第2章 沉淀法課件

純化方法第2章沉淀法沉淀法色譜法電泳法第2章沉淀法第二章沉淀法第2章沉淀法第一節(jié)

基本原理與沉淀類型一、基本原理二、制備蛋白質(zhì)三、制備核酸第2章沉淀法一、基本原理沉淀法也稱溶解度法。基本原理：根據(jù)各種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異來(lái)改變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)（如：pH、極性、離子強(qiáng)度、金屬離子等)，從而使抽提液中有效成分的溶解度發(fā)生變化。第2章沉淀法二、制備蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的膠體溶液。其原因有二：水化膜的存在同性電荷的相互排斥作用第2章沉淀法蛋白質(zhì)沉淀方法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)沉淀法聚乙二醇沉淀法選擇性沉淀法結(jié)晶沉淀法第2章沉淀法1．

鹽析法鹽溶(salting-ineffect)：蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度隨鹽濃度的升高而上升。鹽析(salting-outeffect)：當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度又逐漸下降，直到蛋白質(zhì)析出。第2章沉淀法鹽析原理示意圖第2章沉淀法鹽析一般操作步驟：部分雜質(zhì)“鹽析”，有效成分“鹽溶”離心分離得上清液有效成分等物質(zhì)“鹽析”，部分雜質(zhì)“鹽溶”離心收集沉淀物初步純化的有效成分物質(zhì)第2章沉淀法①

鹽的選擇

蛋白質(zhì)沉淀，常選用硫酸銨。優(yōu)點(diǎn)：1.

溶解度大，對(duì)溫度不敏感。水溫25℃，硫酸銨的飽和溶解度為769g(4.1M)

水溫為0℃，其飽和溶解度為679g(3.9M)；2.

分級(jí)效果好。去雜75%以上；3.

有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。經(jīng)2-3M硫銨鹽析的蛋白可置低溫保存1年以上；缺點(diǎn)：繼續(xù)純化時(shí)，需脫鹽。（1）鹽分級(jí)沉淀第2章沉淀法②硫酸銨鹽析A．固體法B．飽和溶液法C．透析法第2章沉淀法第2章沉淀法（2）

脫鹽方法：凝膠過(guò)濾法、透析法第2章沉淀法第2章沉淀法2．

有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因有二：1、與鹽溶液一樣具有脫水作用，2、有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性減小。常用的有機(jī)溶劑是甲醇、乙醇和丙酮。第2章沉淀法注意：①低溫操作有機(jī)溶劑預(yù)冷至一10℃，操作在低溫進(jìn)行。②中性鹽的作用宜在稀鹽溶液或低濃度緩沖液中進(jìn)行。③多價(jià)陽(yáng)離子的作用有些蛋白質(zhì)和多價(jià)陽(yáng)離子(如Zn2+、Cu2+等)能結(jié)合形成復(fù)合物，致使蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度降低。第2章沉淀法3．

蛋白質(zhì)沉淀法(1)

堿性蛋白質(zhì)如：魚(yú)精蛋白(2)

凝集素如：植物凝集素(3)重金屬第2章沉淀法4．

聚乙二醇沉淀法聚乙二醇〔ployethyleneglycol,PEG〕和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。沉淀?xiàng)l件溫和，不易引起蛋白質(zhì)變性，而且沉淀較完全，因此應(yīng)用范圍頗廣。但是，它也受各種因子如pH、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)濃度以及聚合物分子量的影響。第2章沉淀法5．

選擇性沉淀法例如：從酵母菌細(xì)胞中純化醇脫氫酶時(shí)就采用了改變溫度的選擇性沉淀法。將酵母干粉加磷酸氫二鈉溶液于37℃水浴保溫2小時(shí)室溫?cái)嚢枞r(shí)。離心收集上清液，升溫至55℃，保持20分鐘后，迅速冷卻，離心去除熱變性蛋白。上清液即為熱穩(wěn)定的醇脫氫酶溶液。根據(jù)蛋白質(zhì)在不同物理化學(xué)因子作用下穩(wěn)定性不同的特點(diǎn)。第2章沉淀法酵母干粉＋磷酸氫二鈉離心收集上清液室溫?cái)嚢?小時(shí)37℃，2小時(shí)熱穩(wěn)定的醇脫氫酶溶液。離心得上清55℃，20分鐘，迅速冷卻第2章沉淀法6．

結(jié)晶沉淀法蛋白質(zhì)沉淀：晶體沉淀無(wú)定形沉淀(非晶體)當(dāng)某一純蛋白質(zhì)溶液的濃度達(dá)到較高(5%-30％)水平時(shí)．只要條件適合，就能產(chǎn)生一定形狀的結(jié)晶。當(dāng)?shù)鞍兹芤褐谢煊须s質(zhì)時(shí)，即使條件適合、也得不到整齊的結(jié)晶，或無(wú)結(jié)晶形成。因此，用顯微鏡觀察結(jié)晶的有無(wú)及形狀，也可作為判斷提純物質(zhì)純化程度的一種方法。第2章沉淀法三、制備核酸第2章沉淀法

核酸的分離與純化

就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要對(duì)象，所以核酸的分離與提取是研究中很重要的基本技術(shù)。核酸樣品的質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。第2章沉淀法核酸的分類DNA

主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。

RNA

存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。第2章沉淀法核酸制備的一般原則分離純化核酸總的原則：①應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子的污染。核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。第2章沉淀法核酸制備的一般原則核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng):①盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程。②減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。pH4-10③減少物理因素對(duì)核酸的降解。機(jī)械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解。第2章沉淀法核酸制備的一般原則核酸制備的步驟：破碎細(xì)胞提取純化第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理核酸酶的抑制和抑制劑

降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對(duì)核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個(gè)條件并用更好。對(duì)于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機(jī)械張力拉斷則更重要。對(duì)于RNA，因分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要。第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理DNase抑制①加入少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理RNase抑制①操作要帶手套。②所有器皿要嚴(yán)格消毒，③試劑處理④低溫操作⑤在分離過(guò)程中要加入一定的RNase抑制劑。第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理核酸制備中常用的去垢劑

核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；

2．溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)；

3．對(duì)RNase、DNase有一定的抑制作用。第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理核酸制備中常用的去垢劑

SDS

脫氧膽酸鈉

4-氨基水楊酸鈉萘-1.5-二磺酸鈉三異丙基萘磺酸鈉第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑

蛋白質(zhì)變性劑的作用：

1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。

2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。

3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細(xì)胞的作用。

第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑

苯酚氯仿鹽酸胍

DEPC第2章沉淀法核酸制備的一般方法和原理核酸制備中常用的酶制劑

DNaseRNase

蛋白酶K

溶菌酶

第2章沉淀法核酸樣品的保存

核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)

溫度：

4℃最佳和最簡(jiǎn)單

-70℃是長(zhǎng)期保存的良好溫度，為一次性保存

-20℃保存

保存介質(zhì)：

TE緩沖溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0

第2章沉淀法第二節(jié)離心分離技術(shù)

離心分離技術(shù)是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，根據(jù)物質(zhì)顆粒的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度及浮力等因子的不同，而使物質(zhì)分離的技術(shù)。第2章沉淀法一、離心機(jī)的種類與用途按用途分：分析用、制備用、分析－制備用按結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分：管式、吊籃式、轉(zhuǎn)鼓式和碟式按離心機(jī)轉(zhuǎn)速分：常（低）速、高速、超速第2章沉淀法1.常速離心機(jī)又稱低速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速：8000rpm相對(duì)離心力：＜1×104g主要用途：分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锛按纸Y(jié)晶等較大的顆粒。RCF=1.12×10-5×r×n2

RCF=相對(duì)離心力

r=旋轉(zhuǎn)半徑（厘米）n=每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)第2章沉淀法2.高速離心機(jī)轉(zhuǎn)速：1×104－2.5×104rpm相對(duì)離心力：1×104－10×105g主要用途：分離各種沉淀物、細(xì)胞碎片、較大的細(xì)胞器等高速冷凍離心機(jī)第2章沉淀法3.超速離心機(jī)轉(zhuǎn)速：2.5×104－8×104rpm相對(duì)離心力：5×105g第2章沉淀法二、離心分離方法的選擇離心分離的方法可分為二類：

1.差速離心

2.密度梯度離心

第2章沉淀法原理：采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法，稱為差速離心法。當(dāng)以一定離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在大離心力的條件下進(jìn)行離心，又得到第二部分較大、較重顆粒的“沉淀”，如此，多次離心處理，即能把液體中的不同沉降速度的顆粒分批分離出來(lái)。常用于分離大小和密度相差較大的顆粒。1、差速離心法第2章沉淀法第2章沉淀法2.密度梯度離心

原理：樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在