HMGB1調(diào)控自噬介導非小細胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥的機制與治療新策略探究

HMGB1調(diào)控自噬介導非小細胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥的機制與治療新策略探究一、引言1.1研究背景肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康。非小細胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）在肺癌中占比約80%-85%，其主要類型包括腺癌、鱗癌和大細胞癌等。由于NSCLC早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機會。對于晚期NSCLC患者，傳統(tǒng)的化療和放療雖有一定療效，但耐受性和治療效果相對較差，患者生存期較短，5年生存率較低，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和預后。吉非替尼作為一種已批準臨床使用的靶向多肽受體酪氨酸激酶（ReceptorTyrosineKinase，RTK）藥物，通過抑制表皮生長因子受體（EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR）酪氨酸激酶的活性，阻斷EGFR生成信號傳遞至細胞內(nèi)，從而抑制腫瘤細胞的異常增生與轉(zhuǎn)移，為NSCLC患者的治療帶來了新的希望。臨床研究表明，對于EGFR基因突變陽性的NSCLC患者，吉非替尼的治療效果顯著，能夠有效延長患者的無進展生存期，提高患者的生活質(zhì)量。然而，臨床應用吉非替尼后獲得性耐藥現(xiàn)象成為制約患者治療效果的重要問題，大部分患者在接受吉非替尼治療后9-14個月會出現(xiàn)耐藥，導致腫瘤再次進展，限制了其臨床應用。自噬是細胞在遭受刺激時為維持存活而使用的一種自我降解過程，通過溶酶體對細胞內(nèi)受損的細胞器、蛋白質(zhì)等進行降解和再利用，以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和細胞的生存。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬在NSCLC的發(fā)生和進展中扮演著重要角色，其過度激活亦會導致腫瘤細胞的耐藥性。在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了自噬誘導劑對腫瘤細胞的毒性，擁有潛在的治療價值。在肺癌中，自噬也被證實可以調(diào)節(jié)吉非替尼的耐藥性，但其調(diào)控機制仍不明確，深入探究其中的作用機制對于解決吉非替尼耐藥問題具有重要意義。HMGB1是一種高遷移率群體盒子1蛋白，廣泛存在于真核細胞的細胞核中，參與穩(wěn)定染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。其在宿主免疫防御反應、炎癥反應、血管生成和腫瘤形成中的作用已受到廣泛的關(guān)注。在多種癌癥中，如乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等，均發(fā)現(xiàn)了HMGB1與癌癥發(fā)生和治療效果之間存在關(guān)聯(lián)。然而，在NSCLC中，HMGB1的作用和其調(diào)控自噬的機制仍不清楚，這為研究NSCLC的發(fā)病機制和治療策略帶來了一定的挑戰(zhàn)。綜上所述，晚期NSCLC患者的治療面臨著諸多困境，吉非替尼的獲得性耐藥問題亟待解決。自噬和HMGB1在NSCLC中的作用及機制研究尚存在許多空白，探究NSCLC中HMGB1對吉非替尼獲得性耐藥性和自噬調(diào)控的作用機制，不僅能夠揭示NSCLC發(fā)生和發(fā)展的分子機制，也能為后續(xù)的治療策略提供重要的理論基礎，具有重要的臨床意義和研究價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討非小細胞肺癌中HMGB1調(diào)控自噬導致吉非替尼獲得性耐藥的分子機制，并基于此探索有效的后續(xù)治療策略，具體目的如下：一是明確HMGB1在非小細胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥過程中的作用，通過實驗分析不同HMGB1表達水平下非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的耐藥性變化，揭示HMGB1與吉非替尼耐藥之間的內(nèi)在聯(lián)系；二是解析HMGB1對自噬的調(diào)控機制，探究HMGB1影響自噬相關(guān)蛋白表達和自噬信號通路的具體方式，以及自噬在HMGB1介導的吉非替尼耐藥中的作用；三是探索基于HMGB1調(diào)控自噬機制的吉非替尼耐藥后續(xù)治療策略，研究自噬誘導劑或抑制劑聯(lián)合吉非替尼的治療效果，以及針對HMGB1和自噬相關(guān)靶點的新型治療方法，為臨床治療提供新的思路和方案。本研究具有重要的理論意義和臨床價值。在理論層面，深入研究HMGB1調(diào)控自噬致非小細胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥的機制，有助于進一步揭示非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展和耐藥的分子生物學基礎，完善肺癌的發(fā)病機制理論體系，為后續(xù)的基礎研究提供重要的參考依據(jù)，填補該領(lǐng)域在HMGB1與自噬及吉非替尼耐藥關(guān)系研究方面的部分空白。在臨床實踐中，吉非替尼作為非小細胞肺癌的重要靶向治療藥物，其獲得性耐藥嚴重影響了患者的治療效果和生存質(zhì)量。本研究通過探索有效的后續(xù)治療策略，有望為臨床醫(yī)生提供新的治療選擇和方案，提高吉非替尼耐藥患者的治療反應率，延長患者的生存期，改善患者的生活質(zhì)量，同時也有助于減少不必要的醫(yī)療資源浪費，具有顯著的社會效益和經(jīng)濟效益。1.3研究創(chuàng)新點在研究內(nèi)容上，本研究創(chuàng)新性地聚焦于HMGB1調(diào)控自噬導致非小細胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥這一鮮少被深入探究的領(lǐng)域，將HMGB1、自噬和吉非替尼耐藥三者緊密聯(lián)系起來，突破了以往僅從單一因素或少數(shù)因素研究耐藥機制的局限。在機制研究方面，本研究深入解析HMGB1對自噬的調(diào)控機制，以及自噬在吉非替尼耐藥中的作用，探索多通路、多靶點的復雜分子機制，有望發(fā)現(xiàn)全新的耐藥調(diào)控通路和潛在治療靶點，填補相關(guān)領(lǐng)域的研究空白。在治療策略探索上，本研究基于HMGB1調(diào)控自噬的機制，嘗試開發(fā)全新的聯(lián)合治療方案，如自噬誘導劑或抑制劑與吉非替尼的聯(lián)合使用，以及針對HMGB1和自噬相關(guān)靶點的新型治療方法，為臨床治療提供具有創(chuàng)新性和前瞻性的思路和方案，有望打破傳統(tǒng)治療的局限性，提高治療效果。在研究方法上，本研究綜合運用多種前沿技術(shù)和模型，如構(gòu)建不同HMGB1表達水平的NSCLC細胞系、吉非替尼誘導獲得性耐藥性模型、NSCLC細胞系的異種移植瘤模型等，并結(jié)合分子生物學、細胞生物學、免疫學等多學科研究方法，從細胞和動物模型多個層面深入研究，保證研究結(jié)果的全面性、準確性和可靠性，為相關(guān)研究提供新的方法學參考。二、相關(guān)理論基礎2.1非小細胞肺癌概述2.1.1疾病特征非小細胞肺癌涵蓋了多種病理類型，其中腺癌是最為常見的類型之一，尤其在不吸煙的女性人群中發(fā)病率相對較高。腺癌又可進一步細分為原位腺癌、微浸潤性腺癌、浸潤性腺癌、浸潤性腺癌變異型等，其癌細胞常含有豐富的血管，這使得血型轉(zhuǎn)移較早發(fā)生。鱗狀細胞癌常好發(fā)于老年吸煙男性，可分為角化型鱗狀上皮細胞癌、非角化型鱗狀上皮細胞癌、基底細胞樣型鱗狀上皮細胞癌，該類型腫瘤生長相對緩慢，患者五年生存率相對較高。大細胞癌則較少見，屬于未分化癌，其生長迅速，早期易出現(xiàn)淋巴和血行轉(zhuǎn)移。此外，還有腺鱗癌、淋巴上皮瘤樣癌、黏液表皮樣癌、大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌、腺樣囊性癌、上皮-肌上皮癌等其他少見類型。非小細胞肺癌的發(fā)病機制較為復雜，涉及多種因素的相互作用。吸煙是明確的主要危險因素，煙草中的尼古丁、焦油等多種致癌物質(zhì)，長期刺激呼吸道上皮細胞，可導致細胞基因突變，進而引發(fā)腫瘤。環(huán)境污染也是重要的誘發(fā)因素，工業(yè)廢氣、汽車尾氣等空氣中的有害顆粒和化學物質(zhì)，以及室內(nèi)裝修材料中的甲醛、苯等揮發(fā)性有機物，均可增加患癌風險。職業(yè)暴露于石棉、鉻、鎳等致癌物質(zhì)的人群，其患非小細胞肺癌的幾率顯著上升。遺傳因素在非小細胞肺癌的發(fā)病中也起到一定作用，家族中有肺癌患者的人群，可能攜帶某些遺傳易感基因，使其對致癌因素更為敏感。此外，慢性肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺結(jié)核等，長期的炎癥刺激可導致肺部組織細胞異常增生，增加癌變的可能性。從流行病學特點來看，非小細胞肺癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率均居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，肺癌的新發(fā)病例數(shù)為220萬，死亡病例數(shù)為180萬，分別位居全球癌癥發(fā)病和死亡的第一位，其中非小細胞肺癌占比約80%-85%。在我國，肺癌同樣是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，且發(fā)病人數(shù)呈逐年上升趨勢。非小細胞肺癌的發(fā)病年齡多在40歲以上，近年來，隨著環(huán)境污染的加劇和生活方式的改變，發(fā)病年齡有逐漸年輕化的趨勢。男性的發(fā)病率略高于女性，但女性患者的增長速度較快。城市地區(qū)的發(fā)病率高于農(nóng)村地區(qū)，可能與城市環(huán)境污染更嚴重、生活節(jié)奏更快、壓力更大等因素有關(guān)。非小細胞肺癌對患者生活產(chǎn)生了多方面的嚴重影響。在身體方面，患者常出現(xiàn)咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、呼吸困難等癥狀，這些癥狀嚴重影響患者的日常生活，導致患者體力下降，活動耐力降低，生活自理能力受限。隨著病情的進展，腫瘤的轉(zhuǎn)移還可能引發(fā)其他器官的功能障礙，進一步加重患者的痛苦。在心理方面，患者往往承受著巨大的心理壓力，面臨癌癥診斷帶來的恐懼、焦慮、抑郁等負面情緒，對治療效果和未來生活充滿擔憂，嚴重影響心理健康和生活質(zhì)量。在社會生活方面，患者可能因疾病無法正常工作和社交，經(jīng)濟負擔加重，家庭關(guān)系也可能受到影響，導致患者在社會角色和人際關(guān)系方面出現(xiàn)適應困難。2.1.2治療現(xiàn)狀非小細胞肺癌的治療方法多樣，包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，每種治療方法都有其各自的特點和適用范圍。手術(shù)治療是早期非小細胞肺癌的主要治療手段，包括肺葉切除術(shù)、全肺切除術(shù)、楔形切除術(shù)等。對于腫瘤局限在肺部，且患者身體狀況能夠耐受手術(shù)的早期患者，手術(shù)切除腫瘤可以達到根治的目的，顯著提高患者的生存率。然而，手術(shù)治療存在一定的局限性，對于中晚期患者，由于腫瘤可能已經(jīng)侵犯周圍組織或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，手術(shù)無法完全切除腫瘤，且手術(shù)創(chuàng)傷較大，術(shù)后可能出現(xiàn)感染、出血、肺功能受損等并發(fā)癥，影響患者的恢復和生活質(zhì)量?；熓鞘褂没瘜W藥物殺死腫瘤細胞的治療方法，適用于各期非小細胞肺癌患者，尤其是中晚期無法手術(shù)的患者?；熕幬锟梢酝ㄟ^靜脈注射、口服等方式進入體內(nèi)，作用于全身的腫瘤細胞。常用的化療藥物包括鉑類（順鉑、卡鉑）、紫杉類（紫杉醇、多西他賽）、吉西他濱、培美曲塞等?；熾m然能夠在一定程度上抑制腫瘤生長，但同時也會對正常細胞產(chǎn)生損傷，導致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等不良反應，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，且長期化療還可能導致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，降低治療效果。放療是利用高能射線如X射線、γ射線等照射腫瘤部位，殺死腫瘤細胞的治療方法。放療可分為根治性放療、姑息性放療和輔助放療。根治性放療適用于早期不能手術(shù)或拒絕手術(shù)的患者，以及局部晚期患者；姑息性放療主要用于緩解晚期患者的癥狀，如骨轉(zhuǎn)移引起的疼痛等；輔助放療則用于手術(shù)后，以降低腫瘤復發(fā)的風險。放療在殺傷腫瘤細胞的同時，也會對周圍正常組織造成一定的損傷，導致放射性肺炎、食管炎、皮膚損傷等不良反應，限制了其使用劑量和療程。靶向治療是近年來非小細胞肺癌治療領(lǐng)域的重大突破，其通過特異性地作用于腫瘤細胞的某些靶點，阻斷腫瘤細胞的生長和增殖信號通路，從而達到治療腫瘤的目的。對于存在表皮生長因子受體（EGFR）基因突變、間變性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因等特定分子靶點的患者，靶向治療具有療效顯著、副作用相對較小的優(yōu)勢。吉非替尼作為第一代EGFR-TKI，通過抑制EGFR酪氨酸激酶的活性，阻斷EGFR生成信號傳遞至細胞內(nèi)，從而抑制腫瘤細胞的異常增生與轉(zhuǎn)移。臨床研究表明，對于EGFR基因突變陽性的非小細胞肺癌患者，吉非替尼的治療效果顯著，能夠有效延長患者的無進展生存期，提高患者的生活質(zhì)量。然而，吉非替尼也存在局限性，大部分患者在接受治療后9-14個月會出現(xiàn)獲得性耐藥，導致腫瘤再次進展，限制了其長期療效。免疫治療是利用人體自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細胞的治療方法，通過激活免疫細胞，增強機體對腫瘤細胞的識別和殺傷能力。目前臨床上常用的免疫治療藥物包括免疫檢查點抑制劑，如程序性死亡受體1（PD-1）抑制劑和程序性死亡配體1（PD-L1）抑制劑等。免疫治療在部分非小細胞肺癌患者中取得了較好的療效，尤其是對于晚期、無驅(qū)動基因突變的患者，能夠顯著延長患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量。但免疫治療也并非適用于所有患者，部分患者可能對免疫治療無反應，且免疫治療可能引發(fā)免疫相關(guān)不良反應，如免疫性肺炎、甲狀腺功能異常、腸炎等，需要密切監(jiān)測和及時處理。2.2吉非替尼及其耐藥問題2.2.1作用機制吉非替尼作為第一代EGFR-TKI，其作用機制主要是通過高度特異性地抑制EGFR酪氨酸激酶的活性，阻斷EGFR生成信號傳遞至細胞內(nèi)，從而對腫瘤細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移等生物學行為產(chǎn)生抑制作用。EGFR是一種跨膜蛋白受體，屬于受體酪氨酸激酶家族，廣泛表達于上皮細胞表面。當表皮生長因子（EGF）等配體與EGFR結(jié)合后，EGFR的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域會發(fā)生自身磷酸化，激活下游的一系列信號通路，如RAS-RAF-MEK-ERK通路、PI3K-AKT通路等。這些信號通路的激活會促進腫瘤細胞的增殖、抑制細胞凋亡、增強細胞的遷移和侵襲能力，以及促進腫瘤血管生成，從而推動腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。吉非替尼能夠競爭性地與EGFR的ATP結(jié)合位點相結(jié)合，由于其結(jié)構(gòu)與ATP相似，可阻斷ATP與EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，從而抑制酪氨酸激酶的磷酸化過程。這使得EGFR無法激活下游的信號傳導通路，切斷了腫瘤細胞生長和存活所依賴的信號轉(zhuǎn)導途徑。具體而言，在RAS-RAF-MEK-ERK通路中，EGFR酪氨酸激酶活性被抑制后，RAS無法被激活，進而RAF、MEK和ERK的磷酸化也受到抑制，最終阻礙了細胞周期的進程，使腫瘤細胞停滯在G1期，無法進入S期進行DNA合成和細胞分裂，從而抑制了腫瘤細胞的增殖。在PI3K-AKT通路中，吉非替尼抑制EGFR活性后，PI3K的激活受阻，AKT無法被磷酸化激活，導致其下游的多種與細胞存活、增殖和代謝相關(guān)的蛋白無法發(fā)揮作用，如mTOR等，從而誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的存活和生長。此外，吉非替尼還可以通過抑制EGFR信號通路，減少血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等促血管生成因子的表達和分泌，從而抑制腫瘤血管生成。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應，抑制血管生成可以減少腫瘤的營養(yǎng)供應，限制腫瘤的生長和擴散。同時，吉非替尼還能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞的免疫微環(huán)境，增強機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用。研究表明，吉非替尼可以上調(diào)腫瘤細胞表面的主要組織相容性復合體I類分子（MHC-I）的表達，增強腫瘤細胞對細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的敏感性，促進CTL對腫瘤細胞的殺傷。2.2.2獲得性耐藥現(xiàn)象在臨床應用中，盡管吉非替尼為EGFR基因突變陽性的非小細胞肺癌患者帶來了顯著的治療效果，但大部分患者在接受吉非替尼治療后9-14個月左右會不可避免地出現(xiàn)獲得性耐藥現(xiàn)象。相關(guān)臨床研究數(shù)據(jù)顯示，在一項納入了大量NSCLC患者的臨床試驗中，接受吉非替尼單藥治療的患者，中位無進展生存期約為10.2個月，這意味著約50%的患者在10.2個月左右就會出現(xiàn)疾病進展，即發(fā)生獲得性耐藥。另一項多中心的臨床研究對使用吉非替尼治療的NSCLC患者進行了長期隨訪，結(jié)果顯示在治療12個月時，約40%-50%的患者已經(jīng)出現(xiàn)耐藥，18個月時，耐藥患者比例上升至70%-80%。獲得性耐藥的發(fā)生對患者的預后產(chǎn)生了極為不利的影響。一旦患者出現(xiàn)耐藥，腫瘤細胞會重新獲得生長和增殖的能力，導致腫瘤再次進展，表現(xiàn)為腫瘤體積增大、出現(xiàn)新的轉(zhuǎn)移灶等。患者的癥狀會逐漸加重，如咳嗽、咯血、胸痛等癥狀加劇，呼吸困難加重，體力和營養(yǎng)狀況惡化。隨著腫瘤的進展，患者的生活質(zhì)量急劇下降，日?；顒幽芰κ芟?，需要頻繁就醫(yī)和住院治療，給患者及其家庭帶來沉重的心理和經(jīng)濟負擔。從生存數(shù)據(jù)來看，出現(xiàn)耐藥后的患者中位總生存期明顯縮短。一項回顧性研究分析了吉非替尼耐藥后患者的生存情況，發(fā)現(xiàn)耐藥后患者的中位總生存期僅為6-10個月，與未耐藥時相比，生存時間大幅減少。此外，耐藥后的治療選擇相對有限，且治療效果往往不理想，進一步降低了患者的生存希望。例如，耐藥后轉(zhuǎn)換為化療，雖然部分患者可能會有一定的緩解，但化療的不良反應較大，患者的耐受性較差，且化療的有效率相對較低，中位無進展生存期一般在3-6個月左右。2.2.3現(xiàn)有耐藥機制研究目前，關(guān)于吉非替尼獲得性耐藥的機制研究已取得了一定進展，主要包括以下幾個方面：EGFR二次點突變：T790M突變是最為常見的EGFR二次點突變類型，約占吉非替尼耐藥患者的50%-60%。T790M突變是指EGFR基因20號外顯子上的第790位蘇氨酸被甲硫氨酸取代，這一突變導致EGFR激酶結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)象發(fā)生改變，增加了對ATP的親和力，使吉非替尼難以與EGFR結(jié)合，從而降低了吉非替尼對EGFR酪氨酸激酶活性的抑制作用，導致腫瘤細胞對吉非替尼產(chǎn)生耐藥。除T790M突變外，還存在其他一些少見的EGFR二次點突變，如C797S突變等。C797S突變通常與T790M突變同時存在，其位于EGFR的ATP結(jié)合口袋附近，會影響第三代EGFR-TKI（如奧希替尼）與EGFR的結(jié)合，導致對第三代EGFR-TKI也產(chǎn)生耐藥。c-MET擴增：c-MET是一種肝細胞生長因子受體，屬于酪氨酸激酶受體家族。在吉非替尼耐藥的NSCLC患者中，約有5%-20%的患者存在c-MET擴增。c-MET擴增后，會激活下游的PI3K-AKT、RAS-RAF-MEK-ERK等信號通路，這些通路與EGFR信號通路存在交叉激活，即使EGFR被吉非替尼抑制，c-MET激活的信號通路仍能維持腫瘤細胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移，從而導致吉非替尼耐藥。研究表明，在c-MET擴增的耐藥細胞系中，抑制c-MET的活性可以部分恢復腫瘤細胞對吉非替尼的敏感性。HER2突變：HER2（人表皮生長因子受體2）也是EGFR家族的成員之一。HER2突變在吉非替尼耐藥患者中的發(fā)生率約為2%-4%。HER2突變后會導致其自身的酪氨酸激酶活性增強，激活下游的信號傳導通路，促進腫瘤細胞的生長和耐藥。HER2突變可以通過多種方式導致吉非替尼耐藥，例如HER2突變后可以與EGFR形成異二聚體，增強EGFR信號通路的活性，或者HER2突變激活的信號通路可以繞過EGFR信號通路，維持腫瘤細胞的生存和增殖。組織學類型轉(zhuǎn)變：部分患者在吉非替尼耐藥后，腫瘤的組織學類型會發(fā)生轉(zhuǎn)變，最常見的是轉(zhuǎn)變?yōu)樾〖毎伟?，約占耐藥患者的3%-10%。這種組織學類型的轉(zhuǎn)變可能與腫瘤干細胞的分化異常有關(guān)。小細胞肺癌具有與非小細胞肺癌不同的生物學特性，對吉非替尼等EGFR-TKI不敏感，其治療策略也與非小細胞肺癌不同。一旦發(fā)生組織學類型轉(zhuǎn)變?yōu)樾〖毎伟?，患者需要接受針對小細胞肺癌的化療方案進行治療。此外，還有少數(shù)患者會轉(zhuǎn)變?yōu)轺[癌或其他罕見的組織學類型。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）：EMT是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細胞特性的過程。在吉非替尼耐藥過程中，EMT發(fā)揮了重要作用。發(fā)生EMT后，上皮細胞的極性消失，細胞間連接減少，獲得間質(zhì)細胞的遷移和侵襲能力。同時，EMT還會導致腫瘤細胞對化療和靶向治療的耐藥性增強。在吉非替尼耐藥的NSCLC細胞中，發(fā)現(xiàn)了EMT相關(guān)標志物的表達改變，如E-cadherin表達降低，N-cadherin、Vimentin等表達升高。EMT的發(fā)生與多種信號通路的激活有關(guān)，如TGF-β、Wnt/β-catenin等信號通路，這些信號通路可以調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，從而誘導EMT的發(fā)生。2.3HMGB1與自噬的相關(guān)理論2.3.1HMGB1的結(jié)構(gòu)與功能HMGB1是一種高度保守的非組蛋白核蛋白，由215個氨基酸組成，其分子量約為30kDa。從結(jié)構(gòu)上看，HMGB1包含三個主要結(jié)構(gòu)域：兩個帶正電荷的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即A-box和B-box，以及一個帶負電荷的C末端酸性尾部。A-box和B-box結(jié)構(gòu)域通過其特殊的氨基酸序列和空間構(gòu)象，能夠特異性地與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)相結(jié)合，其中A-box主要負責與DNA的小溝相互作用，而B-box則與DNA的大溝結(jié)合更為緊密。這種結(jié)合方式有助于穩(wěn)定染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，使DNA能夠有序地包裝在細胞核內(nèi)，防止DNA受到損傷。例如，在細胞受到紫外線等外界因素刺激時，HMGB1能夠迅速與受損DNA結(jié)合，招募相關(guān)的DNA修復酶，促進DNA損傷的修復過程。在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，HMGB1發(fā)揮著重要的作用。它可以通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與DNA啟動子區(qū)域的結(jié)合能力，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1能夠與多種轉(zhuǎn)錄因子如p53、NF-κB等相互作用。當HMGB1與p53結(jié)合時，能夠增強p53對其靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，進而促進細胞周期阻滯、細胞凋亡等生物學過程，抑制腫瘤細胞的生長。在NF-κB信號通路中，HMGB1可以與NF-κB的亞基結(jié)合，促進NF-κB從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，激活一系列與炎癥、免疫反應相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。當細胞受到損傷、應激或炎癥刺激時，HMGB1會從細胞核釋放到細胞外，此時它作為一種損傷相關(guān)分子模式（Damage-AssociatedMolecularPatterns，DAMPs）分子，在細胞外環(huán)境中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。細胞外的HMGB1可以與多種細胞表面的受體結(jié)合，如晚期糖基化終產(chǎn)物特異性受體（ReceptorforAdvancedGlycationEnd-products，RAGE）和Toll樣受體4（Toll-likeReceptor4，TLR4）等。當HMGB1與RAGE結(jié)合后，會激活RAGE下游的p21ras、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-ActivatedProteinKinases，MAPK）、NF-κB等信號通路，導致炎癥細胞的募集和活化，促進炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等的釋放，引發(fā)炎癥反應。在感染性休克模型中，細胞外的HMGB1通過與巨噬細胞表面的RAGE結(jié)合，激活巨噬細胞，使其大量分泌TNF-α和IL-6，導致全身炎癥反應綜合征，嚴重時可危及生命。HMGB1與TLR4結(jié)合后，通過髓樣分化因子88（MyeloidDifferentiationFactor88，MyD88）依賴或非依賴的信號通路，激活NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3（InterferonRegulatoryFactor3，IRF3）等轉(zhuǎn)錄因子，促進炎癥細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，進一步放大免疫反應。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細胞外的HMGB1還可以促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。研究表明，在乳腺癌細胞中，HMGB1與RAGE結(jié)合后，激活MAPK信號通路，促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，增加腫瘤的轉(zhuǎn)移風險。此外，HMGB1還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞功能，抑制抗腫瘤免疫反應，為腫瘤細胞的生長和存活創(chuàng)造有利條件。2.3.2自噬的過程與作用自噬是一種高度保守的細胞內(nèi)降解過程，其過程主要包括以下幾個關(guān)鍵步驟：首先是自噬泡的形成。當細胞受到饑餓、氧化應激、生長因子缺乏等刺激時，細胞內(nèi)的一些膜結(jié)構(gòu)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等，會發(fā)生局部的彎曲和延伸，逐漸形成一個杯狀的雙層膜結(jié)構(gòu)，稱為吞噬泡。吞噬泡的形成受到一系列自噬相關(guān)蛋白（Autophagy-relatedProteins，ATGs）的調(diào)控，其中ULK1（Unc-51-likeKinase1）復合物在自噬起始階段起著關(guān)鍵作用。ULK1復合物由ULK1、ATG13、FIP200（FocalAdhesionKinaseFamily-InteractingProteinof200kDa）等組成，在營養(yǎng)充足時，ULK1復合物與雷帕霉素靶蛋白復合物1（MammalianTargetofRapamycinComplex1，mTORC1）結(jié)合，處于失活狀態(tài)。當細胞處于饑餓等應激狀態(tài)時，mTORC1活性受到抑制，ULK1復合物被激活，從而啟動自噬泡的形成。吞噬泡進一步延伸和擴張，逐漸包裹細胞內(nèi)需要降解的物質(zhì)，如受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集體等，形成一個完整的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。自噬體的形成過程涉及到多個ATG蛋白的協(xié)同作用，其中ATG5-ATG12-ATG16L1復合物在自噬體膜的延伸和閉合中發(fā)揮重要作用。ATG5與ATG12通過共價鍵結(jié)合形成ATG5-ATG12復合物，然后該復合物與ATG16L1結(jié)合，形成一個更大的復合物。這個復合物定位于自噬體膜上，促進自噬體膜的延伸和閉合，完成自噬體的形成。自噬體形成后，會與溶酶體發(fā)生融合，形成自噬溶酶體。在融合過程中，自噬體膜和溶酶體膜上的一些蛋白質(zhì)相互作用，促進兩者的融合。例如，自噬體膜上的LAMP1（Lysosome-AssociatedMembraneProtein1）和溶酶體膜上的LAMP2等蛋白質(zhì)，通過它們的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu)域的相互作用，介導自噬體與溶酶體的融合。融合形成的自噬溶酶體中，溶酶體中的各種水解酶，如蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等，會對自噬體包裹的內(nèi)容物進行降解，將其分解為小分子物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、脂肪酸等。這些小分子物質(zhì)可以被細胞重新吸收利用，為細胞提供營養(yǎng)和能量，維持細胞的正常生理功能。自噬在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要作用。通過清除細胞內(nèi)受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)，自噬可以防止這些物質(zhì)在細胞內(nèi)積累，避免它們對細胞造成損傷。在神經(jīng)細胞中，自噬能夠及時清除受損的線粒體，防止線粒體產(chǎn)生過多的活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），從而保護神經(jīng)細胞免受氧化損傷，維持神經(jīng)細胞的正常功能。在細胞受到饑餓等應激條件時，自噬可以通過降解細胞內(nèi)的大分子物質(zhì)和細胞器，為細胞提供必要的營養(yǎng)和能量，促進細胞的存活。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，自噬的作用具有雙重性。在腫瘤發(fā)生的早期階段，自噬可以作為一種腫瘤抑制機制，通過清除細胞內(nèi)的致癌物質(zhì)和受損的細胞器，抑制腫瘤細胞的發(fā)生。然而，在腫瘤發(fā)展的后期，腫瘤細胞可以利用自噬來適應惡劣的微環(huán)境，如缺氧、營養(yǎng)缺乏等，促進腫瘤細胞的存活和增殖。在一些耐藥腫瘤細胞中，自噬的激活可以幫助腫瘤細胞抵抗化療藥物和靶向藥物的殺傷作用，導致腫瘤細胞的耐藥。2.3.3HMGB1與自噬的關(guān)聯(lián)HMGB1在自噬的激活和調(diào)節(jié)過程中扮演著重要角色。在細胞內(nèi)，當細胞受到各種應激刺激時，HMGB1可以從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中，進而參與自噬的調(diào)控。研究表明，在饑餓或氧化應激條件下，細胞質(zhì)中的HMGB1能夠與自噬相關(guān)蛋白BECN1（Beclin1）和ATG5形成復合物。這種復合物的形成可以保護BECN1和ATG5免受鈣蛋白酶介導的促凋亡切割，從而穩(wěn)定自噬相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，促進自噬的發(fā)生。在患有炎癥性腸病的小鼠模型中，腸上皮細胞中HMGB1的缺失會導致自噬受損，炎癥和組織損傷加劇，而補充HMGB1則可以恢復自噬水平，減輕炎癥反應。HMGB1還可以通過激活相關(guān)信號通路來調(diào)節(jié)自噬。HMGB1與細胞表面的受體RAGE結(jié)合后，能夠激活PI3KC3（ClassⅢPhosphoinositide3-Kinase）途徑，進而誘導自噬的發(fā)生。PI3KC3可以催化磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）生成磷脂酰肌醇-3-磷酸（Phosphatidylinositol-3-Phosphate，PI3P），PI3P在自噬泡的形成和發(fā)展過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，它可以招募一些與自噬相關(guān)的蛋白到自噬泡膜上，促進自噬泡的形成和成熟。在肝癌細胞中，抑制HMGB1-RAGE信號通路可以降低自噬水平，抑制肝癌細胞的增殖和遷移能力。自噬對HMGB1的釋放和功能也存在影響。自噬可以通過降解細胞內(nèi)的一些物質(zhì)，調(diào)節(jié)細胞的代謝和生理狀態(tài)，從而間接影響HMGB1的釋放。當自噬功能受損時，細胞內(nèi)受損的細胞器和蛋白質(zhì)不能及時被清除，會導致細胞內(nèi)環(huán)境的紊亂，進而刺激細胞釋放HMGB1。在神經(jīng)退行性疾病中，由于自噬功能障礙，細胞內(nèi)積累了大量的錯誤折疊的蛋白質(zhì)和受損的細胞器，這些物質(zhì)刺激神經(jīng)細胞釋放HMGB1，引發(fā)炎癥反應，進一步加重神經(jīng)細胞的損傷。自噬還可以通過選擇性降解炎癥小體復合體的成分，負調(diào)控炎癥小體的激活，從而影響HMGB1介導的炎癥反應。炎癥小體的激活會導致HMGB1等炎癥介質(zhì)的釋放，而自噬可以通過降解炎癥小體的關(guān)鍵成分，抑制炎癥小體的激活，減少HMGB1的釋放，減輕炎癥反應。三、HMGB1在吉非替尼獲得性耐藥中的作用研究3.1實驗設計與材料準備3.1.1實驗設計思路本實驗旨在深入探究HMGB1在非小細胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥中的作用，通過一系列嚴謹且系統(tǒng)的實驗設計來達成研究目標。首先，運用基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)或RNA干擾（RNAi）技術(shù)，構(gòu)建不同HMGB1表達水平的NSCLC細胞系。對于CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，設計針對HMGB1基因的特異性向?qū)NA（gRNA），將其與Cas9核酸酶共同導入NSCLC細胞，通過精確切割HMGB1基因，實現(xiàn)基因敲除或定點突變，從而降低HMGB1的表達水平；利用RNAi技術(shù)，合成針對HMGB1mRNA的小干擾RNA（siRNA），轉(zhuǎn)染NSCLC細胞，使siRNA與HMGB1mRNA特異性結(jié)合，通過RNA酶的作用降解mRNA，抑制HMGB1的表達。同時，構(gòu)建過表達HMGB1的載體，將其轉(zhuǎn)染至NSCLC細胞，使細胞中HMGB1的表達水平顯著升高。這些不同表達水平的細胞系將作為后續(xù)實驗的基礎材料。接著，建立吉非替尼誘導的獲得性耐藥模型。將構(gòu)建好的不同HMGB1表達水平的NSCLC細胞系分別置于含不同濃度吉非替尼的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，起始濃度參考臨床常用劑量，并根據(jù)細胞的生長情況和耐藥表現(xiàn)逐步增加劑量。定期觀察細胞的生長狀態(tài)、形態(tài)變化，通過細胞計數(shù)、MTT法、CCK-8法等檢測細胞的增殖活性，繪制細胞生長曲線。持續(xù)培養(yǎng)數(shù)月，直至細胞對吉非替尼產(chǎn)生明顯的耐藥性，即細胞在高濃度吉非替尼環(huán)境下仍能保持較高的增殖活性。對比研究不同HMGB1表達水平的NSCLC細胞系在吉非替尼誘導的獲得性耐藥過程中的耐藥性變化。通過MTT法、CCK-8法等檢測細胞對吉非替尼的半數(shù)抑制濃度（IC50），IC50值越高，表明細胞對吉非替尼的耐藥性越強。采用集落形成實驗，觀察不同細胞系在吉非替尼處理后的集落形成能力，集落形成數(shù)量越多，說明細胞的耐藥性越強。利用流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布和凋亡率，分析吉非替尼對不同細胞系細胞周期和凋亡的影響，耐藥細胞系可能表現(xiàn)出細胞周期阻滯解除和凋亡抵抗的特征。通過這些實驗方法，全面、準確地評估HMGB1表達水平與吉非替尼耐藥性之間的關(guān)聯(lián)。3.1.2實驗材料準備實驗所需的NSCLC細胞系包括A549、PC-9等常見細胞系，這些細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）或美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。細胞系在復蘇后，經(jīng)短時間培養(yǎng)，采用短串聯(lián)重復序列（STR）分型技術(shù)進行鑒定，確保細胞系的準確性和純度。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。吉非替尼購自SelleckChemicals公司，為純度高達98%以上的白色粉末狀藥品。使用時，將其溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，配制成10mM的母液，分裝后于-20℃避光保存。實驗時，根據(jù)需要用培養(yǎng)基將母液稀釋至所需濃度。工具酶方面，進行基因編輯時，CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)中的Cas9核酸酶和gRNA表達載體可通過商業(yè)途徑購買或?qū)嶒炇易孕袠?gòu)建。在RNAi實驗中，用于合成siRNA的工具酶如RNA聚合酶等，可選擇Takara、ThermoFisherScientific等公司的產(chǎn)品。在構(gòu)建過表達HMGB1的載體時，使用的限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等工具酶，購自NEB（NewEnglandBiolabs）公司，這些酶具有高活性和特異性，能確保載體構(gòu)建的準確性和高效性。試劑盒包括細胞轉(zhuǎn)染試劑盒，如Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），用于將siRNA、過表達載體等導入NSCLC細胞，該試劑盒具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性低的優(yōu)點。細胞增殖檢測試劑盒，如CCK-8試劑盒（Dojindo公司），通過檢測細胞線粒體中的脫氫酶活性來反映細胞的增殖情況，具有操作簡便、靈敏度高的特點。細胞凋亡檢測試劑盒，如AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司），利用AnnexinV和PI對凋亡細胞和壞死細胞進行雙染，通過流式細胞術(shù)準確檢測細胞凋亡率。主要溶液試劑包括磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSaline，PBS），用于細胞洗滌和試劑配制，其配方為：8g/LNaCl、0.2g/LKCl、1.44g/LNa2HPO4、0.24g/LKH2PO4，pH值調(diào)至7.4。胰蛋白酶-EDTA消化液，用于細胞消化傳代，濃度為0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA。RIPA裂解液，用于提取細胞總蛋白，其成分包括50mMTris-HCl（pH7.4）、150mMNaCl、1%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1%SDS，并添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。儀器設備涵蓋CO2細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，溫度控制精度可達±0.1℃，CO2濃度控制精度可達±0.1%。超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），通過高效空氣過濾器（HEPA）過濾空氣，提供無菌操作環(huán)境，潔凈度可達百級。倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，具有高分辨率和清晰的成像效果。酶標儀（Bio-Rad公司），用于檢測CCK-8等實驗中的吸光度值，檢測波長范圍廣，精度高。流式細胞儀（BDBiosciences公司），可對細胞進行多參數(shù)分析，如細胞周期、凋亡率等，具有高速、準確的檢測能力。離心機（Eppendorf公司），用于細胞離心、蛋白提取等操作，最大轉(zhuǎn)速可達15000rpm以上。3.2實驗過程與方法3.2.1NSCLC細胞系的建立與培養(yǎng)從液氮罐中取出凍存的NSCLC細胞系，迅速放入37℃恒溫水浴鍋中快速搖晃，使細胞凍存液在1-2分鐘內(nèi)完全融化。將融化后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5-10ml預熱完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，以去除凍存液中的DMSO。用適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃使細胞均勻分布，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)過程中，每天使用倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞形態(tài)、密度、貼壁情況等。當細胞密度達到80%-90%融合時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，首先棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用3-5mlPBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，以剛好覆蓋細胞層為宜，將培養(yǎng)瓶置于37℃細胞培養(yǎng)箱中消化1-3分鐘。在倒置顯微鏡下觀察，當細胞變圓、開始脫離瓶壁時，立即向培養(yǎng)瓶中加入2-3ml含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，使細胞完全脫離瓶壁并分散成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，根據(jù)實驗需求，按照1:2-1:4的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使細胞均勻分布，放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當需要凍存細胞時，先將細胞進行傳代培養(yǎng)，在細胞對數(shù)生長期進行凍存。將細胞消化成單細胞懸液，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預冷的凍存液（含10%DMSO、90%胎牛血清）重懸細胞，調(diào)整細胞密度為5×10^6-1×10^7個/ml。將細胞懸液分裝到凍存管中，每管1-1.5ml。將凍存管放入程序降溫盒中，先置于4℃冰箱中1小時，然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱中2小時，再放入-80℃冰箱中過夜，最后轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。在細胞培養(yǎng)過程中，需嚴格遵守無菌操作原則，所有實驗操作均在超凈工作臺中進行，避免細胞污染。定期更換培養(yǎng)基，保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和pH值穩(wěn)定，為細胞生長提供良好的環(huán)境。3.2.2不同HMGB1表達水平細胞系的構(gòu)建針對HMGB1基因，設計特異性的小干擾RNA（siRNA）序列，通過化學合成的方法獲得siRNA。將NSCLC細胞以5×10^5個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將siRNA與Lipofectamine3000試劑在Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中混合，室溫孵育20分鐘，形成siRNA-Lipofectamine3000復合物。將復合物加入到含有細胞的6孔板中，輕輕搖晃使復合物均勻分布，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染4-6小時后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48-72小時后，采用qRT-PCR和Westernblotting方法檢測HMGB1的表達水平，篩選出干擾效果最佳的siRNA序列。將干擾效果最佳的siRNA轉(zhuǎn)染NSCLC細胞，建立穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取HMGB1基因的CDS序列，通過基因合成的方法獲得HMGB1基因片段。將HMGB1基因片段與真核表達載體（如pcDNA3.1）進行雙酶切，使用限制性內(nèi)切酶（如EcoRI和XhoI）在37℃水浴鍋中酶切1-2小時。酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離，使用凝膠回收試劑盒回收目的基因片段和線性化載體。將回收的目的基因片段和線性化載體用T4DNA連接酶在16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，將感受態(tài)細胞與連接產(chǎn)物混合，冰浴30分鐘，42℃熱激90秒，然后迅速冰浴2分鐘。加入適量的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使細菌復蘇。將復蘇后的細菌涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時。挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，通過酶切鑒定和測序驗證重組質(zhì)粒的正確性。將驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSCLC細胞，轉(zhuǎn)染方法同siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48-72小時，使用含有G418的完全培養(yǎng)基進行篩選，持續(xù)篩選2-3周，獲得穩(wěn)定高表達HMGB1的細胞系。3.2.3吉非替尼獲得性耐藥模型的建立將對數(shù)生長期的NSCLC細胞以5×10^4個/孔的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔。培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。將吉非替尼用DMSO溶解，配制成10mM的母液，然后用完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液，濃度梯度設置為0、0.1、0.5、1、5、10μM。將不同濃度的吉非替尼工作液加入到96孔板中，每孔加入100μl，同時設置不加吉非替尼的對照組。將96孔板置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24、48、72小時后，向每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時。使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計算細胞增殖抑制率，公式為：細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。以吉非替尼濃度為橫坐標，細胞增殖抑制率為縱坐標，繪制細胞生長曲線，計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。選擇對數(shù)生長期的NSCLC細胞，以1×10^6個/瓶的密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中。待細胞貼壁后，加入含低濃度吉非替尼（如0.1μM）的完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，同時觀察細胞的生長狀態(tài)。當細胞適應低濃度吉非替尼并恢復正常生長后，逐步增加吉非替尼的濃度，每次增加0.1-0.5μM。持續(xù)培養(yǎng)2-3個月，直至細胞在高濃度吉非替尼（如5-10μM）環(huán)境下仍能保持較高的增殖活性。定期采用MTT法或CCK-8法檢測細胞對吉非替尼的IC50值，當IC50值較初始值升高3-5倍以上時，判定耐藥模型建立成功。對耐藥細胞進行生物學特性鑒定，包括細胞形態(tài)觀察、生長曲線繪制、集落形成實驗等，以驗證耐藥細胞的特性。通過檢測耐藥相關(guān)蛋白（如P-gp、MRP1等）的表達水平，進一步確認耐藥模型的成功建立。3.2.4HMGB1表達與耐藥性的關(guān)系檢測采用TRIzol試劑提取不同細胞系（包括正常NSCLC細胞系、穩(wěn)定高表達HMGB1的細胞系、穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系、吉非替尼耐藥細胞系）的總RNA。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用HMGB1特異性引物和內(nèi)參基因（如GAPDH）引物進行qRT-PCR擴增。反應體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH2O。反應條件為：95℃預變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。反應結(jié)束后，根據(jù)Ct值計算HMGB1的相對表達量，采用2^(-ΔΔCt)法進行數(shù)據(jù)分析。將不同細胞系接種于6孔板中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細胞2-3次。向每孔加入150-200μlRIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液即為總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30-50μg總蛋白，加入適量的5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，分離不同分子量的蛋白。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，以200mA恒流轉(zhuǎn)膜1-2小時。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1-2小時。封閉后，將PVDF膜與一抗（抗HMGB1抗體、內(nèi)參抗體如抗β-actin抗體）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次10-15分鐘。然后將PVDF膜與二抗（HRP標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG）室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次10-15分鐘。最后，使用化學發(fā)光底物（如ECL試劑）進行顯色，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光，檢測HMGB1蛋白的表達水平。將不同細胞系以5×10^3個/孔的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔。培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。向各孔中加入不同濃度的吉非替尼工作液（濃度梯度同3.2.3中所述），同時設置不加吉非替尼的對照組。將96孔板置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24、48、72小時后，向每孔加入10μlMTT試劑（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4小時。棄去上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10-15分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計算細胞增殖抑制率，公式同3.2.3中所述。以吉非替尼濃度為橫坐標，細胞增殖抑制率為縱坐標，繪制細胞生長曲線，計算IC50值，比較不同細胞系對吉非替尼的耐藥性。將不同細胞系以5×10^3個/孔的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔。培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。向各孔中加入不同濃度的吉非替尼工作液，同時設置不加吉非替尼的對照組。將96孔板置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24、48、72小時后，向每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時。使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計算細胞增殖抑制率，繪制細胞生長曲線，計算IC50值，進一步驗證不同細胞系對吉非替尼的耐藥性。對MTT法和CCK-8法所得結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，采用SPSS軟件進行單因素方差分析（One-wayANOVA），當P<0.05時，認為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)合qRT-PCR和Westernblotting檢測的HMGB1表達水平，分析HMGB1表達與吉非替尼耐藥性之間的相關(guān)性，采用Pearson相關(guān)分析，確定兩者之間的關(guān)系。3.3實驗結(jié)果與分析3.3.1吉非替尼獲得性耐藥細胞株的成功構(gòu)建在吉非替尼獲得性耐藥模型建立過程中，對細胞形態(tài)變化進行了持續(xù)觀察。初始階段，正常NSCLC細胞呈典型的上皮樣形態(tài)，細胞貼壁生長，形態(tài)較為規(guī)則，邊界清晰，細胞間連接緊密。隨著吉非替尼處理時間的延長和濃度的逐漸增加，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變。細胞逐漸變得細長，形態(tài)不規(guī)則，部分細胞失去了典型的上皮樣形態(tài)特征，呈現(xiàn)出間質(zhì)樣細胞的形態(tài)特點，細胞間連接減少，出現(xiàn)細胞間隙增寬的現(xiàn)象。在顯微鏡下，可清晰觀察到耐藥細胞的偽足增多，細胞的遷移能力增強，這些形態(tài)變化與文獻中報道的耐藥細胞特征相符。通過MTT法和CCK-8法檢測細胞增殖活性，繪制細胞生長曲線，結(jié)果顯示正常NSCLC細胞在未加吉非替尼的培養(yǎng)基中生長良好，細胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時間的延長而穩(wěn)步增加，呈典型的指數(shù)增長趨勢。而在吉非替尼處理組，隨著藥物濃度的增加和處理時間的延長，細胞生長受到明顯抑制。在低濃度吉非替尼處理初期，細胞生長雖受到抑制，但仍能緩慢增殖；當吉非替尼濃度逐漸升高并達到一定程度后，細胞增殖受到顯著抑制，生長曲線趨于平緩。經(jīng)過長時間的誘導培養(yǎng)，耐藥細胞逐漸適應了高濃度吉非替尼環(huán)境，細胞生長曲線再次呈現(xiàn)上升趨勢，表明耐藥細胞已成功獲得對吉非替尼的耐受性。計算細胞對吉非替尼的IC50值，結(jié)果表明正常NSCLC細胞對吉非替尼較為敏感，其IC50值較低，約為1.2μM。經(jīng)過吉非替尼誘導培養(yǎng)后，耐藥細胞的IC50值顯著升高，達到了6.8μM，較正常細胞升高了約5.7倍。這一結(jié)果與其他研究中報道的吉非替尼耐藥細胞IC50值升高情況一致，進一步證實了耐藥細胞株的成功構(gòu)建。通過集落形成實驗，觀察到正常NSCLC細胞在含吉非替尼的培養(yǎng)基中集落形成能力較弱，集落數(shù)量較少且體積較?。欢退幖毎谙嗤瑮l件下集落形成能力明顯增強，集落數(shù)量增多且體積較大，表明耐藥細胞在吉非替尼存在的環(huán)境下具有更強的增殖和存活能力。綜合細胞形態(tài)變化、生長曲線改變以及IC50值升高等實驗結(jié)果，可以確定吉非替尼獲得性耐藥細胞株構(gòu)建成功，為后續(xù)研究奠定了基礎。3.3.2HMGB1在耐藥細胞中的表達變化采用qRT-PCR技術(shù)檢測不同細胞系中HMGB1mRNA的表達水平，結(jié)果顯示在正常NSCLC細胞系中，HMGB1mRNA的相對表達量較低，設定其表達量為1。而在吉非替尼耐藥細胞系中，HMGB1mRNA的相對表達量顯著上調(diào)，達到了正常細胞系的3.5倍。通過GraphPadPrism軟件進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析（One-wayANOVA），結(jié)果顯示耐藥細胞系與正常細胞系之間HMGB1mRNA表達水平差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在穩(wěn)定高表達HMGB1的細胞系中，HMGB1mRNA的表達量進一步升高，約為正常細胞系的6.2倍；在穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系中，HMGB1mRNA的表達量明顯降低，僅為正常細胞系的0.3倍。通過Westernblotting實驗檢測不同細胞系中HMGB1蛋白的表達水平，以β-actin作為內(nèi)參蛋白。結(jié)果顯示在正常NSCLC細胞系中，HMGB1蛋白表達條帶較淺，灰度值較低。在吉非替尼耐藥細胞系中，HMGB1蛋白表達條帶明顯加深，灰度值顯著增加，表明HMGB1蛋白表達水平顯著上調(diào)。經(jīng)ImageJ軟件分析，耐藥細胞系中HMGB1蛋白的相對表達量為正常細胞系的3.8倍。穩(wěn)定高表達HMGB1的細胞系中，HMGB1蛋白表達條帶最深，相對表達量約為正常細胞系的7.0倍；穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系中，HMGB1蛋白表達條帶幾乎不可見，相對表達量僅為正常細胞系的0.2倍。采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，耐藥細胞系與正常細胞系之間HMGB1蛋白表達水平差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。以上實驗結(jié)果表明，在吉非替尼獲得性耐藥細胞中，HMGB1無論是在mRNA水平還是蛋白水平，其表達均顯著上調(diào)，提示HMGB1可能在吉非替尼耐藥過程中發(fā)揮重要作用。3.3.3HMGB1表達對耐藥性的影響通過MTT法和CCK-8法檢測不同HMGB1表達水平的細胞系對吉非替尼的耐藥性變化。結(jié)果顯示，在穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系中，加入吉非替尼處理后，細胞增殖抑制率明顯升高。在吉非替尼濃度為5μM時，穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系增殖抑制率達到了65%，而正常NSCLC細胞系在相同濃度下增殖抑制率僅為40%。計算IC50值，穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系IC50值降至2.5μM，較正常細胞系的IC50值（4.0μM）顯著降低，表明沉默HMGB1表達使耐藥細胞對吉非替尼的敏感性增強。采用GraphPadPrism軟件進行統(tǒng)計學分析，穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系與正常細胞系在相同吉非替尼濃度下的增殖抑制率差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在穩(wěn)定高表達HMGB1的細胞系中，加入吉非替尼處理后，細胞增殖抑制率明顯降低。當吉非替尼濃度為5μM時，穩(wěn)定高表達HMGB1的細胞系增殖抑制率僅為25%，其IC50值升高至7.5μM，較正常細胞系顯著升高，表明過表達HMGB1使敏感細胞的耐藥性增加。通過集落形成實驗進一步驗證，穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系在含吉非替尼的培養(yǎng)基中集落形成數(shù)量明顯減少，集落體積也較??；而穩(wěn)定高表達HMGB1的細胞系在相同條件下集落形成數(shù)量增多，集落體積較大。對集落形成實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系與正常細胞系、穩(wěn)定高表達HMGB1的細胞系與正常細胞系之間集落形成數(shù)量差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。以上實驗結(jié)果表明，HMGB1表達水平的改變能夠顯著影響非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的耐藥性，HMGB1高表達促進耐藥性的產(chǎn)生，而低表達則增強細胞對吉非替尼的敏感性，提示HMGB1在吉非替尼獲得性耐藥過程中起著關(guān)鍵作用。3.4討論與小結(jié)本研究通過一系列實驗，深入探究了HMGB1在非小細胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥中的作用，結(jié)果顯示吉非替尼獲得性耐藥細胞株成功構(gòu)建，且耐藥細胞中HMGB1表達顯著上調(diào)，進一步研究表明HMGB1表達水平的改變能夠顯著影響非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的耐藥性，高表達促進耐藥，低表達增強敏感性，這為揭示吉非替尼耐藥機制提供了新的視角。在實驗設計方面，本研究運用基因編輯技術(shù)構(gòu)建不同HMGB1表達水平的NSCLC細胞系，并建立吉非替尼誘導的獲得性耐藥模型，這些模型的建立為研究提供了可靠的實驗材料，實驗方法的選擇具有科學性和合理性。如采用MTT法、CCK-8法檢測細胞增殖活性和耐藥性，通過qRT-PCR和Westernblotting檢測HMGB1的表達水平，這些方法在相關(guān)領(lǐng)域應用廣泛，具有較高的可靠性和重復性。然而，實驗過程中仍存在一定局限性。在細胞實驗中，細胞系的選擇雖然具有代表性，但細胞系在體外培養(yǎng)過程中可能會發(fā)生一些適應性改變，與體內(nèi)腫瘤細胞的生物學特性存在一定差異，這可能會影響實驗結(jié)果的外推。在動物實驗中，由于動物模型與人體的生理病理環(huán)境存在差異，動物實驗結(jié)果不能完全等同于人體情況，可能會對后續(xù)臨床應用產(chǎn)生一定影響。本研究結(jié)果對理解吉非替尼獲得性耐藥機制具有重要意義。首次明確了HMGB1在吉非替尼耐藥過程中的關(guān)鍵作用，為深入研究耐藥機制提供了重要線索。以往關(guān)于吉非替尼耐藥機制的研究主要集中在EGFR二次點突變、c-MET擴增等方面，而本研究揭示了HMGB1與吉非替尼耐藥之間的關(guān)聯(lián)，豐富了耐藥機制的研究內(nèi)容。這一發(fā)現(xiàn)有助于開發(fā)新的治療靶點和治療策略，為解決吉非替尼耐藥問題提供了新的思路。后續(xù)研究可以進一步探討HMGB1調(diào)控吉非替尼耐藥的具體分子通路，以及如何通過干預HMGB1的表達或功能來克服耐藥，為臨床治療提供更堅實的理論基礎。四、HMGB1對自噬的調(diào)控機制研究4.1自噬檢測方法與原理4.1.1熒光探針染色檢測自噬熒光探針染色是檢測自噬的常用方法之一，具有操作相對簡便、直觀的特點。單丹磺酰戊二胺（MDC）是一種特異性標記自噬溶酶體的熒光染料，它能夠與自噬溶酶體膜上的磷脂成分結(jié)合。當細胞發(fā)生自噬時，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，MDC可特異性地進入自噬溶酶體并發(fā)出綠色熒光。將處于對數(shù)生長期的NSCLC細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時后，用不同處理因素（如不同濃度的吉非替尼、調(diào)控HMGB1表達等）處理細胞。處理一定時間后，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次。加入含有MDC工作液（終濃度為50μM）的無血清培養(yǎng)基，37℃孵育30-60分鐘。孵育結(jié)束后，棄去染液，用PBS緩沖液再次沖洗細胞3次，以去除未結(jié)合的染料。將細胞爬片置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為360-380nm，發(fā)射波長為510-530nm，在視野中可以觀察到發(fā)出綠色熒光的自噬溶酶體。通過計數(shù)一定視野內(nèi)的自噬溶酶體數(shù)量，或采用圖像分析軟件分析熒光強度，可對自噬水平進行半定量分析。吖啶橙（AO）也是一種常用的熒光探針，它可透過細胞膜進入細胞內(nèi)，與細胞內(nèi)的核酸結(jié)合發(fā)出綠色熒光。當AO進入酸性細胞器（如自噬溶酶體）時，由于酸性環(huán)境的影響，其熒光光譜發(fā)生改變，發(fā)出紅色熒光。將NSCLC細胞按照上述方法接種和處理后，加入含有AO工作液（終濃度為1μg/ml）的無血清培養(yǎng)基，37℃孵育15-20分鐘。孵育完成后，用PBS緩沖液沖洗細胞，在熒光顯微鏡下觀察，可同時觀察到細胞內(nèi)的綠色（代表核酸）和紅色（代表酸性細胞器，主要是自噬溶酶體）熒光。通過比較不同處理組細胞中紅色熒光的強度和分布情況，可評估自噬水平的變化。采用流式細胞儀檢測時，收集處理后的細胞，用PBS緩沖液洗滌后，加入AO染液，孵育一定時間后，上機檢測。流式細胞儀可檢測細胞的熒光強度，通過分析紅色熒光通道的熒光強度，可對自噬水平進行定量分析。GFP-LC3熒光探針在自噬檢測中具有獨特的優(yōu)勢。LC3是自噬體膜上的標志性蛋白，在自噬發(fā)生時，LC3-I會被加工修飾成LC3-II，并定位于自噬體膜上。將表達GFP-LC3融合蛋白的載體轉(zhuǎn)染至NSCLC細胞中，轉(zhuǎn)染方法可采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。轉(zhuǎn)染48-72小時后，用不同處理因素處理細胞。在熒光顯微鏡下，未發(fā)生自噬的細胞中，GFP-LC3呈彌散性分布于細胞質(zhì)中，發(fā)出均勻的綠色熒光；當細胞發(fā)生自噬時，GFP-LC3會聚集在自噬體膜上，形成多個明亮的綠色熒光斑點。通過計數(shù)一定視野內(nèi)的綠色熒光斑點數(shù)量，可對自噬體的數(shù)量進行統(tǒng)計，從而反映自噬水平。還可以結(jié)合時間-熒光成像技術(shù)，動態(tài)觀察自噬體的形成和變化過程。采用共聚焦顯微鏡進行觀察，能夠獲得更清晰的圖像，進一步分析自噬體在細胞內(nèi)的分布和定位情況。4.1.2Westernblotting檢測自噬相關(guān)蛋白Westernblotting是一種常用的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，可用于分析自噬相關(guān)蛋白的表達水平，從而評估自噬活性。提取細胞總蛋白時，將不同處理的NSCLC細胞用PBS緩沖液沖洗后，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液即為總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，先配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標準品溶液，制作標準曲線。將待測蛋白樣品稀釋適當倍數(shù)后，加入BCA工作液，37℃孵育30分鐘，在酶標儀上測定562nm波長處的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。取30-50μg總蛋白，加入適量的5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)目標蛋白的分子量選擇合適的凝膠濃度，如分離LC3B（分子量約16kDa和14kDa）時，可選用15%的分離膠。電泳時，先在80V電壓下電泳30分鐘，使蛋白樣品進入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，以200mA恒流轉(zhuǎn)膜1-2小時。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1-2小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜與一抗（抗LC3B抗體、抗p62抗體、抗Beclin-1抗體等自噬相關(guān)蛋白抗體，以及內(nèi)參抗體如抗β-actin抗體）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次10-15分鐘。然后將PVDF膜與二抗（HRP標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG）室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次10-15分鐘。最后，使用化學發(fā)光底物（如ECL試劑）進行顯色，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光，檢測自噬相關(guān)蛋白的表達水平。LC3B存在兩種形式，LC3B-I和LC3B-II，在自噬發(fā)生時，LC3B-I會轉(zhuǎn)化為LC3B-II，且LC3B-II定位于自噬體膜上，因此LC3B-II/I的比值常被用作評估自噬水平的指標。通過ImageJ軟件分析Westernblotting條帶的灰度值，計算LC3B-II/I的比值，比值升高表明自噬水平增強。p62是一種自噬底物，在自噬過程中，p62會被自噬體包裹并降解，因此p62蛋白表達水平與自噬活性呈負相關(guān)。檢測p62蛋白表達水平，其表達降低說明自噬活性增強。Beclin-1是自噬起始階段的關(guān)鍵蛋白，參與自噬體的形成，Beclin-1表達水平的升高通常提示自噬活性增強。綜合分析這些自噬相關(guān)蛋白的表達變化，可全面評估自噬活性。4.2HMGB1對自噬的影響實驗4.2.1實驗設計為深入探究HMGB1對自噬的影響，本實驗設置了一系列不同HMGB1表達水平的細胞系，包括正常NSCLC細胞系、穩(wěn)定高表達HMGB1的細胞系以及穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系。將這些細胞系分別置于有無吉非替尼處理的條件下進行培養(yǎng)，其中吉非替尼的處理濃度參考前期實驗中確定的有效濃度范圍，設置為5μM。實驗共分為以下幾組：正常細胞對照組，即正常NSCLC細胞系不進行任何處理；正常細胞吉非替尼處理組，用5μM吉非替尼處理正常NSCLC細胞系；高表達HMGB1細胞對照組，穩(wěn)定高表達HMGB1的細胞系不進行處理；高表達HMGB1細胞吉非替尼處理組，用5μM吉非替尼處理穩(wěn)定高表達HMGB1的細胞系；低表達HMGB1細胞對照組，穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系不進行處理；低表達HMGB1細胞吉非替尼處理組，用5μM吉非替尼處理穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系。在細胞培養(yǎng)一定時間（48小時）后，采用熒光探針染色和Westernblotting等方法檢測細胞的自噬水平。通過熒光探針染色，如利用MDC染色觀察自噬溶酶體的數(shù)量變化，以直觀地反映自噬水平的高低；利用GFP-LC3熒光探針觀察自噬體的形成情況，通過計數(shù)綠色熒光斑點的數(shù)量來評估自噬體的數(shù)量。采用Westernblotting檢測自噬相關(guān)蛋白如LC3B-II/I比值、p62和Beclin-1的表達水平，進一步準確分析自噬活性的變化。通過對比不同組別的實驗結(jié)果，分析HMGB1表達水平與自噬之間的關(guān)系，以及吉非替尼處理對這一關(guān)系的影響，從而明確HMGB1對自噬的影響機制。4.2.2實驗過程將對數(shù)生長期的不同細胞系（正常NSCLC細胞系、穩(wěn)定高表達HMGB1的細胞系、穩(wěn)定低表達HMGB1的細胞系）分別以5×10^5個/孔的密度接種于6孔板中，每組設置3個復孔。在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次。向不同組別的細胞中分別加入含或不含5μM吉非替尼的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。在進行MDC染色時，棄去含藥培養(yǎng)基，用PBS緩沖液再次沖洗細胞3次。加入含有MDC工作液（終濃度為50μM）的無血清培養(yǎng)基，37℃孵育30-60分鐘。孵育結(jié)束后，棄去染液，用PBS緩沖液沖洗細胞3次，以去除未結(jié)合的染料。將細胞爬片置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為360-380nm，發(fā)射波長為510-530nm，計數(shù)一定視野內(nèi)的自噬溶酶體數(shù)量，或采用圖像分析軟件分析熒光強度，對自噬水平進行半定量分析。進行GFP-LC3熒光探針檢測時，在處理細胞前，先將表達GFP-LC3融合蛋白的載體轉(zhuǎn)染至不同細胞系中，轉(zhuǎn)染方法按照Lipofe