HMGB1：肝臟慢性炎癥與纖維化進(jìn)程中的關(guān)鍵角色與干預(yù)新靶點(diǎn)

HMGB1：肝臟慢性炎癥與纖維化進(jìn)程中的關(guān)鍵角色與干預(yù)新靶點(diǎn)一、引言1.1研究背景與意義肝臟作為人體重要的代謝和解毒器官，對(duì)維持機(jī)體正常生理功能起著關(guān)鍵作用。肝纖維化作為多種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段，嚴(yán)重威脅人類健康。肝纖維化是指細(xì)胞外的基質(zhì)在肝組織內(nèi)過度增生，且增生速度超過降解速度，導(dǎo)致纖維組織沉積，進(jìn)而破壞肝臟的結(jié)構(gòu)和功能。若肝纖維化持續(xù)發(fā)展，會(huì)加重成為肝硬化，使肝臟的解毒、分泌等基本功能遭受巨大影響，正常的肝細(xì)胞因缺氧而變性、壞死，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致肝功能逐漸喪失，甚至誘發(fā)肝癌。慢性炎癥在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色，是纖維化形成的前提及進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)力。持續(xù)的外源性刺激或損傷引發(fā)慢性炎癥，可誘導(dǎo)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積和纖維瘢痕形成，進(jìn)而加劇肝纖維化，甚至可能惡化為肝硬化和肝細(xì)胞癌。病毒、細(xì)菌、膽汁酸、酒精代謝物等肝毒性物質(zhì)均可引發(fā)肝細(xì)胞損傷和死亡，損傷的肝細(xì)胞激活核因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和CC類趨化因子配體2（CCL2）等促炎細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。同時(shí)，細(xì)胞壞死、壞死性凋亡以及細(xì)胞焦亡等形式的肝細(xì)胞死亡也會(huì)伴隨大量炎癥介質(zhì)的釋放，加劇炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步激活肝星狀細(xì)胞（HSC）和庫(kù)普弗細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞），從而引發(fā)肝纖維化。研究表明，非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者肝細(xì)胞的死亡程度與肝纖維化的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。高遷移率族蛋白B1（HighMobilityGroupBox1，HMGB1）是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合蛋白，由215個(gè)氨基酸組成，分子量為25-30kDa，主要存在于腦、肝、肺、心、脾、腎及淋巴組織中。正常情況下，HMGB1在細(xì)胞核內(nèi)作為分子伴侶與DNA結(jié)合，參與維持穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)、促進(jìn)DNA折疊、翻譯、復(fù)制與損傷修復(fù)等重要活動(dòng)。然而，當(dāng)細(xì)胞受到損傷或處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，HMGB1會(huì)釋放到細(xì)胞外，作為一種損傷相關(guān)模式分子（Damage-AssociatedMolecularPatterns，DAMPs），與晚期糖基化終產(chǎn)物受體（ReceptorforAdvancedGlycationEndProducts，RAGE）、Toll樣受體（Toll-LikeReceptors，TLRs）等細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活免疫系統(tǒng)，誘發(fā)組織炎性因子釋放及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，使組織持續(xù)處于炎性損傷狀態(tài)。近年來，HMGB1在肝臟疾病中的研究備受關(guān)注，其在肝纖維化進(jìn)程中的作用逐漸成為研究熱點(diǎn)。壞死的肝細(xì)胞分泌的HMGB1能夠與TLR4、TLR9結(jié)合，激活NF-κB信號(hào)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，還可與單鏈DNA、脂多糖（LPS）、IL-1β等其他炎癥因子形成復(fù)合物，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。HMGB1對(duì)中性粒細(xì)胞在肝損傷部位的募集也有一定的影響。更為重要的是，HMGB1能夠激活HSC，促進(jìn)α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）生成并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)，增加細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，從而加重肝纖維化。深入研究HMGB1在肝臟慢性炎癥與纖維化中的作用機(jī)制，不僅有助于揭示肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，還可能為肝纖維化的臨床診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與方法本研究旨在深入探究高遷移率族蛋白B1（HMGB1）在肝臟慢性炎癥與纖維化過程中的具體作用及其潛在機(jī)制，并評(píng)估HMGB1抑制劑對(duì)肝纖維化的治療效果，為肝纖維化的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究擬采用以下研究方法：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選取健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如小鼠或大鼠，構(gòu)建肝纖維化動(dòng)物模型。采用經(jīng)典的四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)法，通過腹腔注射一定濃度和劑量的CCl4，每周2-3次，持續(xù)數(shù)周，誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生。同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組，給予等量的溶劑（如橄欖油）腹腔注射。實(shí)驗(yàn)過程中，定期觀察動(dòng)物的一般狀態(tài)，包括飲食、體重、活動(dòng)等情況。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死動(dòng)物，采集肝臟組織和血液樣本。對(duì)肝臟組織進(jìn)行病理切片，通過蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色，觀察肝臟組織的病理變化，評(píng)估肝纖維化程度；采用免疫組織化學(xué)染色或免疫熒光染色技術(shù)，檢測(cè)肝臟組織中HMGB1、α-SMA、CollagenI等蛋白的表達(dá)水平，分析其與肝纖維化程度的相關(guān)性；通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清中ALT、AST、TNFα、IL-6等炎癥因子和肝纖維化指標(biāo)（如HA、LN、PCIII等）的含量，評(píng)估肝臟的損傷程度和炎癥狀態(tài)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：分離和培養(yǎng)原代肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞（HSC）和庫(kù)普弗細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞）。采用不同濃度的HMGB1刺激細(xì)胞，觀察細(xì)胞的增殖、活化和凋亡情況。利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；通過免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)α-SMA、CollagenI、NF-κB、p-NF-κB等蛋白的表達(dá)，探究HMGB1對(duì)HSC活化和炎癥信號(hào)通路的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，分析HMGB1對(duì)肝細(xì)胞和HSC凋亡的影響。此外，還可利用RNA干擾技術(shù)（RNAi）或基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）敲低或敲除細(xì)胞中的HMGB1基因，觀察細(xì)胞功能和信號(hào)通路的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證HMGB1的作用機(jī)制。分子生物學(xué)技術(shù)：運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，如HMGB1、RAGE、TLRs、TNFα、IL-6、α-SMA、CollagenI等，分析其在肝臟慢性炎癥與纖維化過程中的表達(dá)變化。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞或組織中相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證基因表達(dá)的變化，并深入研究信號(hào)通路的激活情況。利用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)探究HMGB1與其他蛋白之間的相互作用，揭示其在信號(hào)傳導(dǎo)中的作用機(jī)制。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在肝臟疾病領(lǐng)域，HMGB1的研究逐漸成為熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)其在肝臟慢性炎癥與纖維化中的作用開展了大量研究，取得了一系列重要成果。國(guó)外方面，有研究通過構(gòu)建小鼠肝纖維化模型，利用基因敲除或RNA干擾技術(shù)降低HMGB1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，TNFα、IL-6等炎癥因子水平降低，同時(shí)α-SMA、CollagenI等纖維化相關(guān)指標(biāo)也明顯下降，表明HMGB1在肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其可能通過激活炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥細(xì)胞募集和炎癥因子釋放，進(jìn)而推動(dòng)肝纖維化發(fā)展。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，使用重組HMGB1刺激肝星狀細(xì)胞（HSC），發(fā)現(xiàn)HSC的增殖和活化明顯增強(qiáng)，且伴隨著NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1對(duì)HSC的活化作用及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。還有研究關(guān)注到HMGB1的翻譯后修飾，如乙?；⒘姿峄?、氧化和乳酸化等，發(fā)現(xiàn)這些修飾可調(diào)控HMGB1的釋放、定位和活性，影響其在肝臟疾病中的作用，為深入理解HMGB1的功能提供了新視角。國(guó)內(nèi)研究也取得了諸多進(jìn)展。通過對(duì)慢性乙型肝炎患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，血清HMGB1水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)，HMGB1水平越高，肝纖維化分期越嚴(yán)重，提示HMGB1可作為評(píng)估肝纖維化程度的潛在生物標(biāo)志物。在機(jī)制研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)HMGB1與晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）、Toll樣受體（TLRs）等受體結(jié)合后，激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥因子釋放和HSC活化，從而促進(jìn)肝臟慢性炎癥和纖維化的發(fā)展。此外，國(guó)內(nèi)還開展了關(guān)于HMGB1抑制劑的研究，如甜菜堿、二氫楊柳素和乙酰氨基葡萄糖等，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明這些抑制劑能夠有效減緩肝纖維化進(jìn)程，為肝纖維化的治療提供了新的策略和方向。盡管國(guó)內(nèi)外在HMGB1與肝臟慢性炎癥和纖維化的研究中取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。一方面，目前對(duì)于HMGB1在肝臟疾病中的作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是在復(fù)雜的體內(nèi)微環(huán)境中，HMGB1與其他細(xì)胞因子、信號(hào)通路之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)仍有待深入探究。另一方面，雖然HMGB1抑制劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的抗纖維化效果，但從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如藥物的安全性、有效性、最佳給藥劑量和途徑等問題，還需要進(jìn)一步的臨床前和臨床研究來驗(yàn)證。本研究將在前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入探討HMGB1在肝臟慢性炎癥與纖維化中的作用機(jī)制，通過多維度的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，全面分析HMGB1與相關(guān)細(xì)胞因子、信號(hào)通路的相互關(guān)系，并系統(tǒng)評(píng)估HMGB1抑制劑的治療效果和安全性，為肝纖維化的臨床治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和更有效的治療靶點(diǎn)，有望在HMGB1相關(guān)研究領(lǐng)域取得新的突破。二、HMGB1與肝臟慢性炎癥和纖維化的理論基礎(chǔ)2.1HMGB1的結(jié)構(gòu)與功能2.1.1HMGB1的結(jié)構(gòu)特征高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種高度保守的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，在哺乳動(dòng)物中廣泛存在。人類HMGB1由位于13號(hào)染色體上的基因編碼，其蛋白產(chǎn)物由215個(gè)氨基酸組成，分子量約為30kDa。從結(jié)構(gòu)上看，HMGB1包含三個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：兩個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即A盒（氨基酸1-85）和B盒（氨基酸86-163），以及一個(gè)富含酸性氨基酸的C末端結(jié)構(gòu)域（氨基酸164-215）。A盒和B盒具有相似的三維結(jié)構(gòu)，都呈現(xiàn)出L形的折疊方式，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其能夠緊密地與DNA結(jié)合。A盒主要通過識(shí)別和結(jié)合DNA的特定序列，如富含AT的區(qū)域，來參與DNA的相關(guān)活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，A盒與DNA的結(jié)合可以影響DNA的構(gòu)象，促進(jìn)DNA的彎曲和纏繞，從而為其他轉(zhuǎn)錄因子和酶提供合適的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的起始和調(diào)控起到重要作用。B盒則在與DNA的相互作用中發(fā)揮著更為廣泛的功能，它不僅能夠與DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)相互作用，還能與一些損傷的DNA結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，在DNA損傷修復(fù)過程中扮演關(guān)鍵角色。例如，當(dāng)DNA受到紫外線、化學(xué)物質(zhì)等損傷時(shí)，B盒能夠快速識(shí)別損傷位點(diǎn)，并招募相關(guān)的修復(fù)蛋白，啟動(dòng)DNA修復(fù)機(jī)制，確保基因組的穩(wěn)定性。C末端結(jié)構(gòu)域則富含谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸，帶有大量的負(fù)電荷。這一結(jié)構(gòu)域雖然不直接參與DNA的結(jié)合，但它對(duì)HMGB1的整體功能有著重要的調(diào)節(jié)作用。一方面，C末端結(jié)構(gòu)域的負(fù)電荷特性使其能夠與帶正電荷的組蛋白相互作用，調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。研究表明，C末端結(jié)構(gòu)域可以通過與組蛋白H1相互作用，影響核小體的間距和排列方式，從而調(diào)控基因的可及性和轉(zhuǎn)錄活性。另一方面，C末端結(jié)構(gòu)域在HMGB1的細(xì)胞外功能中也發(fā)揮著重要作用，它可以影響HMGB1與細(xì)胞表面受體的結(jié)合親和力和特異性，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。此外，HMGB1還含有三個(gè)保守的半胱氨酸殘基（Cys23、Cys45和Cys106），這些半胱氨酸殘基的氧化還原狀態(tài)對(duì)HMGB1的功能具有重要影響。在不同的氧化還原環(huán)境下，半胱氨酸殘基可以形成不同的二硫鍵或保持還原狀態(tài)，從而使HMGB1呈現(xiàn)出不同的功能形式。例如，完全還原的HMGB1具有趨化活性，能夠吸引免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移；而當(dāng)Cys23和Cys45之間形成二硫鍵時(shí)，HMGB1則表現(xiàn)出細(xì)胞因子活性，能夠激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥因子的釋放。2.1.2HMGB1的細(xì)胞內(nèi)外功能在正常生理狀態(tài)下，HMGB1主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，作為一種重要的DNA結(jié)合蛋白，參與維持染色體的結(jié)構(gòu)和功能。它通過與DNA和組蛋白的相互作用，協(xié)助穩(wěn)定核小體的結(jié)構(gòu)，使DNA能夠緊密地包裝在細(xì)胞核內(nèi)，同時(shí)限制誘變劑和光子等有害物質(zhì)對(duì)DNA的損傷，保護(hù)基因組的完整性。HMGB1在細(xì)胞核內(nèi)還參與了DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)等關(guān)鍵過程。在DNA復(fù)制過程中，HMGB1可以與復(fù)制起始位點(diǎn)的DNA序列結(jié)合，促進(jìn)DNA解旋酶和引物酶等復(fù)制相關(guān)蛋白的募集，從而啟動(dòng)DNA的復(fù)制。在基因轉(zhuǎn)錄過程中，HMGB1通過與轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子區(qū)域的DNA相互作用，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可以與某些轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。此外，當(dāng)DNA受到損傷時(shí)，HMGB1能夠迅速結(jié)合到損傷部位，招募DNA修復(fù)酶，如DNA聚合酶、連接酶等，參與DNA損傷的修復(fù)過程，確保細(xì)胞遺傳信息的準(zhǔn)確性。當(dāng)細(xì)胞受到損傷、炎癥或應(yīng)激等刺激時(shí)，HMGB1會(huì)從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞外，作為一種損傷相關(guān)模式分子（DAMP），參與機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥調(diào)節(jié)。細(xì)胞外的HMGB1可以與多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，如晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）、Toll樣受體（TLRs）等，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)。HMGB1與RAGE結(jié)合后，能夠激活RAGE下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路的激活可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子的活化，如c-Jun、c-Fos等，這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核后，與相應(yīng)的基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子如腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。NF-κB信號(hào)通路的激活則促使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與炎癥相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)炎癥因子的表達(dá)，從而放大炎癥反應(yīng)。HMGB1與TLRs的結(jié)合也能激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。以TLR4為例，HMGB1與TLR4結(jié)合后，通過招募髓樣分化因子88（MyD88）和含TIR結(jié)構(gòu)域的適配器誘導(dǎo)IFN-β（TRIF）等接頭蛋白，激活下游的NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）等信號(hào)通路。NF-κB的激活促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，而IRF3的激活則誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥過程。細(xì)胞外的HMGB1還具有促進(jìn)細(xì)胞遷移和組織修復(fù)的功能。在組織損傷后，HMGB1可以吸引成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等向損傷部位遷移，促進(jìn)細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成，加速組織修復(fù)和再生。但在慢性炎癥和纖維化等病理?xiàng)l件下，過度釋放的HMGB1會(huì)持續(xù)激活炎癥信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，最終導(dǎo)致組織纖維化的發(fā)生和發(fā)展。2.2肝臟慢性炎癥和纖維化的發(fā)病機(jī)制2.2.1肝臟慢性炎癥的發(fā)生機(jī)制肝臟慢性炎癥是多種因素共同作用的結(jié)果，其中病毒感染、酒精損傷、藥物性肝損傷以及自身免疫異常等是常見的誘發(fā)因素。這些因素通過不同的機(jī)制導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)。病毒感染是導(dǎo)致肝臟慢性炎癥的重要原因之一，其中乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染最為常見。HBV屬于嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒屬，其基因組為雙鏈環(huán)狀DNA。HBV通過血液、母嬰和性傳播等途徑進(jìn)入人體后，與肝細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，進(jìn)而侵入肝細(xì)胞。在肝細(xì)胞內(nèi)，HBV利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)進(jìn)行病毒基因組的復(fù)制和病毒蛋白的合成。HBV感染引發(fā)肝臟慢性炎癥的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：一方面，HBV感染可直接導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，病毒在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程會(huì)干擾肝細(xì)胞的正常代謝和功能，引起肝細(xì)胞的變性、壞死。另一方面，機(jī)體的免疫反應(yīng)在HBV感染所致的肝臟炎癥中起著關(guān)鍵作用。HBV感染后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)被激活，產(chǎn)生針對(duì)HBV的特異性免疫細(xì)胞，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）等。這些免疫細(xì)胞在識(shí)別和清除被HBV感染的肝細(xì)胞的過程中，會(huì)釋放多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，如干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究表明，HBV特異性CTL可通過穿孔素/顆粒酶途徑和Fas/FasL途徑誘導(dǎo)被感染肝細(xì)胞的凋亡，同時(shí)釋放的細(xì)胞因子可激活肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞等，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。HCV屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA。HCV主要通過血液傳播，如輸血、共用注射器等。HCV感染肝細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和組裝，其非結(jié)構(gòu)蛋白可干擾肝細(xì)胞的正常生理功能，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。與HBV感染類似，HCV感染引發(fā)的肝臟慢性炎癥也與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。HCV感染后，機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫均被激活。固有免疫細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞等，可通過識(shí)別HCV感染相關(guān)的模式分子，釋放細(xì)胞因子和趨化因子，招募炎癥細(xì)胞到肝臟，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。適應(yīng)性免疫方面，HCV特異性T淋巴細(xì)胞可識(shí)別并殺傷被HCV感染的肝細(xì)胞，但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷和炎癥的加劇。此外，HCV感染還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生自身抗體，引發(fā)自身免疫反應(yīng)，進(jìn)一步加重肝臟炎癥。長(zhǎng)期大量飲酒是導(dǎo)致酒精性肝病的主要原因，可引發(fā)肝臟慢性炎癥。酒精進(jìn)入人體后，主要在肝臟進(jìn)行代謝。酒精首先被乙醇脫氫酶（ADH）氧化為乙醛，乙醛再被乙醛脫氫酶（ALDH）進(jìn)一步氧化為乙酸。在這個(gè)代謝過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等。ROS可攻擊肝細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)損傷和基因突變等，從而引起肝細(xì)胞損傷。此外，乙醛還具有直接的細(xì)胞毒性作用，可與肝細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，形成乙醛-蛋白質(zhì)加合物，影響蛋白質(zhì)的正常功能，導(dǎo)致肝細(xì)胞代謝紊亂和損傷。酒精性肝病中炎癥反應(yīng)的發(fā)生還與腸道菌群失調(diào)和內(nèi)毒素血癥密切相關(guān)。長(zhǎng)期飲酒可破壞腸道黏膜屏障的完整性，導(dǎo)致腸道通透性增加，腸道內(nèi)的細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物，如脂多糖（LPS）等，易位進(jìn)入血液循環(huán)，引起內(nèi)毒素血癥。LPS可與肝臟中的庫(kù)普弗細(xì)胞表面的Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等促炎細(xì)胞因子的釋放，引發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)。同時(shí)，酒精還可抑制肝臟中枯否細(xì)胞的吞噬功能，使其對(duì)LPS的清除能力下降，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。藥物性肝損傷是指由藥物或其代謝產(chǎn)物引起的肝臟損害，也是導(dǎo)致肝臟慢性炎癥的常見原因之一。許多藥物，如抗生素、解熱鎮(zhèn)痛藥、抗結(jié)核藥等，都可能引起藥物性肝損傷。藥物性肝損傷的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括藥物的直接毒性作用和免疫介導(dǎo)的肝損傷。藥物的直接毒性作用是指藥物及其代謝產(chǎn)物對(duì)肝細(xì)胞的直接損傷，這些物質(zhì)可干擾肝細(xì)胞的正常代謝過程，如抑制蛋白質(zhì)合成、破壞線粒體功能等，導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡。免疫介導(dǎo)的肝損傷則是指藥物或其代謝產(chǎn)物作為半抗原，與肝細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，形成抗原復(fù)合物，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生針對(duì)肝細(xì)胞的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和炎癥。在免疫介導(dǎo)的藥物性肝損傷中，T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及細(xì)胞因子等均發(fā)揮重要作用。例如，藥物特異性T淋巴細(xì)胞可識(shí)別并殺傷被藥物修飾的肝細(xì)胞，同時(shí)釋放細(xì)胞因子，如干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等，引發(fā)炎癥反應(yīng)。自身免疫性肝炎是一種由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝臟慢性炎癥性疾病。其發(fā)病機(jī)制主要與機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)肝細(xì)胞的錯(cuò)誤識(shí)別和攻擊有關(guān)。在自身免疫性肝炎患者中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)失去了對(duì)自身肝細(xì)胞的耐受性，產(chǎn)生了針對(duì)肝細(xì)胞的自身抗體和自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。這些自身抗體和T淋巴細(xì)胞可識(shí)別肝細(xì)胞表面的抗原，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。自身免疫性肝炎的發(fā)生還與遺傳因素、環(huán)境因素等密切相關(guān)。遺傳因素決定了個(gè)體對(duì)自身免疫性肝炎的易感性，某些基因多態(tài)性與自身免疫性肝炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。環(huán)境因素，如病毒感染、藥物、化學(xué)物質(zhì)等，可能作為觸發(fā)因素，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致自身免疫性肝炎的發(fā)生。在肝臟慢性炎癥過程中，炎癥細(xì)胞和炎癥因子發(fā)揮著關(guān)鍵作用。炎癥細(xì)胞主要包括庫(kù)普弗細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等，它們通過趨化作用聚集到炎癥部位，釋放多種炎癥因子，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。庫(kù)普弗細(xì)胞是肝臟內(nèi)的固有巨噬細(xì)胞，約占肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的80%。當(dāng)肝臟受到損傷或感染時(shí)，庫(kù)普弗細(xì)胞被激活，通過表面的模式識(shí)別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs）等，識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，如NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放。研究表明，庫(kù)普弗細(xì)胞激活后可釋放大量的TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可招募更多的炎癥細(xì)胞到肝臟，形成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和炎癥的加劇。中性粒細(xì)胞是最早到達(dá)炎癥部位的免疫細(xì)胞之一，在肝臟慢性炎癥中也發(fā)揮重要作用。中性粒細(xì)胞可通過釋放活性氧（ROS）、蛋白酶等物質(zhì)，直接殺傷病原體和受損細(xì)胞，但同時(shí)也會(huì)對(duì)周圍的正常肝細(xì)胞造成損傷。此外，中性粒細(xì)胞還可釋放多種趨化因子和細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素8（IL-8）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α（MIP-1α）等，吸引其他炎癥細(xì)胞到炎癥部位，參與炎癥反應(yīng)。淋巴細(xì)胞在肝臟慢性炎癥中也扮演著重要角色，其中T淋巴細(xì)胞可分為輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）。Th細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥過程。例如，Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)，抑制炎癥反應(yīng)。CTL則可直接殺傷被病原體感染或發(fā)生病變的肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和炎癥的發(fā)生。單核細(xì)胞在炎癥刺激下可分化為巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步參與炎癥反應(yīng)，分泌炎癥因子，促進(jìn)炎癥的發(fā)展。炎癥因子是一類參與炎癥反應(yīng)的小分子蛋白質(zhì)，在肝臟慢性炎癥過程中，多種炎癥因子的表達(dá)和釋放發(fā)生改變，它們相互作用，形成復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和進(jìn)程。促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，在肝臟慢性炎癥中發(fā)揮著重要的促炎作用。TNF-α可激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)多種炎癥基因的表達(dá)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集和活化，同時(shí)還可直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。IL-1β可刺激肝細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞等產(chǎn)生其他炎癥因子，如IL-6、前列腺素E2（PGE2）等，加重炎癥反應(yīng)。IL-6可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，產(chǎn)生抗體，同時(shí)也可激活T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。此外，趨化因子，如CXC趨化因子配體8（CXCL8）、CC趨化因子配體2（CCL2）等，在炎癥細(xì)胞的募集和遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CXCL8可吸引中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移，CCL2則可招募單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞到炎癥部位，參與炎癥反應(yīng)。而抗炎細(xì)胞因子，如IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）等，則可抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用。IL-10可抑制巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活化，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而減輕炎癥反應(yīng)。TGF-β可抑制免疫細(xì)胞的增殖和活化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，在肝臟炎癥和纖維化過程中具有雙重作用。在炎癥早期，TGF-β可抑制炎癥反應(yīng)；但在炎癥后期，TGF-β的持續(xù)高表達(dá)可促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。2.2.2肝纖維化的形成機(jī)制肝纖維化是肝臟對(duì)各種慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，其本質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在肝臟內(nèi)的過度沉積和異常分布，導(dǎo)致肝臟組織結(jié)構(gòu)和功能的破壞。肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活、細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡以及炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子的參與是肝纖維化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝星狀細(xì)胞（HSC）位于肝臟竇周間隙，是肝纖維化過程中產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞。在正常肝臟中，HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，主要儲(chǔ)存維生素A和參與肝臟的脂質(zhì)代謝。然而，當(dāng)肝臟受到持續(xù)的損傷刺激，如病毒感染、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等，HSC會(huì)被激活，發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從靜止的維生素A儲(chǔ)存細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性鲋?、收縮、遷移和分泌細(xì)胞外基質(zhì)能力的肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。HSC的激活是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路的參與。TGF-β是目前已知的最重要的促纖維化細(xì)胞因子之一，在HSC激活和肝纖維化形成過程中發(fā)揮核心作用。TGF-β主要由庫(kù)普弗細(xì)胞、活化的HSC和肝細(xì)胞等產(chǎn)生。當(dāng)肝臟發(fā)生損傷時(shí)，受損細(xì)胞釋放的DAMPs和PAMPs可激活庫(kù)普弗細(xì)胞，使其分泌大量的TGF-β。TGF-β與HSC表面的TGF-β受體結(jié)合，激活Smad信號(hào)通路。TGF-β首先與TGF-β受體I（TβRI）和TGF-β受體II（TβRII）結(jié)合，形成異源二聚體復(fù)合物。TβRII具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，可磷酸化TβRI，激活的TβRI進(jìn)而磷酸化下游的Smad2和Smad3。磷酸化的Smad2/3與Smad4形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)HSC的激活和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。研究表明，TGF-β/Smad信號(hào)通路可上調(diào)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋白（CollagenI）、纖連蛋白（Fibronectin）等細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，促使HSC向肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成。血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）也是促進(jìn)HSC激活和增殖的重要細(xì)胞因子。PDGF主要由血小板、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生。在肝臟損傷部位，PDGF被釋放并與HSC表面的PDGF受體（PDGFR）結(jié)合。PDGFR屬于受體酪氨酸激酶家族，與PDGF結(jié)合后，其酪氨酸激酶活性被激活，使受體自身磷酸化，進(jìn)而激活下游的多條信號(hào)通路，如Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt等。這些信號(hào)通路的激活可促進(jìn)HSC的增殖、遷移和存活，增強(qiáng)HSC的活化狀態(tài)。ERK信號(hào)通路的激活可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)HSC從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活則可抑制HSC的凋亡，維持其活化狀態(tài)。除了TGF-β和PDGF外，其他細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等，也可通過不同的信號(hào)通路參與HSC的激活和肝纖維化的形成。IGF-1可通過激活PI3K/Akt和ERK信號(hào)通路，促進(jìn)HSC的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。EGF可與HSC表面的EGF受體結(jié)合，激活Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，促進(jìn)HSC的增殖和遷移。FGF可通過激活磷脂酶Cγ（PLCγ）和蛋白激酶C（PKC）等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)HSC的功能，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是由多種蛋白質(zhì)和糖胺聚糖組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，在維持肝臟正常結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用。在正常肝臟中，ECM的合成和降解處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以保證肝臟的正常生理功能。然而，在肝纖維化過程中，這種平衡被打破，細(xì)胞外基質(zhì)的合成增加，而降解減少，導(dǎo)致ECM在肝臟內(nèi)過度沉積。在肝纖維化時(shí)，活化的HSC是合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，其合成的細(xì)胞外基質(zhì)成分主要包括膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖等。其中，膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，約占肝臟干重的5%-10%。在肝纖維化過程中，I型和III型膠原蛋白的合成顯著增加，它們?cè)诟闻K內(nèi)形成粗大的纖維束，取代正常的肝小葉結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝臟纖維化。纖連蛋白是一種多功能的糖蛋白，可與細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合，參與細(xì)胞的黏附、遷移和增殖等過程。在肝纖維化時(shí)，纖連蛋白的表達(dá)增加，可促進(jìn)HSC的黏附和遷移，同時(shí)也可與其他細(xì)胞外基質(zhì)成分相互作用，形成穩(wěn)定的纖維網(wǎng)絡(luò)，加重肝纖維化。層粘連蛋白是基底膜的主要成分之一，在維持細(xì)胞的形態(tài)和功能方面具有重要作用。在肝纖維化過程中，層粘連蛋白的表達(dá)和分布發(fā)生改變，可影響肝細(xì)胞和HSC的相互作用，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。蛋白聚糖是一類由核心蛋白和糖胺聚糖組成的大分子復(fù)合物，可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的物理性質(zhì)和生物學(xué)活性。在肝纖維化時(shí)，某些蛋白聚糖的表達(dá)增加，如硫酸軟骨素、硫酸肝素等，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和纖維化的發(fā)展。細(xì)胞外基質(zhì)的降解主要依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制劑（TIMPs）的平衡調(diào)節(jié)。MMPs是一類鋅離子依賴性的內(nèi)肽酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)的各種成分。在肝臟中，主要的MMPs包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9等。MMP-1主要降解I型和III型膠原蛋白；MMP-2和MMP-9可降解明膠、IV型膠原蛋白和纖連蛋白等。TIMPs是一組內(nèi)源性的MMPs抑制劑，可與MMPs形成1:1的復(fù)合物，抑制MMPs的活性。在正常肝臟中，MMPs和TIMPs的表達(dá)和活性保持相對(duì)平衡，以維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。然而，在肝纖維化過程中，TIMPs的表達(dá)上調(diào)，而MMPs的表達(dá)和活性受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解減少。研究表明，TGF-β可通過上調(diào)TIMPs的表達(dá)，抑制MMPs的活性，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。此外，其他細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如PDGF、IGF-1等，也可通過調(diào)節(jié)MMPs和TIMPs的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解。在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。炎癥細(xì)胞，如庫(kù)普弗細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等，在肝臟損傷部位聚集，通過釋放多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，參與肝纖維化的形成。庫(kù)普弗細(xì)胞作為肝臟內(nèi)的固有免疫細(xì)胞，在肝纖維化過程中扮演著關(guān)鍵角色。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，庫(kù)普弗細(xì)胞被激活，釋放大量的促炎細(xì)胞因子和趨化因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、CCL2等。這些細(xì)胞因子和趨化因子可招募更多的炎癥細(xì)胞到肝臟，形成炎癥微環(huán)境，促進(jìn)HSC的激活和肝纖維化的發(fā)展。TNF-α可通過激活NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)TGF-β和PDGF等促纖維化細(xì)胞因子的表達(dá)，間接促進(jìn)HSC的激活和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。IL-1β可刺激HSC增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)還可增強(qiáng)TGF-β的促纖維化作用。中性粒細(xì)胞在肝纖維化過程中也發(fā)揮一定作用。中性粒細(xì)胞可釋放活性氧（ROS）和蛋白酶等物質(zhì)，直接損傷肝細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)還可釋放細(xì)胞因子和趨化因子，如IL-82.3HMGB1與肝臟慢性炎癥和纖維化的關(guān)聯(lián)2.3.1HMGB1在肝臟炎癥中的作用在肝臟炎癥過程中，HMGB1的釋放機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞類型和信號(hào)通路。當(dāng)肝臟受到病毒感染、酒精損傷、藥物毒性等刺激時(shí)，肝細(xì)胞會(huì)發(fā)生損傷和壞死，此時(shí)HMGB1會(huì)從細(xì)胞核中釋放到細(xì)胞外。研究表明，在乙型肝炎病毒（HBV）感染所致的肝臟炎癥模型中，受損的肝細(xì)胞內(nèi)HMGB1的表達(dá)明顯上調(diào)，且大量HMGB1釋放到細(xì)胞外間隙。這一過程可能與細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，氧化應(yīng)激可促使HMGB1從染色質(zhì)上解離，進(jìn)而釋放到細(xì)胞外。有研究發(fā)現(xiàn)，在酒精性肝病模型中，酒精代謝產(chǎn)生的大量活性氧（ROS）可導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡失調(diào)，激活蛋白激酶C（PKC）等信號(hào)通路，促使HMGB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)，并最終釋放到細(xì)胞外。除了肝細(xì)胞，肝臟中的免疫細(xì)胞，如庫(kù)普弗細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，在受到炎癥刺激時(shí)也會(huì)主動(dòng)分泌HMGB1。庫(kù)普弗細(xì)胞作為肝臟內(nèi)的固有巨噬細(xì)胞，在識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）后，會(huì)被迅速激活，通過核因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路誘導(dǎo)HMGB1的表達(dá)和分泌。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的肝臟炎癥模型中，庫(kù)普弗細(xì)胞表面的Toll樣受體4（TLR4）與LPS結(jié)合后，激活下游的MyD88依賴和非依賴信號(hào)通路，促使NF-κB活化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與HMGB1基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)HMGB1的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而使其分泌到細(xì)胞外。細(xì)胞外的HMGB1通過與多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活炎癥細(xì)胞，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）和Toll樣受體（TLRs）是HMGB1的主要受體，它們?cè)谘装Y細(xì)胞表面廣泛表達(dá)。當(dāng)HMGB1與RAGE結(jié)合后，可激活RAGE下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，這些激酶被激活后，可磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun、c-Fos等，使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與相應(yīng)的基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子如腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。NF-κB信號(hào)通路的激活則促使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)中的抑制蛋白IκB上解離，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與炎癥相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)炎癥因子的表達(dá)，從而放大炎癥反應(yīng)。研究表明，在肝臟炎癥模型中，阻斷RAGE-HMGB1信號(hào)通路可顯著降低炎癥因子的表達(dá)水平，減輕肝臟炎癥損傷。HMGB1與TLRs的結(jié)合同樣能激活炎癥信號(hào)通路。以TLR4為例，HMGB1與TLR4結(jié)合后，通過招募髓樣分化因子88（MyD88）和含TIR結(jié)構(gòu)域的適配器誘導(dǎo)IFN-β（TRIF）等接頭蛋白，激活下游的NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）等信號(hào)通路。NF-κB的激活促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，而IRF3的激活則誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥過程。此外，HMGB1還可與TLR2、TLR9等結(jié)合，激活相應(yīng)的信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。在肝臟缺血再灌注損傷模型中，HMGB1與TLR4結(jié)合，激活NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致大量炎癥因子釋放，加劇肝臟組織的損傷。HMGB1還能與其他炎癥因子相互作用，形成復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)肝臟炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可與IL-1β、TNFα等炎癥因子形成復(fù)合物，增強(qiáng)它們的生物學(xué)活性。在巨噬細(xì)胞中，HMGB1與IL-1β結(jié)合后，可協(xié)同激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)更多炎癥因子的釋放。HMGB1還可通過調(diào)節(jié)趨化因子的表達(dá)，影響炎癥細(xì)胞的募集和遷移。在肝臟炎癥時(shí)，HMGB1可誘導(dǎo)CC類趨化因子配體2（CCL2）等趨化因子的表達(dá)，吸引單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向肝臟炎癥部位聚集，加重炎癥反應(yīng)。此外，HMGB1還可與其他損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如熱休克蛋白（HSPs）、線粒體DNA等相互作用，協(xié)同激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。2.3.2HMGB1在肝纖維化中的作用肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，而HMGB1在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進(jìn)作用。正常情況下，HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，主要儲(chǔ)存維生素A并參與肝臟的脂質(zhì)代謝。當(dāng)肝臟受到持續(xù)的損傷刺激時(shí)，受損肝細(xì)胞和炎癥細(xì)胞釋放的HMGB1可與HSC表面的受體結(jié)合，激活HSC，使其發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從靜止的維生素A儲(chǔ)存細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性鲋?、收縮、遷移和分泌細(xì)胞外基質(zhì)能力的肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。研究表明，HMGB1主要通過與晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）和Toll樣受體（TLRs）結(jié)合，激活HSC內(nèi)的多條信號(hào)通路，從而促進(jìn)其活化。當(dāng)HMGB1與RAGE結(jié)合后，可激活RAGE下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路的激活可促進(jìn)HSC的增殖和遷移，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等，促使HSC從G1期進(jìn)入S期，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活則可抑制HSC的凋亡，維持其活化狀態(tài)，同時(shí)還可促進(jìn)HSC合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)。在體外實(shí)驗(yàn)中，用重組HMGB1刺激HSC，可顯著上調(diào)RAGE的表達(dá)，并激活MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路，導(dǎo)致HSC的增殖和活化明顯增強(qiáng)。HMGB1與TLRs的結(jié)合也能激活HSC。以TLR4為例，HMGB1與TLR4結(jié)合后，通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴和非依賴信號(hào)通路，激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。NF-κB活化后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在TLR4基因敲除的小鼠中，HMGB1對(duì)HSC的激活作用明顯減弱，表明TLR4在HMGB1介導(dǎo)的HSC活化過程中起著重要作用。此外，HMGB1還可通過與TLR2、TLR9等結(jié)合，激活相應(yīng)的信號(hào)通路，促進(jìn)HSC的活化。在肝纖維化過程中，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的代謝失衡是導(dǎo)致纖維組織沉積的關(guān)鍵因素，而HMGB1對(duì)ECM的代謝具有重要影響?；罨腍SC是合成ECM的主要細(xì)胞，HMGB1可通過多種途徑促進(jìn)HSC合成ECM成分，如膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白等。在基因轉(zhuǎn)錄水平，HMGB1激活的NF-κB、MAPK等信號(hào)通路可上調(diào)I型膠原蛋白（CollagenI）、纖連蛋白（Fibronectin）等ECM相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，在HMGB1刺激的HSC中，CollagenI和Fibronectin的mRNA表達(dá)水平顯著升高。在蛋白質(zhì)合成和分泌水平，HMGB1可促進(jìn)HSC內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)的合成和分泌過程，增加ECM在細(xì)胞外的沉積。與此同時(shí)，HMGB1還可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性和上調(diào)其組織抑制劑（TIMPs）的表達(dá)，減少ECM的降解。MMPs是一類鋅離子依賴性的內(nèi)肽酶，可降解ECM的各種成分，在維持ECM穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。然而，在肝纖維化時(shí)，HMGB1的作用導(dǎo)致MMPs的活性受到抑制。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制MMP-2和MMP-9等的活性，減少ECM的降解。TIMPs是一組內(nèi)源性的MMPs抑制劑，HMGB1可上調(diào)TIMPs的表達(dá)，如TIMPs-1、TIMPs-2等，使其與MMPs結(jié)合形成復(fù)合物，從而抑制MMPs的活性。在肝纖維化動(dòng)物模型中，檢測(cè)到肝臟組織中TIMPs的表達(dá)明顯升高，且與HMGB1的表達(dá)水平呈正相關(guān)。隨著肝纖維化的發(fā)展，HMGB1持續(xù)發(fā)揮作用，不斷加重肝臟的纖維化程度。在肝纖維化早期，HMGB1激活HSC，促使其合成和分泌少量的ECM，此時(shí)肝臟組織開始出現(xiàn)輕度的纖維組織增生。隨著損傷和炎癥的持續(xù)存在，HMGB1持續(xù)釋放，大量激活HSC，使其不斷增殖并合成更多的ECM，同時(shí)進(jìn)一步抑制ECM的降解，導(dǎo)致ECM在肝臟內(nèi)過度沉積。這些過度沉積的ECM逐漸形成纖維瘢痕組織，取代正常的肝小葉結(jié)構(gòu)，破壞肝臟的正常組織結(jié)構(gòu)和功能。在肝纖維化晚期，肝臟組織出現(xiàn)廣泛的纖維化，形成假小葉，肝功能嚴(yán)重受損，可發(fā)展為肝硬化，甚至導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。研究表明，在肝硬化患者的肝臟組織中，HMGB1的表達(dá)水平顯著高于正常肝臟組織，且與肝纖維化程度密切相關(guān)。三、HMGB1在肝臟慢性炎癥與纖維化中作用的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組本實(shí)驗(yàn)選用6-8周齡的健康雄性C57BL/6小鼠，體重在20-25g之間，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和自由飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只：正常對(duì)照組：給予橄欖油腹腔注射，每周2次，持續(xù)8周。橄欖油作為溶劑，不會(huì)對(duì)小鼠肝臟產(chǎn)生損傷，用于模擬正常生理狀態(tài)下的肝臟情況。模型組：采用經(jīng)典的四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)法建立肝纖維化模型。將CCl4與橄欖油按1:3的體積比混合，配制成25%的CCl4橄欖油溶液，按5ml/kg的劑量腹腔注射，每周2次，持續(xù)8周。CCl4進(jìn)入體內(nèi)后，通過細(xì)胞色素P450系統(tǒng)代謝產(chǎn)生三氯甲基自由基，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。干預(yù)組：在給予CCl4橄欖油溶液腹腔注射的同時(shí)，給予HMGB1抑制劑[抑制劑名稱]進(jìn)行干預(yù)。將抑制劑溶解于適量的溶劑中，按[具體劑量]mg/kg的劑量腹腔注射，每周2次，持續(xù)8周。該抑制劑能夠特異性地阻斷HMGB1與其受體的結(jié)合，從而抑制HMGB1相關(guān)信號(hào)通路的激活，以探究其對(duì)肝纖維化進(jìn)程的影響。3.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)試劑：四氯化碳（CCl4）、橄欖油、HMGB1抑制劑[抑制劑名稱]、HMGB1抗體、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體、I型膠原蛋白（CollagenI）抗體、腫瘤壞死因子α（TNFα）抗體、白細(xì)胞介素6（IL-6）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、PMSF、Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒、ELISA試劑盒（包括小鼠HMGB1、TNFα、IL-6、HA、LN、PCIII等）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、Masson染色試劑盒、DAB顯色試劑盒等。實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平、低溫高速離心機(jī)、PCR儀、酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)、熒光顯微鏡、石蠟切片機(jī)、包埋機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、移液器、低溫冰箱等。3.1.3實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒉捎盟穆然迹–Cl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型。實(shí)驗(yàn)前將CCl4與橄欖油按1:3的體積比充分混合，配制成25%的CCl4橄欖油溶液。小鼠稱重后，用1%戊巴比妥鈉溶液按50mg/kg的劑量腹腔注射進(jìn)行麻醉。待小鼠麻醉后，使用1ml注射器抽取適量的25%CCl4橄欖油溶液，按5ml/kg的劑量經(jīng)腹腔緩慢注射給藥。注射過程中注意避開小鼠的內(nèi)臟器官，確保給藥的準(zhǔn)確性和安全性。正常對(duì)照組小鼠則給予等量的橄欖油腹腔注射。每周注射2次，持續(xù)8周。在造模過程中，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、體重、活動(dòng)等情況。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、飲食下降、體重增長(zhǎng)緩慢等癥狀，提示肝臟損傷和纖維化的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行處死，采集肝臟組織和血液樣本，用于后續(xù)的檢測(cè)分析。3.1.4檢測(cè)指標(biāo)與方法血清生化指標(biāo)檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠禁食12h后，采用摘眼球取血法采集血液樣本，將血液置于離心管中，3000r/min離心15min，分離血清。使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的活性，以評(píng)估肝臟的損傷程度。ALT和AST是肝細(xì)胞內(nèi)的重要酶類，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，它們會(huì)釋放到血液中，導(dǎo)致血清中ALT和AST活性升高。同時(shí)，采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等炎癥因子的含量，以及透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、III型前膠原（PCIII）等肝纖維化指標(biāo)的水平。ELISA法是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，通過酶標(biāo)記物與底物的反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，從而定量測(cè)定樣本中目標(biāo)物質(zhì)的含量。肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)：取部分肝臟組織，用4%多聚甲醛固定24h以上，然后進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋、切片，切片厚度為4μm。分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色。HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，包括肝細(xì)胞的形態(tài)、肝小葉的完整性、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。正常肝臟組織中，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；而肝纖維化模型組小鼠肝臟組織可見肝細(xì)胞變性、壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。Masson染色用于顯示肝臟組織中的膠原纖維，膠原纖維呈藍(lán)色，肝細(xì)胞呈紅色。通過觀察膠原纖維的分布和含量，評(píng)估肝纖維化的程度。在肝纖維化模型組小鼠肝臟組織中，可見匯管區(qū)和中央靜脈周圍膠原纖維增生，形成纖維間隔，甚至出現(xiàn)假小葉結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)染色：將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化處理后，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肝臟組織中HMGB1、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋白（CollagenI）的表達(dá)。具體步驟如下：首先，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；然后，用正常山羊血清封閉1h，減少非特異性染色；接著，分別加入一抗（HMGB1抗體、α-SMA抗體、CollagenI抗體），4℃孵育過夜；次日，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG或HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，室溫孵育1h；最后，用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。在肝纖維化模型組小鼠肝臟組織中，HMGB1、α-SMA、CollagenI的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，提示HMGB1在肝纖維化過程中可能促進(jìn)了HSC的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)：取部分肝臟組織，加入Trizol試劑提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)HMGB1、RAGE、TLR4、TNFα、IL-6、α-SMA、CollagenI等基因的mRNA表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。在肝纖維化模型組小鼠肝臟組織中，HMGB1、RAGE、TLR4、TNFα、IL-6、α-SMA、CollagenI等基因的mRNA表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1在肝臟慢性炎癥和纖維化過程中的重要作用。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)：取肝臟組織，加入含蛋白酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30min，然后12000r/min離心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h，分別加入一抗（HMGB1抗體、α-SMA抗體、CollagenI抗體、NF-κB抗體、p-NF-κB抗體等），4℃孵育過夜；次日，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG或HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，室溫孵育1h；最后，用ECL發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。通過Westernblot檢測(cè)，可進(jìn)一步驗(yàn)證免疫組織化學(xué)和RT-qPCR的結(jié)果，同時(shí)探究HMGB1對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響。在肝纖維化模型組小鼠肝臟組織中，HMGB1、α-SMA、CollagenI、p-NF-κB等蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，表明HMGB1可能通過激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)HSC的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1HMGB1在肝臟組織中的表達(dá)變化免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝臟組織中HMGB1主要定位于細(xì)胞核，呈弱陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，染色強(qiáng)度較弱。在模型組中，隨著CCl4誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟組織中HMGB1的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。從第2周開始，可見肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞中HMGB1表達(dá)上調(diào)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，染色強(qiáng)度加深；至第4周，HMGB1在匯管區(qū)和中央靜脈周圍的肝細(xì)胞及炎癥細(xì)胞中均有明顯表達(dá)；到第8周，整個(gè)肝臟組織中HMGB1陽(yáng)性表達(dá)廣泛分布，肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等均呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性染色，表明HMGB1的表達(dá)與肝纖維化的進(jìn)展密切相關(guān)。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）進(jìn)一步檢測(cè)肝臟組織中HMGB1蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝臟組織中HMGB1蛋白表達(dá)水平較低。模型組小鼠在CCl4誘導(dǎo)4周后，HMGB1蛋白表達(dá)水平開始顯著升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；誘導(dǎo)8周時(shí)，HMGB1蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高，約為正常對(duì)照組的3倍（P<0.01）。而干預(yù)組小鼠在給予HMGB1抑制劑處理后，肝臟組織中HMGB1蛋白表達(dá)水平明顯降低，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但仍高于正常對(duì)照組。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)結(jié)果表明，正常對(duì)照組小鼠肝臟組織中HMGB1mRNA表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定。模型組小鼠肝臟組織中HMGB1mRNA表達(dá)水平在CCl4誘導(dǎo)2周后開始上升，4周時(shí)顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），8周時(shí)達(dá)到高峰，約為正常對(duì)照組的4倍（P<0.01）。干預(yù)組小鼠肝臟組織中HMGB1mRNA表達(dá)水平在給予抑制劑處理后明顯下降，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但仍高于正常對(duì)照組，說明HMGB1抑制劑能夠有效抑制HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄水平。3.2.2HMGB1對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠血清中腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等炎癥因子含量較低。模型組小鼠在CCl4誘導(dǎo)4周后，血清中TNFα、IL-6含量顯著升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；誘導(dǎo)8周時(shí)，TNFα、IL-6含量進(jìn)一步升高，分別約為正常對(duì)照組的5倍和4倍（P<0.01），表明肝纖維化過程中炎癥反應(yīng)逐漸加重。干預(yù)組小鼠在給予HMGB1抑制劑處理后，血清中TNFα、IL-6含量明顯降低，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但仍高于正常對(duì)照組。這說明HMGB1抑制劑能夠有效抑制炎癥因子的釋放，減輕肝臟的炎癥反應(yīng)，但不能完全恢復(fù)至正常水平。通過RT-qPCR檢測(cè)肝臟組織中TNFα、IL-6等炎癥因子基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果與ELISA檢測(cè)結(jié)果一致。正常對(duì)照組小鼠肝臟組織中TNFα、IL-6mRNA表達(dá)水平較低。模型組小鼠肝臟組織中TNFα、IL-6mRNA表達(dá)水平在CCl4誘導(dǎo)2周后開始升高，4周時(shí)顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），8周時(shí)達(dá)到高峰，分別約為正常對(duì)照組的6倍和5倍（P<0.01）。干預(yù)組小鼠肝臟組織中TNFα、IL-6mRNA表達(dá)水平在給予抑制劑處理后明顯下降，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但仍高于正常對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1抑制劑對(duì)炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用。3.2.3HMGB1對(duì)纖維化相關(guān)指標(biāo)的影響血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠血清中透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、III型前膠原（PCIII）等肝纖維化指標(biāo)含量較低。模型組小鼠在CCl4誘導(dǎo)4周后，血清中HA、LN、PCIII含量顯著升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；誘導(dǎo)8周時(shí)，HA、LN、PCIII含量進(jìn)一步升高，分別約為正常對(duì)照組的4倍、3倍和3.5倍（P<0.01），表明肝纖維化程度逐漸加重。干預(yù)組小鼠在給予HMGB1抑制劑處理后，血清中HA、LN、PCIII含量明顯降低，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但仍高于正常對(duì)照組。這說明HMGB1抑制劑能夠有效抑制肝纖維化指標(biāo)的升高，延緩肝纖維化的進(jìn)程，但不能完全阻止肝纖維化的發(fā)生。肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，匯管區(qū)和中央靜脈周圍無明顯膠原纖維沉積，Masson染色可見少量藍(lán)色膠原纖維。模型組小鼠在CCl4誘導(dǎo)8周后，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞變性、壞死，匯管區(qū)和中央靜脈周圍大量膠原纖維增生，形成纖維間隔，部分區(qū)域可見假小葉形成，Masson染色可見大量藍(lán)色膠原纖維沉積。干預(yù)組小鼠肝臟組織損傷程度較模型組明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，膠原纖維增生減少，纖維間隔變細(xì)，假小葉形成數(shù)量減少，Masson染色可見藍(lán)色膠原纖維沉積明顯減少。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝臟組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋白（CollagenI）表達(dá)較弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少。模型組小鼠在CCl4誘導(dǎo)8周后，肝臟組織中α-SMA、CollagenI表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，主要分布于匯管區(qū)、中央靜脈周圍及纖維間隔處。干預(yù)組小鼠肝臟組織中α-SMA、CollagenI表達(dá)較模型組明顯減弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，表明HMGB1抑制劑能夠抑制肝星狀細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。通過Westernblot檢測(cè)肝臟組織中α-SMA、CollagenI蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝臟組織中α-SMA、CollagenI蛋白表達(dá)水平較低。模型組小鼠在CCl4誘導(dǎo)8周后，α-SMA、CollagenI蛋白表達(dá)水平顯著升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。干預(yù)組小鼠肝臟組織中α-SMA、CollagenI蛋白表達(dá)水平在給予抑制劑處理后明顯下降，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但仍高于正常對(duì)照組，進(jìn)一步驗(yàn)證了HMGB1抑制劑對(duì)肝纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制作用。四、HMGB1影響肝臟慢性炎癥與纖維化的作用機(jī)制4.1HMGB1與炎癥信號(hào)通路的相互作用在肝臟慢性炎癥與纖維化的病理進(jìn)程中，HMGB1與炎癥信號(hào)通路之間存在著復(fù)雜且緊密的相互作用，這一過程涉及多種細(xì)胞類型和分子機(jī)制，其中以HMGB1通過與TLR4、RAGE等受體結(jié)合進(jìn)而激活NF-κB等炎癥信號(hào)通路最為關(guān)鍵。當(dāng)肝臟遭受損傷或處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，肝細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞等會(huì)釋放HMGB1。以病毒感染引發(fā)的肝臟炎癥為例，乙型肝炎病毒（HBV）感染肝細(xì)胞后，肝細(xì)胞會(huì)因病毒的復(fù)制和免疫攻擊而受損，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的HMGB1會(huì)從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)，并最終釋放到細(xì)胞外。在酒精性肝病中，酒精代謝產(chǎn)生的大量活性氧（ROS）可導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡，促使HMGB1從染色質(zhì)上解離并釋放。細(xì)胞外的HMGB1可與多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，其中TLR4和RAGE是其主要的受體。在肝臟中，庫(kù)普弗細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞（HSC）等細(xì)胞表面均廣泛表達(dá)TLR4和RAGE。當(dāng)HMGB1與TLR4結(jié)合時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的分子事件。首先，HMGB1與TLR4的胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，導(dǎo)致TLR4發(fā)生構(gòu)象變化。這種構(gòu)象變化促使TLR4招募髓樣分化因子88（MyD88），MyD88通過其死亡結(jié)構(gòu)域與TLR4的TIR結(jié)構(gòu)域相互作用，形成MyD88-TLR4復(fù)合物。隨后，MyD88會(huì)招募IL-1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員，如IRAK1和IRAK4。IRAK4被激活后，會(huì)磷酸化IRAK1，使其從MyD88-TLR4復(fù)合物中解離，并進(jìn)一步激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6通過自身泛素化修飾，激活下游的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（TAK1）。TAK1進(jìn)而激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物，IKK復(fù)合物由IKKα、IKKβ和IKKγ組成。IKKβ會(huì)磷酸化IκBα，使其從NF-κB/IκBα復(fù)合物中解離。被釋放的NF-κB（主要是p65/p50異二聚體）會(huì)發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞核后與炎癥相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，如腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等基因的啟動(dòng)子，啟動(dòng)這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和釋放，加劇肝臟炎癥反應(yīng)。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的肝臟炎癥模型中，LPS作為TLR4的經(jīng)典配體，與HMGB1協(xié)同作用，可顯著增強(qiáng)NF-κB信號(hào)通路的激活。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同時(shí)給予LPS和HMGB1刺激時(shí)，肝臟組織中TNFα、IL-6等炎癥因子的表達(dá)水平明顯高于單獨(dú)給予LPS或HMGB1刺激時(shí)的水平。這表明HMGB1與TLR4的結(jié)合能夠放大炎癥信號(hào)，使炎癥反應(yīng)更加劇烈。HMGB1與RAGE的結(jié)合同樣能激活炎癥信號(hào)通路。RAGE屬于免疫球蛋白超家族成員，其胞外結(jié)構(gòu)域包含多個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合HMGB1。當(dāng)HMGB1與RAGE結(jié)合后，會(huì)激活RAGE下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路。在MAPK信號(hào)通路中，HMGB1-RAGE結(jié)合會(huì)導(dǎo)致RAGE招募含有Src同源2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶2（SHP-2），SHP-2進(jìn)而激活Ras蛋白。Ras蛋白激活后，會(huì)依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，最終使ERK磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化并激活一系列轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun、c-Fos等，這些轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)的基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在NF-κB信號(hào)通路方面，HMGB1與RAGE結(jié)合還可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路間接激活NF-κB。具體來說，HMGB1-RAGE結(jié)合會(huì)激活PI3K，PI3K將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3會(huì)招募并激活A(yù)kt，Akt通過磷酸化IκB激酶（IKK）復(fù)合物中的IKKβ，促進(jìn)IκBα的磷酸化和降解，從而釋放NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄。在肝臟缺血再灌注損傷模型中，HMGB1與RAGE結(jié)合，激活MAPK和NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致大量炎癥因子釋放，如TNFα、IL-6等，這些炎癥因子會(huì)進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞，加重肝臟組織的損傷程度。研究表明，使用RAGE抑制劑阻斷HMGB1與RAGE的結(jié)合后，肝臟組織中的炎癥因子表達(dá)水平顯著降低，肝細(xì)胞損傷也明顯減輕，這進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1通過RAGE激活炎癥信號(hào)通路在肝臟損傷中的重要作用。HMGB1與炎癥信號(hào)通路的相互作用是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，除了上述主要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑外，還涉及其他細(xì)胞因子和信號(hào)分子的參與。例如，HMGB1激活的炎癥信號(hào)通路可誘導(dǎo)趨化因子的表達(dá)，如CC類趨化因子配體2（CCL2）等，這些趨化因子能夠吸引炎癥細(xì)胞，如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等向肝臟炎癥部位聚集，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。HMGB1還可與其他損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如熱休克蛋白（HSPs）、線粒體DNA等相互作用，協(xié)同激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥信號(hào)通路的激活。4.2HMGB1對(duì)肝星狀細(xì)胞激活的調(diào)控機(jī)制在肝臟纖維化進(jìn)程中，肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活是核心環(huán)節(jié)，而高遷移率族蛋白B1（HMGB1）在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。正常情況下，HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，主要功能為儲(chǔ)存維生素A以及參與肝臟脂質(zhì)代謝。但當(dāng)肝臟遭受持續(xù)損傷刺激，如病毒感染、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等，受損肝細(xì)胞和炎癥細(xì)胞會(huì)釋放HMGB1。以乙肝病毒感染為例，病毒感染肝細(xì)胞后，引發(fā)免疫反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞受損，受損肝細(xì)胞會(huì)釋放HMGB1。在酒精性肝病中，酒精代謝產(chǎn)生的乙醛等有害物質(zhì)損傷肝細(xì)胞，也促使HMGB1釋放。釋放到細(xì)胞外的HMGB1可與HSC表面的受體晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）和Toll樣受體（TLRs）結(jié)合，從而激活HSC內(nèi)的多條信號(hào)通路，誘導(dǎo)其活化。當(dāng)HMGB1與RAGE結(jié)合后，會(huì)激活RAGE下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路。在MAPK信號(hào)通路中，RAGE與HMGB1結(jié)合后，會(huì)招募含有Src同源2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶2（SHP-2），SHP-2進(jìn)而激活Ras蛋白。Ras蛋白激活后，依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，最終使ERK磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核。進(jìn)入細(xì)胞核的ERK會(huì)磷酸化并激活一系列轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun、c-Fos等，這些轉(zhuǎn)錄因子與細(xì)胞周期相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等的表達(dá)，促使HSC從G1期進(jìn)入S期，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活則可抑制HSC的凋亡，維持其活化狀態(tài)。PI3K被激活后，將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3會(huì)招募并激活A(yù)kt，Akt通過抑制促凋亡蛋白Bad的活性、激活抗凋亡蛋白Bcl-2等途徑，抑制HSC的凋亡。Akt還能促進(jìn)HSC合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，如通過激活下游的mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，增加細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白、纖連蛋白等的合成。在體外實(shí)驗(yàn)中，用重組HMGB1刺激HSC，可顯著上調(diào)RAGE的表達(dá)，并激活MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路，導(dǎo)致HSC的增殖和活化明顯增強(qiáng)。HMGB1與TLRs的結(jié)合同樣能激活HSC，其中以與TLR4的結(jié)合研究較為深入。當(dāng)HMGB1與TLR4結(jié)合時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的分子事件。首先，HMGB1與TLR4的胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，導(dǎo)致TLR4發(fā)生構(gòu)象變化。這種構(gòu)象變化促使TLR4招募髓樣分化因子88（MyD88），MyD88通過其死亡結(jié)構(gòu)域與TLR4的TIR結(jié)構(gòu)域相互作用，形成MyD88-TLR4復(fù)合物。隨后，MyD88會(huì)招募IL-1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員，如IRAK1和IRAK4。IRAK4被激活后，會(huì)磷酸化IRAK1，使其從MyD88-TLR4復(fù)合物中解離，并進(jìn)一步激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6通過自身泛素化修飾，激活下游的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（TAK1）。TAK1進(jìn)而激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物，IKK復(fù)合物由IKKα、IKKβ和IKKγ組成。IKKβ會(huì)磷酸化IκBα，使其從NF-κB/IκBα復(fù)合物中解離。被釋放的NF-κB（主要是p65/p50異二聚體）會(huì)發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞核后與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在TLR4基因敲除的小鼠中，HMGB1對(duì)HSC的激活作用明顯減弱，表明TLR4在HMGB1介導(dǎo)的HSC活化過程中起著重要作用。此外，HMGB1還可通過與TLR2、TLR9等結(jié)合，激活相應(yīng)的信號(hào)通路，促進(jìn)HSC的活化。在肝纖維化過程中，HMGB1除了通過激活信號(hào)通路促進(jìn)HSC的活化和增殖外，還能影響HSC的表型轉(zhuǎn)化，使其從靜止的維生素A儲(chǔ)存細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性鲋?、收縮、遷移和分泌細(xì)胞外基質(zhì)能力的肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。這一表型轉(zhuǎn)化過程伴隨著一系列基因和蛋白表達(dá)的改變，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-