《鐵皮石斛繁育種子袋生產技術規(guī)程》

1本標準規(guī)定了鐵皮石斛真菌-種子袋生產前原料準備、鐵皮石斛種子活力檢驗、真菌-種子袋生產關鍵技術、安全防護措施、質量要求、真菌-種子袋質量檢驗、標志、包裝、運輸和貯存等技術要求。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農作物種子檢驗規(guī)程水分測定3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1真菌-種子袋Fungus-seedbags一種專門為鐵皮石斛種子在野外進行直播而設計的繁殖用品，由鐵皮石斛種子、水苔等按照特定配比混合制成。4真菌-種子袋原料準備4.1準備茶包袋采購透氣、易降解的紙質茶包袋（長*寬：6.2*5.5cm），備用。4.2菌粉制作4.2.1菌株選擇選用石斛蠟殼菌（SerendipitaoficinaleX.J.Wang）專用菌株。4.2.2菌株活化該平板預先準備好馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA；馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L,瓊脂20g/L，pH=5.8-6）；利用接種環(huán)，從試管斜面中取出一小塊石斛蠟殼菌（SerendipitaoficinaleX.J.Wang）菌種，將菌塊置于平板中心，用封口膜將平板密封，放置在25±2℃的培養(yǎng)室中進行暗培養(yǎng)，約10天，待真菌菌絲長滿培養(yǎng)基表面，即可將其作為后續(xù)的接種物。4.2.3配制培養(yǎng)基a.配制馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB；配方：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L,pH=5.8-6）。2b.分裝300ml培養(yǎng)基至錐形瓶（500ml）中，用錫箔紙密封好瓶口，然后將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶放入高壓滅菌鍋中，設定條件為121℃下滅菌20分鐘。滅菌完成后，將培養(yǎng)基轉移到超凈工作臺上冷卻至室溫，以備后續(xù)使用。4.2.4擴繁真菌a.在超凈工作臺上，使用已滅菌的尖鑷切取步驟4.2.2中獲得的菌塊，迅速將6-7塊菌塊（約1*1cm）轉接到裝有步驟4.2.3預備的液體培養(yǎng)基的錐形瓶中。b.接菌操作完成后，立即用錫箔紙密封錐形瓶口，再用兩層報紙再次包裹瓶口，用橡膠圈進行固c.將含有培養(yǎng)基和菌塊的錐形瓶放置于振蕩培養(yǎng)箱中，啟動儀器進行振蕩培養(yǎng)（25℃±2℃,200轉/分），以促進真菌的孵化擴繁。培養(yǎng)15天左右，菌絲就能長滿；冬季，培養(yǎng)時間可能需要延長至20天左右，以確保菌絲生長充分。4.2.5菌粉配制a.利用尼龍網過濾步驟4.2.4中得到的含有培養(yǎng)基和菌絲的混合液，以分離出菌絲。移除溶液，僅保留菌絲，并使其自然瀝干，得到純凈的菌絲。b.將純菌絲與瓊脂以1∶2的重量比混合，放入多功能粉碎機中，進行4秒的快速粉碎，然后暫停機器，等待儀器完全停止，打開蓋子，用干凈玻璃棒進行攪拌，確保菌絲充分粉碎，再次啟動粉碎機進行3秒的粉碎，以獲得粒徑均勻的菌粉。c.將得到的菌粉倒入潔凈的不銹鋼托盤中，攤平，厚度不超過1cm。將托盤放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，在28℃的溫度下吹風烘干24-36小時（期間適當攪拌菌粉，確保菌粉充分干燥）。此過程完成后，使得菌粉的含水率降至大約10%，至此菌粉已準備好，可用于后續(xù)步驟。5鐵皮石斛種子活力檢驗鐵皮石斛種子使用前，先使用TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）染色法對種子活力進行測定，保證種子活力達到90%以上，備用。具體方法見附錄A。6真菌-種子袋生產技術6.1配制菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末稱取200g步驟4.2.5獲得的菌粉，再精確稱取0.01g（約10000顆種子）活力達標的鐵皮石斛種子，將菌粉和種子進行混合均勻，獲得菌粉+種子混合粉末，使得每克菌粉+種子混合粉末中約含有50顆種子。6.2分裝水苔取約0.03g干燥水苔，裝入茶包袋中。6.3分裝菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末使用不銹鋼藥勺取約0.2g菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末，裝入含有0.08g水苔的茶包袋中，每袋茶包袋包含約10顆種子，折疊袋口，即可生產獲得鐵皮石斛真菌-種子袋。6.4打包3每50袋鐵皮石斛真菌-種子袋，用橡皮筋捆成一捆；每100捆裝入一個防水、防潮的自封袋中，抽真空，4℃條件貯存。7安全防護措施7.1應對生產操作人員進行安全防護知識培訓，操作人員應了解所用試劑、儀器的使用說明以及注意事項。7.2應對操作高壓滅菌工作人員進行特種設備培訓，且必須獲得中華人民共和國特種設備安全管理和作業(yè)人員證。7.3鐵皮石斛真菌-種子袋生產操作過程中的生產人員應當穿著實驗服，佩戴防塵口罩、橡膠手套。7.4生產場所應保持清潔、通風透氣。8質量要求質量合格的鐵皮石斛真菌-種子袋的萌發(fā)率應大于等于95%，含水率10%-12%，菌粉量0.2-0.3g。9真菌-種子袋質量檢驗9.1抽樣每批真菌-種子袋生產完成后，隨機從10000袋真菌-種子袋抽取35袋，進行后續(xù)檢測試驗9.2萌發(fā)率檢驗a.將已發(fā)酵的松樹皮（6-9mm）浸泡三天，以便充分吸水。之后，使用高壓滅菌鍋對其進行滅菌處理，確保松樹皮的無菌狀態(tài)。冷卻后，將松樹皮均勻地鋪（厚度：2-3cm）到塑料飯盒中。b.手動將鐵皮石斛真菌-種子袋中的粉末抖均勻，并用干凈水源充分浸泡（浸泡5-10分鐘），直至濕透。c.將濕潤的真菌-種子袋放置于松樹皮基質上，緊接著蓋上飯盒蓋。d.最后將塑料飯盒放置在組織培養(yǎng)室內（25℃±2℃,光照周期：12/12h光/暗，光照強度：2000lx）中進行共生萌發(fā)培養(yǎng)。9.3萌發(fā)率評估共生萌發(fā)培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計鐵皮石斛真菌-種子袋的萌發(fā)情況。萌發(fā)率（%）=成功萌發(fā)袋數/總袋數*100%。9.4菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末含水率檢驗菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末長期貯存要求的含水率與鐵皮石斛種子貯存要求的含水率一致，因此統(tǒng)一按照GB/T3543.6的規(guī)定進行含水率檢驗。9.5真菌-種子袋菌粉量檢驗每批真菌-種子袋生產完成后，按照步驟9.1隨機取樣，使用天平依次稱重每袋真菌-種子袋的菌粉重量。9.6檢驗結果判定4上述報告中若有一項不合格，即判定為不合格鐵皮石斛真菌-種子袋，并在檢驗結果報告中注明處理意見。10標志、包裝、運輸、貯存10.1標志標志應在包裝上，標志上應當注明鐵皮石斛真菌-種子袋中的有效真菌成分、含量、相關專利以及注意事項。10.2包裝外包裝應使用防水、防潮材料。包裝材料使用后進行合理處理，避免環(huán)境污染。