DNA。實(shí)驗(yàn)：酚/氯仿法提取DNA樣品準(zhǔn)備將組織或細(xì)胞懸浮于裂解緩沖液中，加入蛋白酶K，37℃孵育過夜，徹底裂解細(xì)胞并消化蛋白質(zhì)酚抽提加入等體積酚，混勻，離心，小心吸取上層水相轉(zhuǎn)入新管氯仿/異戊醇抽提加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），混勻，離心，吸取上層水相DNA沉淀加入1/10體積3M醋酸鈉和2倍體積冰乙醇，混勻，-20℃沉淀2小時以上洗滌與溶解離心收集DNA沉淀，70%乙醇洗滌，干燥后TE緩沖液溶解實(shí)驗(yàn)：試劑盒法提取DNA柱式純化原理商用試劑盒多基于硅膠膜吸附原理，在高濃度鹽環(huán)境下，DNA選擇性吸附在硅膠膜上，蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)則通過洗滌被去除。最后，低鹽或去離子水洗脫DNA。整個流程通常包括裂解細(xì)胞、結(jié)合DNA到硅膠膜、洗滌和洗脫四個步驟，操作簡便，可批量處理樣品，大大提高實(shí)驗(yàn)效率。優(yōu)缺點(diǎn)對比優(yōu)點(diǎn)：操作簡單快速，污染少，重復(fù)性好缺點(diǎn)：成本較高，大樣品量時不經(jīng)濟(jì)適用場景：需要快速獲得中等純度DNA的常規(guī)實(shí)驗(yàn)RNA提取與降解防護(hù)RNase危害RNA酶普遍存在于環(huán)境和人體中，極其穩(wěn)定且活性強(qiáng)防護(hù)措施無RNase手套、DEPC處理水和器皿、專用試劑與器材提取技術(shù)TRIzol試劑、RNA專用提取試劑盒，低溫操作質(zhì)量評估凝膠電泳檢查28S/18S比例、分光光度計(jì)測純度蛋白質(zhì)純化技術(shù)親和純化利用目標(biāo)蛋白與特定配體的特異性結(jié)合離子交換色譜基于蛋白質(zhì)表面電荷差異分子排阻色譜根據(jù)分子大小分離鹽析利用蛋白質(zhì)在鹽溶液中溶解度差異蛋白質(zhì)純化是分離特定蛋白質(zhì)的過程，通常需要結(jié)合多種技術(shù)。鹽析是初步分離步驟，利用硫酸銨等鹽類使不同蛋白在不同鹽濃度下沉淀。色譜技術(shù)能進(jìn)一步提高純度，其中親和色譜特異性最高，常用于標(biāo)簽蛋白純化，如His標(biāo)簽蛋白可用鎳柱純化。核酸定量與鑒定260nmDNA最大吸收DNA在260nm波長處有最大紫外吸收280nm蛋白吸收峰蛋白質(zhì)在280nm處有特征吸收1.8DNA純度比值純DNA的A260/A280比值約為1.82.0RNA純度比值純RNA的A260/A280比值約為2.0核酸定量方法主要包括紫外分光光度法和熒光染料法。紫外分光光度法基于核酸堿基在260nm波長處的紫外吸收，簡便快捷但不能區(qū)分DNA和RNA。熒光染料法（如PicoGreen）特異性更高，靈敏度可達(dá)紫外法的100倍，適合微量樣品定量。凝膠電泳則提供核酸完整性和大小信息，是質(zhì)量評估的重要手段。電泳技術(shù)基礎(chǔ)電泳原理電泳技術(shù)利用帶電分子在電場中遷移的原理分離分子。核酸因磷酸骨架帶負(fù)電，在電場中向正極遷移，遷移速率與分子量成反比。凝膠基質(zhì)選擇瓊脂糖凝膠適合分離較大DNA片段（100bp-25kb），聚丙烯酰胺凝膠適合小片段DNA（5-500bp）或RNA及蛋白質(zhì)。檢測方法常用染料包括溴化乙錠（EtBr）、SYBRGreen和銀染色。EtBr插入DNA雙鏈間，在紫外光下發(fā)橙紅色熒光，但有致癌風(fēng)險(xiǎn)。瓊脂糖凝膠電泳凝膠制備根據(jù)目標(biāo)片段大小選擇瓊脂糖濃度（0.3%-2%）樣品上樣加載緩沖液混合樣品，注入凝膠孔電泳分離60-120V電壓，30-90分鐘染色成像溴化乙錠染色，UV光下觀察拍照瓊脂糖凝膠電泳是分離DNA最常用的方法。凝膠濃度直接影響分離分辨率：低濃度（0.3-0.5%）適合分離大片段（5-60kb），高濃度（1.5-2%）適合小片段（0.2-3kb）。電泳緩沖液通常使用TAE或TBE，兩者各有優(yōu)勢：TAE更適合大片段分離和DNA回收，TBE適合小片段高分辨率分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）具有極高的分辨率，能分辨相差一個核苷酸或一個氨基酸的分子。常用于小片段DNA（如測序、微衛(wèi)星分析）、RNA和蛋白質(zhì)分離。PAGE由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑雙丙烯酰胺聚合而成，凝膠濃度通常為4-20%，濃度越高分辨率越高。PAGE又分變性和非變性兩種：變性PAGE加入尿素或SDS，使分子完全變性，僅按大小分離；非變性PAGE保留分子自然構(gòu)象，分離受分子構(gòu)象影響。SDS是蛋白質(zhì)電泳最常用方法，能按分子量分離蛋白質(zhì)。分子量標(biāo)準(zhǔn)品與MarkerDNALadderDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品含已知大小片段，常見規(guī)格有100bpladder和1kbladder。在凝膠上產(chǎn)生"階梯"狀條帶，可用于確定樣品DNA大小。精確定量marker還可用于樣品濃度估算。蛋白質(zhì)Marker蛋白質(zhì)marker含多種預(yù)染色或未染色的已知分子量蛋白。預(yù)染marker可直接觀察電泳進(jìn)程，常見規(guī)格有低分子量（10-100kDa）和寬范圍（10-250kDa）兩種。RNA標(biāo)準(zhǔn)品RNA標(biāo)準(zhǔn)品通常使用體外轉(zhuǎn)錄的已知大小RNA或商業(yè)化RNAladder。使用時需在變性條件下，防止RNA二級結(jié)構(gòu)影響泳動。PCR技術(shù)原理變性（94-98℃）高溫使DNA雙鏈分離成單鏈，通常需30秒左右退火（50-65℃）引物與模板DNA互補(bǔ)結(jié)合，溫度取決于引物特性3延伸（72℃）DNA聚合酶從3'端合成新鏈，速率約1kb/分鐘聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是體外擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)，由KaryMullis發(fā)明，可在幾小時內(nèi)將極少量DNA擴(kuò)增數(shù)十億倍。PCR依賴耐熱DNA聚合酶（如Taq聚合酶）在高溫條件下工作，典型PCR反應(yīng)需要模板DNA、引物對、dNTPs、聚合酶和緩沖液等組分。PCR儀操作要點(diǎn)溫度參數(shù)優(yōu)化退火溫度是PCR成功的關(guān)鍵，通常設(shè)置為引物Tm值低5℃左右。對于新引物，可設(shè)置梯度PCR找到最佳溫度。延伸時間應(yīng)根據(jù)擴(kuò)增片段長度調(diào)整，一般按1kb/min計(jì)算。防污染措施PCR靈敏度高，極易被微量DNA污染。應(yīng)使用專用移液器和無菌吸頭，設(shè)立獨(dú)立的PCR準(zhǔn)備區(qū)，穿戴手套，使用UV輻照消毒工作臺，并設(shè)置陰性對照。反應(yīng)體系配置標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體積為25-50μL，包含1X緩沖液、1.5-3mMMgCl?、0.2mMdNTPs、0.2-1μM引物、1-5UTaq酶和適量模板DNA。常見PCR類型普通PCR基礎(chǔ)PCR技術(shù)，用于特定DNA片段擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)流程包括30-40個循環(huán)的變性-退火-延伸，最后72℃延伸5-10分鐘確保所有產(chǎn)物完全延伸。常用于克隆、基因檢測和基因組分析。巢式PCR兩輪PCR反應(yīng)，第二輪使用第一輪產(chǎn)物作為模板，內(nèi)部引物擴(kuò)增內(nèi)部片段。大大提高特異性和靈敏度，適用于微量樣品，但污染風(fēng)險(xiǎn)增加。多重PCR單管中使用多對引物同時擴(kuò)增多個目標(biāo)序列。設(shè)計(jì)要點(diǎn)是引物間無交叉反應(yīng)，產(chǎn)物大小可區(qū)分。廣泛用于病原體檢測和基因分型。實(shí)時定量PCR邊擴(kuò)增邊監(jiān)測產(chǎn)物生成，通過熒光信號實(shí)時檢測DNA積累。分為探針法（如TaqMan）和染料法（如SYBRGreen）。用于基因表達(dá)分析和病原體定量。PCR產(chǎn)物分析凝膠電泳檢測最常用的PCR產(chǎn)物檢驗(yàn)方法，可確認(rèn)產(chǎn)物大小和特異性。根據(jù)片段大小選擇合適濃度的瓊脂糖凝膠（通常1-2%），電泳后染色觀察。產(chǎn)物純化去除引物、dNTPs和酶等雜質(zhì)，為下游應(yīng)用如克隆和測序做準(zhǔn)備。常用方法包括膠回收、柱純化和酶處理（如ExoSAP-IT）。測序驗(yàn)證最終確認(rèn)PCR產(chǎn)物身份和準(zhǔn)確性的金標(biāo)準(zhǔn)?？芍苯訙y序PCR產(chǎn)物或克隆后測序，發(fā)現(xiàn)和區(qū)分SNPs、突變和多態(tài)性。實(shí)驗(yàn)：反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）RNA提取從組織或細(xì)胞中提取總RNA，確保無DNA污染反轉(zhuǎn)錄利用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)換為cDNAPCR擴(kuò)增使用基因特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)基因產(chǎn)物分析凝膠電泳檢測表達(dá)情況反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是研究基因表達(dá)的重要技術(shù)，能將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA進(jìn)行分析。反轉(zhuǎn)錄使用RNA依賴的DNA聚合酶（如MMLV或AMV反轉(zhuǎn)錄酶），引物可選擇oligo(dT)（針對帶polyA尾的mRNA）、隨機(jī)引物（適合所有RNA）或基因特異性引物。實(shí)驗(yàn)：定量PCR原理與應(yīng)用檢測原理通過熒光信號實(shí)時監(jiān)測PCR產(chǎn)物積累，熒光強(qiáng)度與DNA量成正比檢測方法SYBRGreen染料法：非特異結(jié)合雙鏈DNA；TaqMan探針法：使用帶熒光基團(tuán)的特異性探針數(shù)據(jù)分析通過Ct值（熒光信號達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)）進(jìn)行定量，結(jié)合相對定量或絕對定量方法主要應(yīng)用基因表達(dá)定量、病原體檢測、SNP分析、拷貝數(shù)變異研究限制性內(nèi)切酶與分子克隆I型酶II型酶III型酶IV型酶其他類型限制性內(nèi)切酶是分子克隆的重要工具，能在特定DNA序列處切割雙鏈DNA。它們主要來源于細(xì)菌，是細(xì)菌防御病毒侵染的天然防御系統(tǒng)。限制酶按識別和切割特性分為四類，其中II型酶最常用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗鼈冊谧R別位點(diǎn)處直接切割。常用限制酶包括EcoRI、BamHI、HindIII等，它們識別6-8bp的特定序列，產(chǎn)生黏性末端或平末端。酶切反應(yīng)需考慮酶的活性單位、最適反應(yīng)條件（溫度、pH、離子強(qiáng)度）和Star活性（非特異切割）等因素。多數(shù)限制酶反應(yīng)最適溫度為37℃，但也有需要更高或更低溫度的特例。DNA連接反應(yīng)片段準(zhǔn)備載體與插入片段經(jīng)限制酶消化，產(chǎn)生兼容末端。通常需脫磷酸處理載體5'端以防自連，并純化去除酶和雜質(zhì)。連接反應(yīng)體系典型反應(yīng)包含載體DNA、插入片段、T4DNA連接酶、連接緩沖液（含ATP）。載體與插入片段摩爾比例通常為1:3至1:5，總DNA量為50-100ng。反應(yīng)條件優(yōu)化連接反應(yīng)可在室溫（22-25℃）進(jìn)行2小時或4℃過夜。粘性末端連接效率高于平末端。溫度循環(huán)連接法（在16℃和4℃間循環(huán)）可提高效率。載體構(gòu)建與質(zhì)粒介紹載體基本結(jié)構(gòu)復(fù)制起點(diǎn)(ori)：控制質(zhì)粒在宿主中的復(fù)制1篩選標(biāo)記抗生素抗性基因：用于轉(zhuǎn)化后的菌落篩選多克隆位點(diǎn)含多個限制酶位點(diǎn)，方便插入外源DNA表達(dá)元件啟動子、終止子等調(diào)控基因表達(dá)常用質(zhì)粒載體類型包括：克隆載體（如pUC系列），用于DNA片段克隆與擴(kuò)增；表達(dá)載體（如pET系列），含強(qiáng)啟動子用于蛋白質(zhì)表達(dá)；穿梭載體，可在多種宿主中復(fù)制；自殺載體，只能在特定條件下維持。載體選擇應(yīng)考慮插入片段大小、宿主類型、復(fù)制數(shù)量和下游應(yīng)用需求。細(xì)胞轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染技術(shù)原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化化學(xué)法：使用CaCl?處理使細(xì)胞暫時通透，再熱激（42℃，30-90秒）促進(jìn)DNA進(jìn)入。簡便經(jīng)濟(jì)但效率較低。電穿孔法：高壓電脈沖在細(xì)胞膜上產(chǎn)生瞬時孔隙，使外源DNA進(jìn)入。效率高但設(shè)備要求高，適合難轉(zhuǎn)化菌株。常用宿主：大腸桿菌DH5α、BL21等真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體介導(dǎo)：帶正電荷的脂質(zhì)體與帶負(fù)電荷的DNA形成復(fù)合物，與細(xì)胞膜融合導(dǎo)入DNA。溫和高效，適合多數(shù)細(xì)胞系。鈣磷酸共沉淀：DNA與鈣磷酸形成沉淀物被細(xì)胞吞噬。成本低但效率受條件影響大。其他方法：電穿孔法、病毒載體介導(dǎo)、顯微注射等藍(lán)白斑篩選與克隆鑒定藍(lán)白斑篩選原理藍(lán)白斑篩選基于lacZ基因編碼的β-半乳糖苷酶活性。完整的lacZ基因可水解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)；若外源DNA插入lacZ，破壞其功能，則菌落呈白色。這種方法簡單直觀，是常用的初篩方法。菌落PCR篩選直接用菌落作為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證插入片段，不需提取質(zhì)粒。使用載體上的通用引物或特異性引物，快速高通量篩選陽性克隆。該方法操作簡便，節(jié)省時間，適合篩選大量克隆。限制性酶切鑒定提取質(zhì)粒后，用特定限制酶消化，電泳檢測切割模式是否符合預(yù)期。這種方法能確認(rèn)插入片段的存在、方向和大小，是最可靠的鑒定方法之一，但需要更多時間和試劑。重組DNA鑒定初步篩選平板篩選、抗性檢測、藍(lán)白斑篩選獲得候選克隆2分子確認(rèn)菌落PCR或質(zhì)粒提取后進(jìn)行PCR或酶切分析序列驗(yàn)證測序確認(rèn)插入片段序列完全正確無突變重組DNA鑒定是基因克隆的關(guān)鍵步驟，確保獲得正確重組體。從簡單到復(fù)雜，鑒定方法有遞進(jìn)關(guān)系。初步篩選如抗性或藍(lán)白斑能快速篩除大部分陰性克??；分子確認(rèn)如PCR和酶切能驗(yàn)證插入片段大小和方向；最終的序列驗(yàn)證則能確保插入片段序列完全正確，無框架移位或突變。菌株培養(yǎng)與質(zhì)粒提取1培養(yǎng)基制備LB培養(yǎng)基是細(xì)菌培養(yǎng)最常用的培養(yǎng)基，含胰蛋白胨、酵母提取物和NaCl。固體培養(yǎng)基加1.5-2%瓊脂，液體培養(yǎng)需在37℃振蕩培養(yǎng)（180-220rpm）。根據(jù)質(zhì)粒攜帶的抗性標(biāo)記加入相應(yīng)抗生素。小量提?。∕ini-prep）從1-5ml過夜培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒，產(chǎn)量約5-20μg，適合初步鑒定和小規(guī)模使用。可使用堿裂解法或商業(yè)試劑盒，整個過程約30分鐘。大量提?。∕axi-prep）從100-500ml培養(yǎng)物中提取，產(chǎn)量可達(dá)數(shù)百μg至數(shù)mg。通常涉及細(xì)胞堿裂解、中和、柱純化和乙醇沉淀等步驟，整個過程約2-3小時。DNA測序原理與方法Sanger測序法Sanger法是第一代DNA測序技術(shù)，基于雙脫氧鏈終止原理。在正常DNA合成過程中添加熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸（ddNTPs），當(dāng)這些核苷酸被整合時，DNA鏈合成終止?，F(xiàn)代自動化儀器使用四種不同熒光標(biāo)記的ddNTPs（A、T、G、C各一種），通過毛細(xì)管電泳分離終止片段，激光檢測熒光信號。Sanger法準(zhǔn)確度高，單次可讀長度達(dá)700-1000bp，仍是小規(guī)模測序和驗(yàn)證的首選方法。高通量測序第二代測序（NGS）技術(shù)如Illumina可同時測序數(shù)百萬DNA片段，基于邊合成邊測序原理。其通量比Sanger法高數(shù)千倍，但讀長較短（150-300bp）。第三代測序如PacificBiosciences和OxfordNanopore提供超長讀長（可達(dá)數(shù)十kb），適合基因組組裝和結(jié)構(gòu)變異檢測。這些技術(shù)革命性地提高了測序速度、降低了成本，使全基因組測序成為常規(guī)應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)：基因組測序案例1樣品準(zhǔn)備提取高分子量基因組DNA，片段化處理，連接測序接頭測序平臺選擇根據(jù)項(xiàng)目需求選擇合適平臺：Illumina精確度高；PacBio讀長長；Nanopore便攜實(shí)時生物信息分析數(shù)據(jù)質(zhì)控、序列拼接、基因注釋、變異檢測功能解讀基因功能分析、比較基因組學(xué)、進(jìn)化分析Southern雜交技術(shù)DNA樣品消化使用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA凝膠電泳分離DNA片段轉(zhuǎn)膜將DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上預(yù)雜交封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)探針雜交標(biāo)記的探針與膜上的目標(biāo)DNA結(jié)合洗膜與檢測去除非特異結(jié)合，檢測特異信號Northern雜交技術(shù)Northern雜交RT-PCRNorthern雜交是檢測特定RNA表達(dá)的經(jīng)典技術(shù)，類似于Southern雜交但針對RNA。其步驟包括RNA樣品在變性條件下電泳分離、轉(zhuǎn)移至膜上、探針雜交和信號檢測。與RT-PCR相比，Northern雜交雖然靈敏度較低，但能直接觀察轉(zhuǎn)錄物大小和可能的剪接變體。探針標(biāo)記方法包括放射性標(biāo)記（32P）和非放射性標(biāo)記（如DIG、生物素）。放射性標(biāo)記靈敏度高但有安全隱患；非放射性標(biāo)記則更安全但靈敏度略低。目前，Northern雜交已逐漸被RT-PCR和RNA-seq等技術(shù)取代，但在某些應(yīng)用中仍有不可替代的價值。WesternBlot技術(shù)樣品制備組織或細(xì)胞裂解，提取蛋白質(zhì)，加入SDS變性處理1SDS電泳蛋白質(zhì)按分子量在凝膠中分離轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF或硝酸纖維素膜封閉用BSA或脫脂奶粉封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)抗體孵育一抗識別目標(biāo)蛋白，二抗結(jié)合一抗并帶標(biāo)記物顯影檢測顯色或化學(xué)發(fā)光檢測目標(biāo)蛋白條帶實(shí)驗(yàn)：蛋白質(zhì)印跡（Western）樣品處理與加樣蛋白質(zhì)樣品需加入還原劑（β-巰基乙醇）和SDS完全變性，確保按分子量分離。加熱樣品（95℃，5分鐘）后，冰浴短暫冷卻，離心去除沉淀，小心上樣以避免氣泡。通常需加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物作為參照。濕轉(zhuǎn)與半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜可選擇濕轉(zhuǎn)或半干轉(zhuǎn)。濕轉(zhuǎn)效率高，適合大分子量蛋白；半干轉(zhuǎn)速度快，適合常規(guī)分析。轉(zhuǎn)膜緩沖液通常含甲醇以提高蛋白質(zhì)與膜結(jié)合。轉(zhuǎn)膜電壓和時間需根據(jù)蛋白質(zhì)大小調(diào)整，避免過轉(zhuǎn)或欠轉(zhuǎn)。檢測與結(jié)果判讀化學(xué)發(fā)光法是最常用的檢測方法，敏感度高且可進(jìn)行定量分析。曝光時間需要優(yōu)化，避免過曝或信號過弱。通常使用內(nèi)參蛋白（如β-actin或GAPDH）作為加樣量對照，確保結(jié)果可靠性?；虮磉_(dá)分析方法方法優(yōu)點(diǎn)局限性應(yīng)用場景RT-PCR靈敏度高，操作簡便，成本低同時分析基因數(shù)有限特定基因表達(dá)驗(yàn)證，臨床診斷Northern雜交可檢測RNA大小，識別剪接變體靈敏度低，耗時長轉(zhuǎn)錄本大小分析，剪接研究基因芯片高通量，可分析全基因組表達(dá)動態(tài)范圍有限，需大量RNA全基因組表達(dá)譜分析，生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)RNA-seq數(shù)字化結(jié)果，動態(tài)范圍廣，可檢測未知轉(zhuǎn)錄本成本較高，數(shù)據(jù)分析復(fù)雜轉(zhuǎn)錄組分析，新RNA發(fā)現(xiàn)，變異檢測基因表達(dá)分析是研究基因功能和調(diào)控的關(guān)鍵技術(shù)。從傳統(tǒng)的Northern雜交和RT-PCR到現(xiàn)代的芯片和測序技術(shù)，方法不斷發(fā)展。RT-qPCR是精確定量單個基因表達(dá)的金標(biāo)準(zhǔn)；RNA-seq則提供了全面了解轉(zhuǎn)錄組的能力。方法選擇應(yīng)基于研究目標(biāo)、樣本量、預(yù)算和所需信息深度。RNA干擾（RNAi）實(shí)驗(yàn)基因功能研究敲低特定基因表達(dá)觀察表型變化疾病治療探索靶向致病基因的潛在治療方法信號通路解析系統(tǒng)性敲低通路分子揭示調(diào)控網(wǎng)絡(luò)4RNAi機(jī)制雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)被Dicer酶切割成siRNA，由RISC復(fù)合物介導(dǎo)靶向mRNA降解RNA干擾是一種序列特異性的基因沉默技術(shù)，通過小干擾RNA（siRNA）介導(dǎo)的mRNA降解實(shí)現(xiàn)。siRNA通常為21-23nt的雙鏈RNA，需要精心設(shè)計(jì)以確保特異性和效力。好的siRNA設(shè)計(jì)應(yīng)避免脫靶效應(yīng)、考慮GC含量（30-60%較佳）、避免重復(fù)序列，并確保目標(biāo)區(qū)域可及性。實(shí)驗(yàn)：siRNA轉(zhuǎn)染24h細(xì)胞鋪板時間轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到40-60%匯合5nMsiRNA典型濃度最終濃度通常在1-50nM范圍內(nèi)48h表達(dá)抑制檢測轉(zhuǎn)染后最佳檢測時間點(diǎn)72h表型觀察蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)后觀察細(xì)胞表型變化siRNA轉(zhuǎn)染是將合成的小干擾RNA導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)染方法包括脂質(zhì)體介導(dǎo)（如Lipofectamine）、電穿孔和病毒載體等。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染最為常用，操作簡便且效率高，適用于多種細(xì)胞類型。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)始終設(shè)置陰性對照（非靶向siRNA）和陽性對照（已知有效的siRNA）。轉(zhuǎn)染效率可通過熒光標(biāo)記的siRNA初步評估，而敲低效果則需通過qRT-PCR（mRNA水平）或Westernblot（蛋白質(zhì)水平）驗(yàn)證。值得注意的是，siRNA效果是暫時的，持續(xù)時間通常為3-7天，這一特性既是局限也是某些應(yīng)用的優(yōu)勢。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)基因敲除通過非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)導(dǎo)致的插入/缺失突變，產(chǎn)生移碼突變使基因功能喪失。這是最簡單的應(yīng)用，效率高，適合功能缺失研究?；蛐揎椑猛粗亟M修復(fù)（HDR）實(shí)現(xiàn)精確修飾，可引入點(diǎn)突變或標(biāo)簽序列。需要提供修復(fù)模板，效率較敲除低但精確度高?；蛘{(diào)控使用失活的dCas9融合轉(zhuǎn)錄激活或抑制結(jié)構(gòu)域，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控而非序列編輯。這種表觀遺傳調(diào)控是可逆的，為基因功能研究提供新視角。CRISPR/Cas9是革命性的基因編輯工具，源自細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)。其核心組件包括Cas9核酸酶和導(dǎo)向RNA（sgRNA），后者引導(dǎo)Cas9靶向特定DNA序列。當(dāng)sgRNA與靶序列配對時，Cas9在PAM（原型相鄰基序，通常為NGG）附近切割DNA雙鏈，形成雙鏈斷裂。斷裂的修復(fù)途徑?jīng)Q定了編輯結(jié)果：NHEJ通常導(dǎo)致小的插入/缺失，而HDR則允許精確編輯。CRISPR基因敲除與修復(fù)sgRNA設(shè)計(jì)是CRISPR實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，需考慮多個因素。首先，目標(biāo)序列必須緊鄰PAM位點(diǎn)（Cas9常用的是NGG）；其次，應(yīng)檢查脫靶潛力，選擇特異性高的序列；此外，GC含量（40-60%）和序列位置（基因功能區(qū)域）也會影響效率。多種在線工具如CHOPCHOP、CRISPOR可輔助設(shè)計(jì)最優(yōu)sgRNA。CRISPR實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用范圍廣泛，從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用。在動物模型構(gòu)建中，CRISPR可快速創(chuàng)建基因敲除小鼠；在疾病治療領(lǐng)域，如針對鐮狀細(xì)胞貧血和杜氏肌營養(yǎng)不良的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行；農(nóng)業(yè)上則用于作物改良，如開發(fā)抗病蟲害品種。未來，隨著技術(shù)改進(jìn)，CRISPR可能重塑多個生物技術(shù)領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)：gDNA與ChIP提取樣品準(zhǔn)備對于ChIP實(shí)驗(yàn)，首先用甲醛將DNA與相互作用的蛋白質(zhì)交聯(lián)，固定核酸-蛋白質(zhì)相互作用。交聯(lián)條件通常為1%甲醛室溫處理10分鐘，時間過長會導(dǎo)致過度交聯(lián)，影響后續(xù)免疫沉淀效率。染色質(zhì)片段化使用超聲破碎儀將染色質(zhì)剪切成200-500bp片段。這一步驟關(guān)鍵是獲得均一大小的片段，需要優(yōu)化超聲條件（功率、時間、次數(shù)）。也可使用微球菌核酸酶等酶消化方法，但超聲更為常用。免疫沉淀使用特異性抗體捕獲目標(biāo)蛋白質(zhì)及其結(jié)合的DNA。抗體質(zhì)量直接影響ChIP效率，應(yīng)選擇經(jīng)ChIP驗(yàn)證的抗體。通常使用蛋白A/G磁珠收集抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。功能基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)基因組學(xué)DNA測序、基因組組裝和注釋、變異檢測1轉(zhuǎn)錄組學(xué)RNA-seq、基因表達(dá)分析、可變剪接分析蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)鑒定與定量、翻譯后修飾3代謝組學(xué)代謝物分析、代謝通路重建、通量分析表觀基因組學(xué)DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)組學(xué)大數(shù)據(jù)分析簡介數(shù)據(jù)預(yù)處理與質(zhì)控組學(xué)數(shù)據(jù)分析首先需要進(jìn)行質(zhì)量控制和預(yù)處理，去除低質(zhì)量序列、接頭污染和技術(shù)噪聲。常用工具包括FastQC（質(zhì)檢）、Trimmomatic（過濾修剪）和SAMtools（比對后處理）。質(zhì)量評估指標(biāo)包括Q值分布、GC含量、序列重復(fù)率等。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化是消除技術(shù)偏差、使樣本間數(shù)據(jù)可比的關(guān)鍵步驟。不同組學(xué)數(shù)據(jù)有特定標(biāo)準(zhǔn)化方法，如RNA-seq使用RPKM/FPKM/TPM，芯片數(shù)據(jù)使用分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。生物信息分析流程典型RNA-seq分析包括：序列比對（STAR、HISAT2）、表達(dá)定量（featureCounts、Salmon）、差異表達(dá)分析（DESeq2、edgeR）和功能注釋（GO、KEGG）?；蚪M變異分析則包括：比對（BWA）、變異檢測（GATK、Strelka）和注釋（VEP、ANNOVAR）。公共數(shù)據(jù)庫是寶貴資源：序列數(shù)據(jù)庫（NCBISRA、EBIENA）、功能數(shù)據(jù)庫（GO、KEGG、UniProt）和疾病數(shù)據(jù)庫（OMIM、TCGA、GTEx）。這些資源對數(shù)據(jù)解釋和研究設(shè)計(jì)至關(guān)重要。基因芯片技術(shù)原理DNA微陣列原理DNA微陣列基于互補(bǔ)堿基配對原理，將已知序列的DNA探針固定在固相載體（玻璃、硅或尼龍膜）上，形成高密度排列。樣品DNA或RNA（通常標(biāo)記熒光染料）與陣列雜交，雜交信號強(qiáng)度反映特定序列的豐度。表達(dá)譜分析表達(dá)譜芯片是最常見應(yīng)用，可同時監(jiān)測成千上萬基因的表達(dá)水平。通過比較不同條件下的表達(dá)模式，識別差異表達(dá)基因，揭示分子機(jī)制。常用分析包括差異表達(dá)、聚類分析和通路富集。SNP基因分型SNP芯片用于大規(guī)模單核苷酸多態(tài)性檢測，基于等位基因特異性雜交。廣泛應(yīng)用于全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）、遺傳疾病研究和藥物基因組學(xué)。最新芯片可分析數(shù)百萬SNP位點(diǎn)。單細(xì)胞測序技術(shù)單細(xì)胞分離通過流式細(xì)胞分選、微流控技術(shù)或手工挑取實(shí)現(xiàn)單個細(xì)胞的分離。10xGenomics微流控系統(tǒng)是當(dāng)前主流平臺，可同時處理數(shù)千個單細(xì)胞，并為每個細(xì)胞添加獨(dú)特的條形碼。核酸擴(kuò)增單細(xì)胞中的核酸量極少（約10pgRNA），需要全基因組或全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增。常用方法包括SMART-seq2（全長轉(zhuǎn)錄本）和Drop-seq（3'端標(biāo)記）。擴(kuò)增偏好性和技術(shù)噪聲是主要挑戰(zhàn)。測序與分析擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行文庫構(gòu)建和高通量測序。數(shù)據(jù)分析包括質(zhì)控、細(xì)胞類型聚類、軌跡分析和差異基因表達(dá)。單細(xì)胞數(shù)據(jù)的稀疏性和噪聲需要特殊的計(jì)算方法處理。單細(xì)胞技術(shù)突破了傳統(tǒng)組織水平分析的局限，揭示細(xì)胞異質(zhì)性和罕見細(xì)胞類型。除轉(zhuǎn)錄組外，單細(xì)胞技術(shù)已擴(kuò)展到DNA（突變檢測）、表觀基因組（甲基化）和多組學(xué)（如CITE-seq結(jié)合蛋白質(zhì)和RNA分析）。這一領(lǐng)域正快速發(fā)展，持續(xù)推動我們對細(xì)胞異質(zhì)性和發(fā)育過程的理解。流式細(xì)胞術(shù)（FACS）基礎(chǔ)流式細(xì)胞術(shù)（FACS）是單細(xì)胞分析和分選的強(qiáng)大工具，能同時檢測多個細(xì)胞參數(shù)。其工作原理是將細(xì)胞懸液以單細(xì)胞流通過激光束，分析散射光（反映細(xì)胞大小和復(fù)雜性）和熒光（來自特異性標(biāo)記的細(xì)胞成分）。分選功能則可根據(jù)預(yù)設(shè)參數(shù)將特定細(xì)胞群體分離收集。細(xì)胞標(biāo)記主要使用熒光抗體（針對細(xì)胞表面或內(nèi)部抗原）、熒光蛋白（如GFP轉(zhuǎn)染細(xì)