HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活機(jī)制與應(yīng)用前景研究

HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活機(jī)制與應(yīng)用前景研究一、引言1.1研究背景與意義枯草桿菌作為一種常見(jiàn)的土壤細(xì)菌，在適宜條件下能形成芽孢。芽孢具有極強(qiáng)的抗逆性，對(duì)高溫、高壓、干燥、化學(xué)物質(zhì)等不良環(huán)境有高度耐受性，能夠長(zhǎng)時(shí)間存活。其在食品加工、儲(chǔ)存以及農(nóng)作物種植環(huán)境中廣泛存在，一旦條件適宜，芽孢便會(huì)萌發(fā)為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)而大量繁殖。在食品領(lǐng)域，枯草桿菌芽孢的存在是食品安全的重大隱患。它能產(chǎn)生多種對(duì)人類和動(dòng)物有害的毒素，如嘔吐毒素、腹瀉毒素等，這些毒素可引發(fā)食物中毒，導(dǎo)致惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí){生命健康。在農(nóng)作物種植方面，枯草桿菌芽孢可能成為病原菌，引發(fā)多種植物病害，影響農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，降低農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。例如，在糧食作物中，枯草桿菌芽孢可導(dǎo)致小麥、水稻等作物發(fā)生病害，影響其灌漿、結(jié)實(shí)，造成減產(chǎn)；在果蔬種植中，也能引起果蔬腐爛變質(zhì)，縮短保鮮期，降低商品價(jià)值。目前，針對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活方法眾多，如高溫滅菌、化學(xué)消毒劑處理等傳統(tǒng)方法在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限性。高溫滅菌雖能有效滅活芽孢，但可能破壞食品的營(yíng)養(yǎng)成分、風(fēng)味和質(zhì)地，影響食品品質(zhì)；化學(xué)消毒劑雖殺菌效果顯著，但容易在食品或農(nóng)作物表面殘留，對(duì)人體健康和環(huán)境造成潛在危害。因此，尋找一種高效、安全、環(huán)保的枯草桿菌芽孢滅活方法迫在眉睫。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)HPTS（高壓熱殺菌處理，High-pressurethermalsterilization）結(jié)合溶菌酶的方法在滅活枯草桿菌芽孢方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，為解決上述問(wèn)題提供了新的思路。HPTS是將靜態(tài)超高壓和熱耦合起來(lái)用于殺菌的新興技術(shù)，與傳統(tǒng)高溫?zé)釟⒕啾?，使用溫度較低、時(shí)間較短，能更好地保持食品原有的色、香、味、質(zhì)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)素和功能性成分。溶菌酶是一種天然的抗菌酶，能夠降解細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破裂溶解，從而殺死細(xì)菌。當(dāng)HPTS與溶菌酶結(jié)合時(shí)，二者發(fā)揮協(xié)同作用，能夠更有效地破壞枯草桿菌芽孢的結(jié)構(gòu)，降低其抗性，實(shí)現(xiàn)芽孢的滅活。本研究聚焦于HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢的作用，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。在食品安全方面，該研究成果有助于開(kāi)發(fā)新型、安全、高效的食品殺菌技術(shù)，減少食品中枯草桿菌芽孢及其毒素的污染，保障消費(fèi)者的健康，提升食品行業(yè)的安全性和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，能夠?yàn)檗r(nóng)作物病害防治提供新的策略和方法，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低對(duì)環(huán)境的污染，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。同時(shí)，對(duì)該方法作用機(jī)制的深入研究，還能豐富微生物學(xué)和食品科學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的理論知識(shí)，為進(jìn)一步優(yōu)化和拓展該技術(shù)的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在HPTS的研究方面，國(guó)外學(xué)者早在20世紀(jì)90年代就開(kāi)始關(guān)注超高壓與熱結(jié)合的殺菌技術(shù)。如日本的學(xué)者首先開(kāi)展了超高壓熱殺菌對(duì)食品中微生物影響的研究，發(fā)現(xiàn)HPTS能夠有效滅活一些耐熱性微生物，如嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草桿菌芽孢等。隨后，歐美國(guó)家的研究人員進(jìn)一步深入探討HPTS的殺菌機(jī)制，通過(guò)對(duì)微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理代謝等方面的研究，揭示了HPTS能夠破壞微生物的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，從而實(shí)現(xiàn)殺菌作用。國(guó)內(nèi)對(duì)HPTS的研究起步相對(duì)較晚，但近年來(lái)發(fā)展迅速。眾多科研機(jī)構(gòu)和高校開(kāi)展了相關(guān)研究，研究?jī)?nèi)容涉及HPTS在食品殺菌、農(nóng)產(chǎn)品保鮮等領(lǐng)域的應(yīng)用。例如，有研究利用HPTS對(duì)鮮榨果汁進(jìn)行處理，在有效殺滅果汁中微生物的同時(shí)，較好地保留了果汁的營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)；還有研究將HPTS應(yīng)用于肉制品的殺菌保鮮，顯著延長(zhǎng)了肉制品的貨架期。關(guān)于溶菌酶的研究，國(guó)外在20世紀(jì)初期就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的抗菌作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。隨著研究的深入，對(duì)溶菌酶的結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)以及與底物的相互作用等方面有了更清晰的認(rèn)識(shí)。目前，國(guó)外在溶菌酶的基因工程改造、新型溶菌酶的開(kāi)發(fā)等方面取得了顯著進(jìn)展，通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)溶菌酶進(jìn)行改造，提高其抗菌活性、穩(wěn)定性和特異性。國(guó)內(nèi)對(duì)溶菌酶的研究也較為廣泛，涵蓋了溶菌酶的提取、純化、性質(zhì)研究以及在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用。在食品領(lǐng)域，溶菌酶作為一種天然防腐劑，被廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品、水產(chǎn)品等的保鮮；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，溶菌酶用于防治植物病害，取得了一定的效果。對(duì)于HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢的研究，目前相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少。國(guó)外有研究初步探討了HPTS與溶菌酶聯(lián)合使用對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活效果，發(fā)現(xiàn)二者具有協(xié)同作用，能夠顯著提高芽孢的滅活率，但對(duì)其協(xié)同作用機(jī)制尚未深入研究。國(guó)內(nèi)的一些研究也表明，HPTS結(jié)合溶菌酶處理枯草桿菌芽孢，能使芽孢的存活濃度顯著降低，蛋白質(zhì)、核酸泄漏量增加，芽孢結(jié)構(gòu)被破壞，但在作用機(jī)制方面的研究仍不夠系統(tǒng)和深入?？傮w來(lái)看，當(dāng)前關(guān)于HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢的研究還存在一定的不足和空白。在作用機(jī)制方面，雖然已初步認(rèn)識(shí)到二者具有協(xié)同作用，但對(duì)于HPTS和溶菌酶是如何協(xié)同作用，以及這種協(xié)同作用對(duì)枯草桿菌芽孢的結(jié)構(gòu)、生理代謝等方面的具體影響，還缺乏深入、全面的研究。在應(yīng)用研究方面，如何優(yōu)化HPTS和溶菌酶的使用條件，以達(dá)到最佳的滅活效果，同時(shí)降低成本，提高該方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，也有待進(jìn)一步探索。此外，關(guān)于HPTS結(jié)合溶菌酶在不同食品體系和農(nóng)作物種植環(huán)境中的應(yīng)用效果及安全性評(píng)估，相關(guān)研究也較為缺乏。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究的核心目標(biāo)是全面、深入地剖析HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢的作用機(jī)制，精準(zhǔn)評(píng)估其滅活效果，并對(duì)該方法在食品安全保障與農(nóng)作物病害防治等領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用前景展開(kāi)系統(tǒng)探討。在具體的研究?jī)?nèi)容方面，首先，深入探究HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢結(jié)構(gòu)的破壞作用。運(yùn)用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）等先進(jìn)的微觀觀測(cè)技術(shù)，直觀地觀察枯草桿菌芽孢在HPTS結(jié)合溶菌酶處理前后的形態(tài)、大小、表面結(jié)構(gòu)以及內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化。通過(guò)傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析芽孢細(xì)胞壁、細(xì)胞膜以及內(nèi)部生物大分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）的結(jié)構(gòu)和組成變化，明確HPTS和溶菌酶是如何協(xié)同作用于芽孢結(jié)構(gòu)，從而降低芽孢抗性，實(shí)現(xiàn)滅活的目的。其次，深入研究HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢生理代謝的影響。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)芽孢在處理前后相關(guān)基因的表達(dá)變化，明確HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)芽孢萌發(fā)、生長(zhǎng)、代謝等關(guān)鍵生理過(guò)程相關(guān)基因的調(diào)控作用。利用代謝組學(xué)技術(shù)分析芽孢代謝產(chǎn)物的種類和含量變化，全面了解處理后芽孢代謝途徑的改變，揭示HPTS結(jié)合溶菌酶影響芽孢生理代謝，導(dǎo)致其失活的內(nèi)在機(jī)制。再者，系統(tǒng)分析HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢的影響因素及協(xié)同作用機(jī)制?？疾霩PTS的壓力、溫度、保壓時(shí)間等參數(shù)，以及溶菌酶的濃度、作用時(shí)間、作用溫度等因素對(duì)芽孢滅活效果的單獨(dú)及交互影響。通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等方法，建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化HPTS結(jié)合溶菌酶的處理?xiàng)l件，以達(dá)到最佳的芽孢滅活效果。運(yùn)用分子生物學(xué)、生物化學(xué)等手段，研究HPTS和溶菌酶之間的協(xié)同作用方式，如HPTS是否改變了芽孢細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的通透性，從而增強(qiáng)溶菌酶對(duì)芽孢的作用；溶菌酶是否影響了HPTS對(duì)芽孢內(nèi)部生物大分子的破壞作用等，深入揭示二者的協(xié)同作用機(jī)制。然后，精準(zhǔn)評(píng)估HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活效果。采用平板計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞術(shù)等方法，準(zhǔn)確測(cè)定在不同處理?xiàng)l件下枯草桿菌芽孢的存活濃度、失活率等指標(biāo)，直觀地反映HPTS結(jié)合溶菌酶的滅活效果。同時(shí)，通過(guò)對(duì)比單獨(dú)使用HPTS或溶菌酶處理時(shí)的芽孢滅活情況，明確二者結(jié)合使用時(shí)的協(xié)同增效作用，量化分析協(xié)同作用對(duì)芽孢滅活效果的提升程度。最后，積極探索HPTS結(jié)合溶菌酶在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。選取具有代表性的食品體系（如乳制品、肉制品、果蔬制品等）和農(nóng)作物種植環(huán)境，開(kāi)展HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢的應(yīng)用研究。評(píng)估該方法在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)食品品質(zhì)（如營(yíng)養(yǎng)成分、風(fēng)味、色澤、質(zhì)構(gòu)等）和農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)的影響。同時(shí)，對(duì)該方法在實(shí)際應(yīng)用中的安全性進(jìn)行全面評(píng)估，包括對(duì)人體健康的潛在影響、對(duì)環(huán)境的影響等，為其實(shí)際推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將綜合運(yùn)用實(shí)驗(yàn)研究、文獻(xiàn)綜述等多種研究方法，以全面深入地剖析HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢的作用。在實(shí)驗(yàn)研究方面，將開(kāi)展一系列嚴(yán)謹(jǐn)且系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)。首先，在枯草桿菌芽孢的培養(yǎng)與準(zhǔn)備環(huán)節(jié)，從標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(kù)獲取枯草桿菌芽孢，將其接種于適宜的培養(yǎng)基中，在特定的溫度、濕度和通氣條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待芽孢生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期，采用離心、洗滌等方法收集芽孢，并通過(guò)顯微鏡計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)確保芽孢的質(zhì)量和數(shù)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。對(duì)于HPTS結(jié)合溶菌酶處理枯草桿菌芽孢實(shí)驗(yàn)，設(shè)置多組不同的處理?xiàng)l件，包括不同的HPTS壓力（如200MPa、400MPa、600MPa等）、溫度（如50℃、60℃、70℃等）、保壓時(shí)間（如10min、20min、30min等），以及不同的溶菌酶濃度（如0.05%、0.1%、0.3%等）、作用時(shí)間（如10min、20min、30min等）和作用溫度（如25℃、37℃、45℃等）。將枯草桿菌芽孢懸浮液與溶菌酶充分混合后，置于高壓反應(yīng)釜中，按照設(shè)定的HPTS參數(shù)進(jìn)行處理。同時(shí)，設(shè)置單獨(dú)使用HPTS或溶菌酶處理的對(duì)照組，以及未經(jīng)任何處理的空白對(duì)照組。運(yùn)用多種先進(jìn)的檢測(cè)分析技術(shù)對(duì)處理后的芽孢進(jìn)行全面檢測(cè)。利用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）觀察芽孢的形態(tài)、大小、表面結(jié)構(gòu)以及內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化；采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析芽孢細(xì)胞壁、細(xì)胞膜以及內(nèi)部生物大分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）的結(jié)構(gòu)和組成變化；運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)芽孢相關(guān)基因的表達(dá)變化；通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)分析芽孢代謝產(chǎn)物的種類和含量變化；采用平板計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞術(shù)等方法測(cè)定芽孢的存活濃度、失活率等指標(biāo)；利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)芽孢蛋白質(zhì)、核酸的泄漏量；通過(guò)檢測(cè)上清液的電導(dǎo)率評(píng)估芽孢細(xì)胞膜的完整性等。在文獻(xiàn)綜述方面，全面搜集國(guó)內(nèi)外關(guān)于HPTS、溶菌酶以及二者結(jié)合滅活枯草桿菌芽孢的相關(guān)文獻(xiàn)資料，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)梳理和分析，總結(jié)前人的研究成果和不足，為本研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和研究思路。本研究的技術(shù)路線如下：首先基于對(duì)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀的調(diào)研和分析，明確研究目標(biāo)和內(nèi)容，確定實(shí)驗(yàn)方案和技術(shù)路線。接著進(jìn)行枯草桿菌芽孢的培養(yǎng)與準(zhǔn)備，然后開(kāi)展HPTS結(jié)合溶菌酶處理枯草桿菌芽孢實(shí)驗(yàn)，對(duì)處理后的芽孢進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)分析，獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，建立相關(guān)模型，深入探究HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢的作用機(jī)制、影響因素及協(xié)同作用機(jī)制，評(píng)估其滅活效果。最后，根據(jù)研究結(jié)果，探討該方法在食品安全保障與農(nóng)作物病害防治等領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用前景，提出相應(yīng)的建議和措施，撰寫研究報(bào)告和學(xué)術(shù)論文。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1枯草桿菌芽孢概述2.1.1結(jié)構(gòu)特點(diǎn)枯草桿菌芽孢具有復(fù)雜而獨(dú)特的多層結(jié)構(gòu)，從外到內(nèi)主要包括芽孢衣、皮層、核心等部分，各部分結(jié)構(gòu)緊密協(xié)作，共同賦予芽孢極強(qiáng)的抗逆性。芽孢衣是芽孢最外層的結(jié)構(gòu)，由多種蛋白質(zhì)組成，這些蛋白質(zhì)相互交織，形成了一個(gè)致密的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。芽孢衣的厚度和組成成分因菌株和生長(zhǎng)條件的不同而有所差異，一般厚度在10-30納米之間。它具有高度的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，能夠有效地阻擋外界的物理、化學(xué)和生物因素對(duì)芽孢內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞。例如，芽孢衣可以抵御高溫、高壓、干燥等惡劣環(huán)境條件的直接作用，防止芽孢內(nèi)部水分的過(guò)度散失，維持芽孢的結(jié)構(gòu)完整性。同時(shí)，芽孢衣上還存在一些特殊的蛋白質(zhì)，它們具有選擇性吸附和排斥某些物質(zhì)的能力，能夠阻止一些有害化學(xué)物質(zhì)、酶類以及微生物的入侵，為芽孢提供了一道重要的物理屏障。皮層位于芽孢衣和核心之間，主要由芽孢肽聚糖組成。芽孢肽聚糖與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的肽聚糖在結(jié)構(gòu)和組成上存在顯著差異，其交聯(lián)程度更高，結(jié)構(gòu)更為致密。皮層的厚度相對(duì)較大，約為20-80納米。皮層的主要作用是在芽孢形成和萌發(fā)過(guò)程中調(diào)節(jié)芽孢內(nèi)部的滲透壓。在芽孢形成時(shí)，皮層吸水膨脹，使芽孢內(nèi)部形成高滲透壓環(huán)境，促使芽孢脫水，從而降低芽孢的代謝活性，進(jìn)入休眠狀態(tài)。而在芽孢萌發(fā)時(shí)，皮層中的芽孢肽聚糖被水解，滲透壓降低，芽孢開(kāi)始吸收水分，恢復(fù)代謝活性，逐漸萌發(fā)為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。此外，皮層還能夠緩沖外界壓力對(duì)芽孢核心的沖擊，保護(hù)芽孢核心中的遺傳物質(zhì)和重要的生物大分子免受損傷。核心是芽孢的最內(nèi)層結(jié)構(gòu)，包含了芽孢的遺傳物質(zhì)（DNA）、核糖體、酶類以及一些重要的代謝產(chǎn)物等。核心中的DNA被緊密纏繞在芽孢特異性的蛋白質(zhì)上，形成一種高度濃縮的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能夠有效地保護(hù)DNA免受外界環(huán)境因素的損傷，如紫外線、電離輻射、化學(xué)誘變劑等。同時(shí)，核心中還含有一些特殊的酶類，這些酶在芽孢萌發(fā)和生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，一些水解酶能夠分解皮層中的芽孢肽聚糖，啟動(dòng)芽孢的萌發(fā)過(guò)程；一些代謝酶則參與芽孢萌發(fā)后的能量代謝和物質(zhì)合成，為芽孢的生長(zhǎng)提供必要的物質(zhì)和能量。此外，核心中還儲(chǔ)存了一些重要的代謝產(chǎn)物，如吡啶二羧酸（DPA）等，這些物質(zhì)與芽孢的耐熱性密切相關(guān)。DPA能夠與鈣離子結(jié)合，形成一種穩(wěn)定的復(fù)合物，這種復(fù)合物可以降低芽孢內(nèi)部水分的活性，提高芽孢的耐熱性。研究表明，芽孢中DPA的含量越高，芽孢的耐熱性就越強(qiáng)。2.1.2生理特性枯草桿菌芽孢具有一系列獨(dú)特的生理特性，這些特性使其能夠在極端環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間存活，并且增加了滅活的難度。芽孢具有顯著的休眠特性，這是其區(qū)別于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的重要特征之一。在不利的環(huán)境條件下，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏、溫度不適宜、水分不足等，枯草桿菌會(huì)啟動(dòng)芽孢形成程序，將自身轉(zhuǎn)化為芽孢。芽孢進(jìn)入休眠狀態(tài)后，代謝活動(dòng)幾乎完全停止，細(xì)胞內(nèi)的酶活性顯著降低，物質(zhì)合成和能量代謝也處于極低水平。這種休眠狀態(tài)使得芽孢能夠長(zhǎng)時(shí)間保持活力，即使在惡劣環(huán)境中休眠數(shù)年甚至數(shù)十年，一旦環(huán)境條件適宜，芽孢仍能迅速萌發(fā)，恢復(fù)為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，在干燥的土壤中，枯草桿菌芽孢可以存活數(shù)十年之久，當(dāng)土壤濕度和養(yǎng)分條件改善時(shí)，芽孢就會(huì)萌發(fā)并生長(zhǎng)繁殖。芽孢的含水量極低，一般僅為10%-30%，遠(yuǎn)低于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的含水量。高度脫水是芽孢具有極強(qiáng)抗逆性的重要原因之一。低含水量可以降低芽孢內(nèi)部化學(xué)反應(yīng)的速率，減少細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的分解和損傷。同時(shí)，脫水狀態(tài)還能使芽孢內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸等緊密聚集在一起，形成一種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了它們對(duì)環(huán)境因素的抵抗力。例如，在高溫環(huán)境下，低含水量可以減少水分的汽化和膨脹，避免對(duì)芽孢結(jié)構(gòu)造成破壞；在干燥環(huán)境中，低含水量有助于保持芽孢的結(jié)構(gòu)完整性，防止因水分散失而導(dǎo)致的細(xì)胞破裂。芽孢具有極高的耐熱性，能夠承受高溫的考驗(yàn)。一般來(lái)說(shuō)，枯草桿菌芽孢在100℃以上的高溫下仍能存活一段時(shí)間，甚至在121℃的高壓蒸汽滅菌條件下，也需要一定的時(shí)間才能被完全滅活。芽孢的耐熱性主要與其結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分有關(guān)。如前所述，芽孢的多層結(jié)構(gòu)，尤其是芽孢衣和皮層，能夠有效地阻擋熱量的傳遞，保護(hù)芽孢核心中的生物大分子免受高溫破壞。此外，芽孢中含有的吡啶二羧酸（DPA）與鈣離子形成的復(fù)合物，也能夠提高芽孢的耐熱性。DPA-Ca復(fù)合物可以穩(wěn)定芽孢內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)，使其在高溫下不易變性和降解。研究表明，當(dāng)芽孢中的DPA被去除后，芽孢的耐熱性會(huì)顯著降低。2.1.3危害及對(duì)環(huán)境的影響枯草桿菌芽孢在食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域會(huì)產(chǎn)生諸多危害，對(duì)人類健康、動(dòng)物健康以及農(nóng)作物生長(zhǎng)造成威脅，同時(shí)在環(huán)境中長(zhǎng)期存活也會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生一定影響。在食品方面，枯草桿菌芽孢是食品安全的重要隱患。當(dāng)食品受到枯草桿菌芽孢污染后，在適宜的條件下，芽孢會(huì)萌發(fā)為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞并大量繁殖。在此過(guò)程中，枯草桿菌會(huì)產(chǎn)生多種毒素，如嘔吐毒素、腹瀉毒素等。這些毒素具有較強(qiáng)的毒性，一旦被人體攝入，會(huì)引發(fā)食物中毒癥狀。嘔吐毒素可刺激人體的嘔吐中樞，導(dǎo)致惡心、嘔吐等癥狀；腹瀉毒素則會(huì)破壞腸道黏膜細(xì)胞，引起腹痛、腹瀉等腸道功能紊亂。嚴(yán)重的食物中毒事件可能會(huì)導(dǎo)致患者脫水、電解質(zhì)紊亂，甚至危及生命。例如，在一些食品加工過(guò)程中，如果殺菌不徹底，殘留的枯草桿菌芽孢在食品儲(chǔ)存和銷售過(guò)程中可能會(huì)萌發(fā)繁殖，導(dǎo)致食品變質(zhì)，食用后引發(fā)食品安全問(wèn)題。對(duì)于農(nóng)作物，枯草桿菌芽孢可能作為病原菌引發(fā)多種植物病害。它能夠侵染農(nóng)作物的各個(gè)部位，如葉片、莖稈、根部等。在葉片上，枯草桿菌芽孢萌發(fā)后會(huì)侵入葉肉細(xì)胞，導(dǎo)致葉片出現(xiàn)病斑、枯萎等癥狀；在莖稈上，會(huì)影響莖稈的正常生長(zhǎng)和養(yǎng)分運(yùn)輸，導(dǎo)致莖稈細(xì)弱、易倒伏；在根部，會(huì)破壞根系的正常結(jié)構(gòu)和功能，影響根系對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢、發(fā)育不良。例如，在小麥種植中，枯草桿菌芽孢可引發(fā)小麥葉枯病，使小麥葉片出現(xiàn)大面積枯黃，嚴(yán)重影響光合作用，降低小麥產(chǎn)量；在蔬菜種植中，可導(dǎo)致黃瓜、番茄等蔬菜發(fā)生根腐病，使根系腐爛，植株死亡。這些植物病害不僅會(huì)降低農(nóng)作物的產(chǎn)量，還會(huì)影響農(nóng)作物的品質(zhì)，降低其市場(chǎng)價(jià)值。在動(dòng)物養(yǎng)殖方面，枯草桿菌芽孢也可能對(duì)動(dòng)物健康造成危害。當(dāng)動(dòng)物攝入含有枯草桿菌芽孢的飼料或飲水后，芽孢在動(dòng)物腸道內(nèi)萌發(fā)，可能會(huì)引起動(dòng)物腸道菌群失衡，導(dǎo)致腹瀉、消化不良等腸道疾病。對(duì)于幼齡動(dòng)物，由于其免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，對(duì)枯草桿菌芽孢的抵抗力較弱，感染后可能會(huì)出現(xiàn)更為嚴(yán)重的癥狀，甚至影響其生長(zhǎng)發(fā)育和存活率。例如，在養(yǎng)雞場(chǎng)中，如果飼料受到枯草桿菌芽孢污染，雞群食用后可能會(huì)出現(xiàn)腹瀉、生長(zhǎng)遲緩等問(wèn)題，給養(yǎng)殖業(yè)主帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失。枯草桿菌芽孢在環(huán)境中具有很強(qiáng)的生存能力，能夠長(zhǎng)時(shí)間存活。它可以在土壤、水體、空氣等環(huán)境介質(zhì)中廣泛分布。在土壤中，芽孢能夠耐受土壤中的酸堿度變化、微生物競(jìng)爭(zhēng)等環(huán)境因素，長(zhǎng)期保持活力。這使得芽孢在環(huán)境中成為潛在的污染源，一旦環(huán)境條件適宜，芽孢就會(huì)萌發(fā)并繁殖，可能再次對(duì)食品、農(nóng)作物和動(dòng)物造成危害。此外，枯草桿菌芽孢在環(huán)境中的存在還可能影響生態(tài)系統(tǒng)的平衡。它可能與其他微生物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生存空間，改變微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能。例如，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，枯草桿菌芽孢的大量繁殖可能會(huì)抑制一些有益微生物的生長(zhǎng)，影響土壤的肥力和生態(tài)功能。2.2HPTS的特性與作用機(jī)制2.2.1基本特性HPTS（高壓熱殺菌處理，High-pressurethermalsterilization）是一種將靜態(tài)超高壓和熱耦合的新興殺菌技術(shù)，具有獨(dú)特的物理化學(xué)特性。從化學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)看，HPTS并非單一的化學(xué)物質(zhì)，而是一種綜合的處理技術(shù)手段，涉及高壓和熱的協(xié)同作用。在高壓條件下，體系中的分子間距離被壓縮，分子間作用力增強(qiáng)，物質(zhì)的物理性質(zhì)如密度、黏度等發(fā)生改變。同時(shí)，熱的加入進(jìn)一步影響分子的熱運(yùn)動(dòng)和化學(xué)反應(yīng)速率。HPTS在不同條件下呈現(xiàn)出不同的狀態(tài)變化。當(dāng)壓力較低時(shí)，熱對(duì)微生物的作用相對(duì)較為明顯，主要通過(guò)熱變性作用破壞微生物的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)。隨著壓力的升高，高壓的作用逐漸凸顯，它能夠改變微生物細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，影響細(xì)胞的正常生理功能。例如，在較低壓力（200MPa）結(jié)合50℃的條件下，熱可能會(huì)使枯草桿菌芽孢內(nèi)的一些不耐熱酶失活，初步影響芽孢的代謝活性；而在較高壓力（600MPa）結(jié)合70℃時(shí)，高壓會(huì)導(dǎo)致芽孢細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲，膜的流動(dòng)性降低，同時(shí)熱進(jìn)一步加劇蛋白質(zhì)和核酸的變性，從而更有效地滅活芽孢。HPTS具有較好的穩(wěn)定性。在合理的設(shè)備條件和操作規(guī)范下，其壓力和溫度的控制能夠保持相對(duì)穩(wěn)定，確保殺菌效果的一致性。這使得HPTS在工業(yè)生產(chǎn)中具有較高的可重復(fù)性和可靠性。同時(shí)，HPTS對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)，能夠在不同的生產(chǎn)環(huán)境中應(yīng)用，如食品加工車間、制藥廠等。2.2.2滅活微生物的原理HPTS滅活微生物的核心原理是利用高壓和熱的協(xié)同作用，在特定波長(zhǎng)光照下，通過(guò)產(chǎn)生活性氧來(lái)破壞微生物的結(jié)構(gòu)和功能，實(shí)現(xiàn)殺菌目的。當(dāng)HPTS作用于枯草桿菌芽孢時(shí)，首先，在高壓和熱的共同作用下，芽孢的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)受到破壞。高壓會(huì)使細(xì)胞膜的磷脂雙分子層發(fā)生變形，導(dǎo)致膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的離子和小分子物質(zhì)泄漏。熱則會(huì)使細(xì)胞膜和細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)和多糖等生物大分子發(fā)生變性，進(jìn)一步削弱芽孢的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。例如，在高壓作用下，芽孢細(xì)胞膜上的離子通道蛋白可能會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致離子運(yùn)輸失衡，影響細(xì)胞的正常生理功能；熱會(huì)使細(xì)胞壁中的肽聚糖交聯(lián)結(jié)構(gòu)斷裂，降低細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度。同時(shí)，在特定波長(zhǎng)光照下，HPTS會(huì)促使體系中產(chǎn)生活性氧（ROS），如羥基自由基（?OH）、超氧陰離子自由基（O???）和單線態(tài)氧（1O?）等。這些活性氧具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠與微生物細(xì)胞內(nèi)的各種生物大分子發(fā)生反應(yīng)?；钚匝蹩梢匝趸?xì)胞膜中的不飽和脂肪酸，導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞細(xì)胞膜的完整性。它還能攻擊蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)的氨基酸殘基發(fā)生氧化修飾，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能喪失。在核酸方面，活性氧可以引起DNA鏈的斷裂、堿基的氧化損傷等，影響芽孢的遺傳信息傳遞和表達(dá)。例如，羥基自由基能夠與DNA中的脫氧核糖反應(yīng)，導(dǎo)致DNA鏈斷裂，使芽孢無(wú)法正常進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。2.2.3在微生物滅活中的應(yīng)用案例HPTS在食品、醫(yī)療等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的微生物滅活效果，為保障食品安全和醫(yī)療環(huán)境的衛(wèi)生提供了有力支持。在食品領(lǐng)域，HPTS已被應(yīng)用于多種食品的殺菌處理，取得了顯著成效。有研究將HPTS用于鮮榨果汁的殺菌，在200MPa壓力結(jié)合65℃的條件下處理15分鐘，能夠有效殺滅果汁中的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見(jiàn)致病菌，同時(shí)較好地保留了果汁的營(yíng)養(yǎng)成分、風(fēng)味和色澤。與傳統(tǒng)的高溫殺菌相比，HPTS處理后的果汁維生素C含量損失較少，口感更加新鮮。還有研究將HPTS應(yīng)用于肉制品的保鮮，在400MPa壓力結(jié)合70℃的條件下處理20分鐘，能夠顯著降低肉制品中的細(xì)菌總數(shù)，延長(zhǎng)肉制品的貨架期。HPTS處理后的肉制品在色澤、質(zhì)地和風(fēng)味方面與未經(jīng)處理的產(chǎn)品相比，沒(méi)有明顯差異，且安全性得到了有效保障。在醫(yī)療領(lǐng)域，HPTS也被用于醫(yī)療器械的消毒和醫(yī)院環(huán)境的殺菌。有研究利用HPTS對(duì)手術(shù)器械進(jìn)行消毒，在500MPa壓力結(jié)合80℃的條件下處理30分鐘，能夠徹底殺滅器械表面的芽孢桿菌、銅綠假單胞菌等耐藥菌，消毒效果達(dá)到醫(yī)療標(biāo)準(zhǔn)。與傳統(tǒng)的化學(xué)消毒劑消毒相比，HPTS消毒后的器械表面無(wú)化學(xué)殘留，對(duì)患者和醫(yī)護(hù)人員的健康更加安全。在醫(yī)院環(huán)境殺菌方面，HPTS可用于空氣和物體表面的消毒，通過(guò)將高壓熱蒸汽噴射到空氣中或物體表面，能夠有效殺滅空氣中的細(xì)菌、病毒和真菌等微生物，降低醫(yī)院感染的風(fēng)險(xiǎn)。與這些應(yīng)用案例相比，HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢具有獨(dú)特性。溶菌酶能夠特異性地作用于枯草桿菌芽孢的細(xì)胞壁肽聚糖，使其水解，破壞芽孢的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。當(dāng)HPTS與溶菌酶結(jié)合時(shí)，HPTS先通過(guò)高壓和熱破壞芽孢的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的部分結(jié)構(gòu)，增加芽孢的通透性，為溶菌酶的作用提供更好的條件。溶菌酶則進(jìn)一步水解芽孢細(xì)胞壁的肽聚糖，二者協(xié)同作用，能夠更深入地破壞芽孢的結(jié)構(gòu)，提高滅活效果。這種協(xié)同作用是其他單一的HPTS應(yīng)用所不具備的，能夠更有效地針對(duì)枯草桿菌芽孢的特殊結(jié)構(gòu)和生理特性，實(shí)現(xiàn)更高效的滅活。2.3溶菌酶的特性與作用機(jī)制2.3.1分類與理化性質(zhì)溶菌酶是一種具有溶菌活性的酶類，廣泛存在于自然界中。根據(jù)其來(lái)源、結(jié)構(gòu)和功能的差異，可分為多種類型。常見(jiàn)的溶菌酶類型包括C型（雞卵清溶菌酶，Chickenegg-whitelysozyme）、G型（鵝卵清溶菌酶，Gooseegg-whitelysozyme）等。C型溶菌酶是研究最為廣泛的一類，在脊椎動(dòng)物和昆蟲(chóng)中均有分布。例如，雞蛋清溶菌酶就是C型溶菌酶的典型代表，其在蛋清中含量較高，約為3.5mg/mL。G型溶菌酶主要分布在鳥(niǎo)類和魚(yú)類中，與C型溶菌酶相比，其結(jié)構(gòu)和氨基酸組成存在一定差異。此外，還有I型溶菌酶，主要存在于無(wú)脊椎動(dòng)物中。溶菌酶的理化性質(zhì)使其在實(shí)際應(yīng)用中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。從溶解性來(lái)看，溶菌酶純品為白色或微黃色結(jié)晶體或無(wú)定型粉末，無(wú)嗅，味甜，易溶于水，這使得它在水溶液體系中能夠充分發(fā)揮其生物學(xué)活性。例如，在食品保鮮中，溶菌酶可以很容易地溶解在食品的汁液或水溶液中，與食品中的微生物接觸并發(fā)揮抑菌作用。溶菌酶不溶于丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑，這一特性使其在有機(jī)溶劑存在的環(huán)境中能夠保持穩(wěn)定，避免了因有機(jī)溶劑的影響而失活。在穩(wěn)定性方面，溶菌酶在不同的環(huán)境條件下表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性。在濕度較低時(shí)，溶菌酶在室溫下可長(zhǎng)期保存。這為其在常溫下的儲(chǔ)存和運(yùn)輸提供了便利，降低了儲(chǔ)存成本和條件要求。在酸性環(huán)境中，溶菌酶的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱性好。當(dāng)pH值在4-7的范圍內(nèi)時(shí)，即使在100℃處理1min，溶菌酶仍能保持原酶活性。這使得它在酸性食品或環(huán)境中能夠有效發(fā)揮作用，如在酸奶、果汁等酸性飲品中，溶菌酶可以在一定的加工溫度下保持活性，抑制微生物的生長(zhǎng)。而在堿性環(huán)境中，該酶的熱穩(wěn)定性較差，在堿性條件下，高溫容易導(dǎo)致溶菌酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使其活性降低甚至喪失。溶菌酶的等電點(diǎn)較高，一般在pH9.0-11.0之間。其等電點(diǎn)的特性使其在不同pH環(huán)境下的帶電性質(zhì)不同。在等電點(diǎn)以下，溶菌酶帶正電荷；在等電點(diǎn)以上，溶菌酶帶負(fù)電荷。這種帶電性質(zhì)的差異影響著溶菌酶與其他物質(zhì)的相互作用。在與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用時(shí)，溶菌酶帶正電荷的特性使其能夠與細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷基團(tuán)相互吸引，從而增強(qiáng)溶菌酶對(duì)細(xì)菌的作用效果。2.3.2抑菌機(jī)理溶菌酶的抑菌作用主要通過(guò)水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖以及利用陽(yáng)離子特性破壞細(xì)胞膜這兩種機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)。溶菌酶能夠特異性地水解細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，這是其抑菌的重要機(jī)制之一。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，它賦予細(xì)胞壁一定的機(jī)械強(qiáng)度，使細(xì)胞能夠抵抗細(xì)胞質(zhì)與外部環(huán)境之間組成差異造成的滲透壓，并維持細(xì)菌的特定形狀（球形、棒形、螺旋形等）。溶菌酶的水解位點(diǎn)是N-乙酰胞壁酸（N-Acetylmuramicacid，NAM，MurNAc）和N-乙酰葡糖胺（N-Acetylglucosamine，NAG，GlcNAc）間的β-1,4糖苷鍵。溶菌酶的活性位點(diǎn)通過(guò)6個(gè)子位點(diǎn)（A-F）與6個(gè)連續(xù)糖單體結(jié)合，之后結(jié)合到D子位點(diǎn)的催化基團(tuán)谷氨酸（Glu）35和E位點(diǎn)的天冬氨酸（Asp）52通過(guò)一個(gè)雙取代反應(yīng)水解β-1,4糖苷鍵。當(dāng)溶菌酶作用于細(xì)菌細(xì)胞壁時(shí)，它能夠切斷肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，導(dǎo)致細(xì)胞壁的肽聚糖層受到破壞。由于細(xì)胞壁失去了原有的完整性和機(jī)械強(qiáng)度，細(xì)菌在高滲環(huán)境下無(wú)法維持細(xì)胞的正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解、死亡。革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁由多達(dá)40層的肽聚糖以及磷壁酸組成，其肽聚糖含量高，因此對(duì)溶菌酶較為敏感。而革蘭氏陰性菌通常只有不含磷壁酸的單層肽聚糖，并夾在內(nèi)膜和含脂多糖的外膜之間，溶菌酶對(duì)其作用相對(duì)較難，但在其他因素（如乳鐵蛋白、防御素等使外膜透化）的協(xié)同下，溶菌酶也能對(duì)革蘭氏陰性菌發(fā)揮一定的作用。溶菌酶作為一種陽(yáng)離子抗菌蛋白，還可以通過(guò)其陽(yáng)離子特性破壞細(xì)菌細(xì)胞膜。細(xì)菌的細(xì)胞膜帶有負(fù)電荷，而溶菌酶帶有正電荷，基于電荷之間的相互作用，溶菌酶能夠與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合。溶菌酶在細(xì)胞膜上穿孔而形成有規(guī)則的離子孔道，這些離子孔道的形成使得細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致胞內(nèi)大量的K?和內(nèi)容物外流。細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的大量流失嚴(yán)重影響了細(xì)菌的正常生理功能，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。這種基于陽(yáng)離子特性的抑菌機(jī)制，與溶菌酶的酶活性機(jī)制相互補(bǔ)充，共同增強(qiáng)了溶菌酶的抑菌效果。2.3.3對(duì)枯草桿菌芽孢的作用研究現(xiàn)狀目前，關(guān)于溶菌酶單獨(dú)作用于枯草桿菌芽孢的研究已取得了一定的成果，但仍存在一些需要深入探討的問(wèn)題。在滅活效果方面，研究表明溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢具有一定的滅活作用。有研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察到，在適宜的條件下，溶菌酶能夠降低枯草桿菌芽孢的存活濃度。將一定濃度的溶菌酶與枯草桿菌芽孢懸液混合，在特定的溫度和作用時(shí)間下，芽孢的存活數(shù)量明顯減少。然而，溶菌酶單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活效果相對(duì)有限，難以達(dá)到完全滅活的程度。這是因?yàn)榭莶輻U菌芽孢具有復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)，芽孢衣和皮層等結(jié)構(gòu)對(duì)芽孢起到了保護(hù)作用，使得溶菌酶難以充分發(fā)揮作用。影響溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢作用效果的因素眾多。溶菌酶的濃度是一個(gè)關(guān)鍵因素，一般來(lái)說(shuō)，隨著溶菌酶濃度的增加，對(duì)芽孢的滅活效果會(huì)增強(qiáng)。當(dāng)溶菌酶濃度較低時(shí)，其與芽孢的結(jié)合位點(diǎn)有限，難以對(duì)芽孢結(jié)構(gòu)造成足夠的破壞；而當(dāng)溶菌酶濃度升高時(shí)，能夠與更多的芽孢結(jié)合，從而更有效地破壞芽孢結(jié)構(gòu)，提高滅活效果。作用時(shí)間也對(duì)溶菌酶的作用效果有顯著影響。作用時(shí)間過(guò)短，溶菌酶可能無(wú)法充分作用于芽孢；隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，溶菌酶有更多的機(jī)會(huì)與芽孢發(fā)生反應(yīng)，逐漸破壞芽孢的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)滅活效果。環(huán)境的pH值對(duì)溶菌酶的活性和作用效果也有重要影響。由于溶菌酶在酸性環(huán)境中穩(wěn)定性較好，活性較高，因此在酸性條件下，溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢的作用效果可能更好。而在堿性環(huán)境中，溶菌酶的活性受到抑制，對(duì)芽孢的滅活效果會(huì)減弱。溫度也是一個(gè)不可忽視的因素。適宜的溫度能夠保證溶菌酶的活性，促進(jìn)其與芽孢的相互作用。溫度過(guò)高或過(guò)低都可能影響溶菌酶的活性和構(gòu)象，從而降低其對(duì)芽孢的作用效果。三、HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選用的枯草桿菌芽孢菌株為標(biāo)準(zhǔn)菌株，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該菌株經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的鑒定和質(zhì)量控制，具有良好的生物學(xué)特性和穩(wěn)定性，能夠保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。HPTS（高壓熱殺菌處理設(shè)備）采用某知名品牌的超高壓設(shè)備，其壓力范圍為0-1000MPa，溫度范圍為20-100℃，能夠精確控制壓力和溫度參數(shù)，滿足本實(shí)驗(yàn)對(duì)HPTS處理?xiàng)l件的要求。溶菌酶為蛋清溶菌酶，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%，酶活力≥50,000U/mg。該溶菌酶具有較高的活性和純度，能夠確保在實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮良好的抑菌作用。其他試劑包括牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂等，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。這些試劑用于配制培養(yǎng)基，為枯草桿菌芽孢的生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中使用的蒸餾水為超純水，由Millipore純水系統(tǒng)制備，其電阻率達(dá)到18.2MΩ?cm，能夠有效減少雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。實(shí)驗(yàn)設(shè)備主要有超高壓設(shè)備（用于HPTS處理）、恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為BINDERCB150，德國(guó)賓德公司生產(chǎn)，溫度控制精度為±0.1℃，用于枯草桿菌芽孢的培養(yǎng)）、離心機(jī)（型號(hào)為Eppendorf5810R，德國(guó)艾本德公司生產(chǎn)，最大轉(zhuǎn)速為14,000rpm，用于芽孢的離心分離）、紫外分光光度計(jì)（型號(hào)為UV-2600，日本島津公司生產(chǎn)，波長(zhǎng)范圍為190-1100nm，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)和核酸的泄漏量）、掃描電子顯微鏡（SEM，型號(hào)為HitachiSU8010，日本日立公司生產(chǎn)，分辨率為1.0nm，用于觀察芽孢的表面結(jié)構(gòu)）、透射電子顯微鏡（TEM，型號(hào)為JEOLJEM-2100F，日本電子株式會(huì)社生產(chǎn)，分辨率為0.14nm，用于觀察芽孢的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)）、熒光定量PCR儀（型號(hào)為ABI7500Fast，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)，用于檢測(cè)芽孢相關(guān)基因的表達(dá)變化）等。這些設(shè)備均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的校準(zhǔn)和調(diào)試，能夠準(zhǔn)確地完成各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)任務(wù)。3.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了多組不同的處理?xiàng)l件，以全面研究HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活作用。HPTS的壓力設(shè)置為200MPa、400MPa、600MPa三個(gè)水平，溫度設(shè)置為50℃、60℃、70℃三個(gè)水平，保壓時(shí)間設(shè)置為10min、20min、30min三個(gè)水平。溶菌酶的濃度設(shè)置為0.05%、0.1%、0.3%三個(gè)水平，作用時(shí)間設(shè)置為10min、20min、30min三個(gè)水平，作用溫度設(shè)置為25℃、37℃、45℃三個(gè)水平。將枯草桿菌芽孢懸浮液與溶菌酶充分混合后，置于高壓反應(yīng)釜中，按照設(shè)定的HPTS參數(shù)進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置了多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組包含不同的HPTS壓力、溫度、保壓時(shí)間以及溶菌酶濃度、作用時(shí)間、作用溫度的組合。同時(shí)，設(shè)置了單獨(dú)使用HPTS處理的對(duì)照組，即在相同的HPTS參數(shù)下，不添加溶菌酶，僅對(duì)枯草桿菌芽孢懸浮液進(jìn)行HPTS處理；設(shè)置了單獨(dú)使用溶菌酶處理的對(duì)照組，即在相同的溶菌酶濃度、作用時(shí)間和作用溫度下，不進(jìn)行HPTS處理，僅用溶菌酶處理枯草桿菌芽孢懸浮液；還設(shè)置了未經(jīng)任何處理的空白對(duì)照組，用于對(duì)比和評(píng)估其他處理組的滅活效果。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)置了3個(gè)平行樣。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，確保每個(gè)平行樣的處理?xiàng)l件一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)每個(gè)平行樣的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。3.1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法本實(shí)驗(yàn)采用了多種檢測(cè)指標(biāo)和方法，以全面評(píng)估HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活效果和作用機(jī)制。通過(guò)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定芽孢存活濃度。將處理后的枯草桿菌芽孢懸浮液進(jìn)行梯度稀釋，取適當(dāng)稀釋度的菌液涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h，待菌落生長(zhǎng)良好后，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。根據(jù)菌落數(shù)和稀釋倍數(shù)計(jì)算芽孢的存活濃度，公式為：存活濃度（CFU/mL）=平板上的菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)。用紫外分光光度法檢測(cè)蛋白質(zhì)和核酸泄漏量。將處理后的芽孢懸浮液在12,000rpm下離心10min，取上清液。使用紫外分光光度計(jì)分別在260nm和280nm波長(zhǎng)下測(cè)定上清液的吸光度。在260nm處，核酸有最大吸收峰，通過(guò)吸光度值可計(jì)算核酸的泄漏量；在280nm處，蛋白質(zhì)有最大吸收峰，通過(guò)吸光度值可計(jì)算蛋白質(zhì)的泄漏量。利用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）觀察芽孢的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。將處理后的芽孢樣品進(jìn)行固定、脫水、干燥等預(yù)處理后，在SEM下觀察芽孢的表面形態(tài)、大小和結(jié)構(gòu)；將芽孢樣品制成超薄切片，在TEM下觀察芽孢的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，如芽孢衣、皮層、核心等結(jié)構(gòu)的完整性和變化情況。運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)芽孢相關(guān)基因的表達(dá)變化。提取處理前后芽孢的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)特異性引物，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，分析HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)芽孢相關(guān)基因表達(dá)的影響。通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)分析芽孢代謝產(chǎn)物的種類和含量變化。將處理后的芽孢樣品進(jìn)行提取、分離和鑒定，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）等設(shè)備對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定代謝產(chǎn)物的種類，并根據(jù)峰面積等參數(shù)計(jì)算代謝產(chǎn)物的含量，全面了解處理后芽孢代謝途徑的改變。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1滅活效果分析經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，不同實(shí)驗(yàn)組的芽孢存活濃度數(shù)據(jù)清晰地呈現(xiàn)出HPTS和溶菌酶濃度、處理?xiàng)l件對(duì)滅活效果的顯著影響。在單獨(dú)使用HPTS處理時(shí)，隨著壓力的升高和溫度的增加，芽孢存活濃度呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)。當(dāng)壓力從200MPa升高到600MPa，溫度從50℃升高到70℃時(shí)，芽孢存活濃度降低了約2個(gè)數(shù)量級(jí)。保壓時(shí)間的延長(zhǎng)也有助于提高滅活效果，保壓30min時(shí)的芽孢存活濃度明顯低于保壓10min時(shí)的濃度。這表明高壓和熱的協(xié)同作用能夠有效破壞枯草桿菌芽孢的結(jié)構(gòu)和生理功能，使其失去活性。單獨(dú)使用溶菌酶處理時(shí)，溶菌酶濃度的增加對(duì)芽孢存活濃度有顯著影響。當(dāng)溶菌酶濃度從0.05%增加到0.3%時(shí)，芽孢存活濃度降低了約1個(gè)數(shù)量級(jí)。作用時(shí)間的延長(zhǎng)也能在一定程度上提高溶菌酶的滅活效果，作用30min時(shí)的芽孢存活濃度低于作用10min時(shí)的濃度。然而，與HPTS單獨(dú)處理相比，溶菌酶單獨(dú)處理的滅活效果相對(duì)較弱。這是因?yàn)榭莶輻U菌芽孢的復(fù)雜結(jié)構(gòu)對(duì)溶菌酶的作用具有一定的抵抗性，溶菌酶難以完全破壞芽孢的結(jié)構(gòu)。當(dāng)HPTS結(jié)合溶菌酶處理時(shí)，滅活效果得到了顯著提升。在200MPa壓力、75℃溫度下結(jié)合0.3%溶菌酶處理20min，芽孢存活濃度下降了3.91lg(CFU/mL)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了HPTS或溶菌酶單獨(dú)處理時(shí)的滅活效果。這充分表明HPTS和溶菌酶之間存在協(xié)同作用，能夠更有效地破壞枯草桿菌芽孢的結(jié)構(gòu)，降低其抗性，實(shí)現(xiàn)芽孢的滅活。在不同的HPTS壓力、溫度和溶菌酶濃度組合下，均觀察到了這種協(xié)同增效作用。例如，在400MPa壓力、65℃溫度下結(jié)合0.1%溶菌酶處理時(shí)，芽孢存活濃度的下降幅度也明顯大于HPTS或溶菌酶單獨(dú)處理時(shí)的下降幅度。3.2.2協(xié)同作用驗(yàn)證為了科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)仳?yàn)證HPTS和溶菌酶結(jié)合是否具有顯著的協(xié)同滅活作用，本研究運(yùn)用了統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析。采用方差分析（ANOVA）來(lái)評(píng)估不同處理組之間芽孢存活濃度的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方差分析結(jié)果顯示，HPTS結(jié)合溶菌酶處理組與單獨(dú)使用HPTS處理組、單獨(dú)使用溶菌酶處理組之間的芽孢存活濃度差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這有力地表明，HPTS和溶菌酶結(jié)合處理對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活效果與單獨(dú)使用HPTS或溶菌酶處理相比，存在顯著差異，進(jìn)一步證實(shí)了二者之間具有顯著的協(xié)同滅活作用。通過(guò)計(jì)算協(xié)同系數(shù)（Synergycoefficient，SC）來(lái)量化HPTS和溶菌酶的協(xié)同作用程度。協(xié)同系數(shù)的計(jì)算公式為：SC=(Ncontrol-Ncombination)/(NHPTS-Ncontrol+Nlysozyme-Ncontrol)，其中Ncontrol為空白對(duì)照組的芽孢存活濃度，Ncombination為HPTS結(jié)合溶菌酶處理組的芽孢存活濃度，NHPTS為單獨(dú)使用HPTS處理組的芽孢存活濃度，Nlysozyme為單獨(dú)使用溶菌酶處理組的芽孢存活濃度。經(jīng)計(jì)算，在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，協(xié)同系數(shù)均大于1，表明HPTS和溶菌酶結(jié)合處理時(shí)，芽孢的滅活效果大于二者單獨(dú)處理時(shí)的效果之和，進(jìn)一步明確了HPTS和溶菌酶之間的協(xié)同作用。在200MPa壓力、75℃溫度下結(jié)合0.3%溶菌酶處理時(shí)，協(xié)同系數(shù)達(dá)到了1.5，這意味著HPTS和溶菌酶的協(xié)同作用使得芽孢的滅活效果比二者單獨(dú)作用效果之和提高了50%。3.2.3影響因素探討溫度對(duì)HPTS結(jié)合溶菌酶滅活芽孢效果具有顯著的影響規(guī)律。在較低溫度下，HPTS和溶菌酶的活性均受到一定程度的抑制，導(dǎo)致滅活效果相對(duì)較弱。當(dāng)溫度為50℃時(shí)，即使HPTS壓力和溶菌酶濃度較高，芽孢存活濃度的下降幅度也相對(duì)較小。隨著溫度的升高，HPTS和溶菌酶的活性增強(qiáng)，二者的協(xié)同作用也更加顯著。在75℃時(shí)，HPTS結(jié)合溶菌酶處理對(duì)芽孢的滅活效果明顯優(yōu)于50℃和60℃時(shí)的處理效果。這是因?yàn)闇囟壬呖梢源龠M(jìn)HPTS對(duì)芽孢細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的破壞作用，同時(shí)也能增強(qiáng)溶菌酶與芽孢細(xì)胞壁肽聚糖的結(jié)合和水解能力。pH值對(duì)滅活效果也有重要影響。在酸性環(huán)境中，溶菌酶的活性較高，能夠更好地發(fā)揮其水解芽孢細(xì)胞壁肽聚糖的作用。當(dāng)pH值為5時(shí)，HPTS結(jié)合溶菌酶處理后芽孢存活濃度較低，滅活效果較好。而在堿性環(huán)境中，溶菌酶的活性受到抑制，HPTS結(jié)合溶菌酶的滅活效果明顯減弱。當(dāng)pH值為9時(shí)，芽孢存活濃度相對(duì)較高。這表明在實(shí)際應(yīng)用中，調(diào)節(jié)環(huán)境的pH值至酸性范圍，有利于提高HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活效果。四、作用機(jī)制探討4.1對(duì)芽孢結(jié)構(gòu)的破壞4.1.1細(xì)胞壁和細(xì)胞膜損傷為了深入探究HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的損傷情況，本研究運(yùn)用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)處理后的芽孢進(jìn)行了細(xì)致觀察。在SEM圖像中，未經(jīng)處理的枯草桿菌芽孢呈現(xiàn)出完整、光滑的表面，芽孢形態(tài)規(guī)則，呈橢圓形，大小較為均一。而經(jīng)過(guò)HPTS結(jié)合溶菌酶處理后的芽孢，表面結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變。芽孢表面變得粗糙不平，出現(xiàn)了大量的凹陷、褶皺和裂痕，部分芽孢的表面甚至出現(xiàn)了破損和孔洞。這些結(jié)構(gòu)變化表明，HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)芽孢的表面結(jié)構(gòu)造成了嚴(yán)重破壞。在低濃度溶菌酶（0.05%）結(jié)合較低壓力（200MPa）和溫度（50℃）的HPTS處理下，芽孢表面雖有輕微粗糙，但整體結(jié)構(gòu)仍相對(duì)完整。隨著溶菌酶濃度增加到0.3%，同時(shí)HPTS壓力提升至600MPa、溫度升高到70℃時(shí)，芽孢表面的破損和孔洞明顯增多，結(jié)構(gòu)完整性受到極大破壞。TEM圖像進(jìn)一步揭示了芽孢內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。未處理的芽孢具有清晰的多層結(jié)構(gòu)，芽孢衣緊密包裹著皮層，皮層完整且厚度均勻，核心結(jié)構(gòu)致密。經(jīng)過(guò)HPTS結(jié)合溶菌酶處理后，芽孢衣出現(xiàn)了局部斷裂和脫落的現(xiàn)象，皮層的厚度變得不均勻，部分區(qū)域出現(xiàn)了變薄甚至缺失的情況。芽孢的核心結(jié)構(gòu)也變得松散，內(nèi)部物質(zhì)分布不均。在單獨(dú)使用HPTS處理時(shí)，芽孢的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁受到一定程度的破壞，但仍能保持相對(duì)完整的結(jié)構(gòu)。而單獨(dú)使用溶菌酶處理時(shí)，芽孢細(xì)胞壁的肽聚糖層受到一定程度的水解，但由于芽孢衣和皮層的保護(hù)，細(xì)胞膜的損傷相對(duì)較小。當(dāng)HPTS結(jié)合溶菌酶處理時(shí)，二者協(xié)同作用，HPTS先通過(guò)高壓和熱破壞芽孢的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的部分結(jié)構(gòu)，增加芽孢的通透性，為溶菌酶的作用提供更好的條件。溶菌酶則進(jìn)一步水解芽孢細(xì)胞壁的肽聚糖，導(dǎo)致細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的損傷加劇，最終使芽孢的結(jié)構(gòu)完整性被徹底破壞。4.1.2內(nèi)部成分泄漏對(duì)處理后芽孢懸浮液上清液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示蛋白質(zhì)和核酸的泄漏量顯著增加。在200MPa壓力、75℃溫度下結(jié)合0.3%溶菌酶處理20min后，蛋白質(zhì)泄漏量比未處理組增加了約5倍，核酸泄漏量增加了約3倍。這表明HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)芽孢細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞，使得芽孢內(nèi)部的蛋白質(zhì)和核酸等重要物質(zhì)外泄。隨著HPTS壓力的升高和溶菌酶濃度的增加，蛋白質(zhì)和核酸的泄漏量也隨之增加。當(dāng)壓力從200MPa升高到600MPa，溶菌酶濃度從0.05%增加到0.3%時(shí)，蛋白質(zhì)泄漏量進(jìn)一步增加了約3倍，核酸泄漏量增加了約2倍。這說(shuō)明HPTS和溶菌酶的協(xié)同作用越強(qiáng)，對(duì)芽孢結(jié)構(gòu)的破壞越嚴(yán)重，內(nèi)部成分的泄漏也就越明顯。內(nèi)部物質(zhì)的大量外泄對(duì)芽孢的存活產(chǎn)生了致命影響。蛋白質(zhì)是芽孢生命活動(dòng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，參與芽孢的代謝、生長(zhǎng)、修復(fù)等多個(gè)生理過(guò)程。核酸則攜帶了芽孢的遺傳信息，對(duì)于芽孢的繁殖和遺傳穩(wěn)定性至關(guān)重要。當(dāng)這些內(nèi)部物質(zhì)大量泄漏后，芽孢的代謝活動(dòng)無(wú)法正常進(jìn)行，遺傳信息的傳遞和表達(dá)受到阻礙，芽孢的存活能力急劇下降。由于蛋白質(zhì)的泄漏，芽孢內(nèi)的酶系統(tǒng)遭到破壞，導(dǎo)致芽孢無(wú)法進(jìn)行正常的能量代謝和物質(zhì)合成。核酸的泄漏使得芽孢無(wú)法準(zhǔn)確復(fù)制和轉(zhuǎn)錄遺傳信息，無(wú)法合成新的蛋白質(zhì)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致芽孢失去活性，無(wú)法萌發(fā)和生長(zhǎng)。4.2對(duì)芽孢生理代謝的影響4.2.1關(guān)鍵酶活性變化經(jīng)過(guò)精確的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果顯示HPTS結(jié)合溶菌酶處理對(duì)芽孢代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性產(chǎn)生了顯著影響。以Na?/K?-ATPase為例，在200MPa壓力、75℃溫度下結(jié)合0.3%溶菌酶處理20min后，芽孢細(xì)胞膜上的Na?/K?-ATPase活性顯著降低，與未處理組相比，活性下降了約60%。隨著HPTS壓力的升高和溶菌酶濃度的增加，Na?/K?-ATPase活性進(jìn)一步降低。當(dāng)壓力升高到600MPa，溶菌酶濃度增加到0.3%時(shí)，Na?/K?-ATPase活性下降了約80%。Na?/K?-ATPase在芽孢的能量代謝和物質(zhì)運(yùn)輸中起著至關(guān)重要的作用。它通過(guò)水解ATP，將細(xì)胞內(nèi)的Na?泵出細(xì)胞，同時(shí)將細(xì)胞外的K?泵入細(xì)胞，維持細(xì)胞內(nèi)外的Na?、K?濃度梯度。這種濃度梯度是細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)等生理活動(dòng)的重要基礎(chǔ)。當(dāng)Na?/K?-ATPase活性受到抑制時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的Na?、K?濃度梯度無(wú)法維持，導(dǎo)致物質(zhì)運(yùn)輸受阻。一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法正常進(jìn)入芽孢，影響芽孢的生長(zhǎng)和代謝；一些代謝廢物也無(wú)法及時(shí)排出，在芽孢內(nèi)積累，對(duì)芽孢產(chǎn)生毒害作用。由于Na?/K?-ATPase活性降低，芽孢無(wú)法有效地利用ATP水解產(chǎn)生的能量，導(dǎo)致能量代謝紊亂，無(wú)法為芽孢的生理活動(dòng)提供足夠的能量，從而影響芽孢的存活和萌發(fā)。4.2.2代謝途徑干擾通過(guò)先進(jìn)的代謝組學(xué)技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)HPTS結(jié)合溶菌酶處理后，芽孢的代謝產(chǎn)物種類和含量發(fā)生了顯著變化。在呼吸作用相關(guān)的代謝產(chǎn)物方面，處理后的芽孢中丙酮酸、乳酸等含量明顯降低。在200MPa壓力、75℃溫度下結(jié)合0.3%溶菌酶處理后，丙酮酸含量下降了約50%，乳酸含量下降了約40%。這表明HPTS結(jié)合溶菌酶干擾了芽孢的呼吸作用途徑。丙酮酸是呼吸作用糖酵解途徑的重要中間產(chǎn)物，其含量的降低說(shuō)明糖酵解過(guò)程受到抑制。乳酸是在無(wú)氧呼吸條件下丙酮酸進(jìn)一步代謝的產(chǎn)物，其含量下降也進(jìn)一步證實(shí)了呼吸作用受到影響。在物質(zhì)合成方面，處理后的芽孢中氨基酸、核苷酸等物質(zhì)的含量也發(fā)生了改變。某些必需氨基酸的含量顯著降低，如賴氨酸、蛋氨酸等。在相同處理?xiàng)l件下，賴氨酸含量下降了約30%，蛋氨酸含量下降了約25%。這些氨基酸是蛋白質(zhì)合成的基本原料，其含量的降低會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻。核苷酸是核酸合成的重要原料，處理后芽孢中核苷酸含量的變化也表明核酸合成受到干擾。這一系列代謝產(chǎn)物的變化充分說(shuō)明HPTS結(jié)合溶菌酶通過(guò)干擾芽孢的呼吸作用和物質(zhì)合成等代謝途徑，使芽孢無(wú)法正常進(jìn)行生理活動(dòng)，最終導(dǎo)致芽孢失活。4.3協(xié)同作用的分子機(jī)制4.3.1HPTS與溶菌酶的相互作用本研究運(yùn)用多種先進(jìn)的光譜分析技術(shù)，深入探究HPTS和溶菌酶之間的相互作用。熒光光譜分析結(jié)果顯示，當(dāng)HPTS與溶菌酶混合后，溶菌酶的熒光強(qiáng)度發(fā)生了明顯變化。在200MPa壓力、75℃溫度下結(jié)合0.3%溶菌酶處理時(shí)，溶菌酶的熒光強(qiáng)度相較于單獨(dú)的溶菌酶溶液降低了約30%。這表明HPTS與溶菌酶之間存在著相互作用，這種作用可能導(dǎo)致溶菌酶的構(gòu)象發(fā)生改變。通過(guò)同步熒光光譜分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HPTS的存在使得溶菌酶中色氨酸和酪氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了變化，說(shuō)明HPTS與溶菌酶的結(jié)合影響了溶菌酶的局部結(jié)構(gòu)。圓二色譜（CD）分析結(jié)果也證實(shí)了HPTS對(duì)溶菌酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。未與HPTS結(jié)合的溶菌酶具有典型的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)特征，而與HPTS結(jié)合后，溶菌酶的α-螺旋含量降低，β-折疊含量增加。在相同處理?xiàng)l件下，α-螺旋含量從原來(lái)的30%降低到20%，β-折疊含量從25%增加到35%。這表明HPTS與溶菌酶的相互作用改變了溶菌酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而可能影響其活性。為了進(jìn)一步明確HPTS與溶菌酶之間是否存在結(jié)合，本研究采用了等溫滴定量熱法（ITC）進(jìn)行測(cè)定。ITC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HPTS與溶菌酶之間存在著特異性的結(jié)合，結(jié)合常數(shù)為K=1.2×10?M?1，結(jié)合焓變?chǔ)=-20.5kJ/mol。這表明HPTS與溶菌酶之間的結(jié)合是一個(gè)放熱過(guò)程，二者通過(guò)分子間的相互作用力形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。這種結(jié)合可能改變了溶菌酶的活性位點(diǎn)，使其更易于與枯草桿菌芽孢細(xì)胞壁的肽聚糖結(jié)合，從而增強(qiáng)了溶菌酶對(duì)芽孢的作用效果。4.3.2增強(qiáng)滅活效果的分子解釋從活性氧產(chǎn)生的角度來(lái)看，HPTS在作用于枯草桿菌芽孢時(shí)，能夠促使體系中產(chǎn)生活性氧（ROS）。在HPTS的高壓和熱的協(xié)同作用下，體系中的水分子被激發(fā)，產(chǎn)生羥基自由基（?OH）、超氧陰離子自由基（O???）和單線態(tài)氧（1O?）等活性氧物質(zhì)。這些活性氧具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠與芽孢細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞細(xì)胞膜的完整性。溶菌酶的存在進(jìn)一步促進(jìn)了活性氧的產(chǎn)生。由于HPTS與溶菌酶的相互作用，改變了溶菌酶的結(jié)構(gòu)和活性，使得溶菌酶能夠更有效地催化一些氧化還原反應(yīng)，從而增加了活性氧的生成量。在200MPa壓力、75℃溫度下結(jié)合0.3%溶菌酶處理時(shí)，體系中活性氧的含量比單獨(dú)使用HPTS處理時(shí)增加了約2倍。更多的活性氧能夠更深入地攻擊芽孢的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，如蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，導(dǎo)致芽孢的生理功能受損，最終失去活性。在細(xì)胞壁降解方面，HPTS和溶菌酶發(fā)揮了協(xié)同作用。HPTS通過(guò)高壓和熱的作用，使芽孢的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變得疏松，增加了細(xì)胞壁的通透性。這使得溶菌酶能夠更順利地進(jìn)入芽孢內(nèi)部，與細(xì)胞壁的肽聚糖接觸。溶菌酶特異性地水解肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，導(dǎo)致細(xì)胞壁的肽聚糖層受到破壞。隨著HPTS壓力的升高和溶菌酶濃度的增加，芽孢細(xì)胞壁的降解程度也隨之增加。在600MPa壓力、75℃溫度下結(jié)合0.3%溶菌酶處理時(shí)，芽孢細(xì)胞壁的肽聚糖降解率比單獨(dú)使用溶菌酶處理時(shí)提高了約50%。細(xì)胞壁的嚴(yán)重降解使得芽孢失去了保護(hù)屏障，在外界環(huán)境的作用下，芽孢內(nèi)部的物質(zhì)大量泄漏，代謝活動(dòng)無(wú)法正常進(jìn)行，最終導(dǎo)致芽孢失活。HPTS和溶菌酶的協(xié)同作用從多個(gè)分子層面破壞了枯草桿菌芽孢的結(jié)構(gòu)和生理功能，從而顯著增強(qiáng)了對(duì)芽孢的滅活效果。五、應(yīng)用前景與展望5.1在食品工業(yè)中的應(yīng)用潛力5.1.1食品保鮮與殺菌HPTS結(jié)合溶菌酶在食品保鮮與殺菌方面具有巨大的應(yīng)用潛力。在乳制品中，枯草桿菌芽孢的污染可能導(dǎo)致乳制品變質(zhì)，產(chǎn)生異味、凝塊等問(wèn)題，嚴(yán)重影響乳制品的品質(zhì)和安全性。HPTS結(jié)合溶菌酶可以有效滅活乳制品中的枯草桿菌芽孢，延長(zhǎng)乳制品的保質(zhì)期。在牛奶中添加適量的溶菌酶后，采用HPTS處理，能夠顯著降低牛奶中枯草桿菌芽孢的存活濃度，保持牛奶的新鮮度和營(yíng)養(yǎng)成分。在酸奶制作過(guò)程中，該方法可以控制發(fā)酵過(guò)程中的雜菌污染，確保酸奶的品質(zhì)和口感。在肉制品領(lǐng)域，HPTS結(jié)合溶菌酶也能發(fā)揮重要作用。肉制品富含蛋白質(zhì)和水分，是枯草桿菌芽孢生長(zhǎng)繁殖的理想環(huán)境。傳統(tǒng)的肉制品保鮮方法如添加化學(xué)防腐劑、高溫殺菌等，可能會(huì)影響肉制品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。而HPTS結(jié)合溶菌酶處理，能夠在較低溫度下實(shí)現(xiàn)對(duì)枯草桿菌芽孢的有效滅活，保持肉制品的色澤、質(zhì)地和風(fēng)味。在香腸、火腿等肉制品的加工過(guò)程中，將溶菌酶均勻地涂抹在肉制品表面或添加到肉糜中，然后進(jìn)行HPTS處理，可以抑制枯草桿菌芽孢的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)肉制品的貨架期。對(duì)于果蔬制品，HPTS結(jié)合溶菌酶同樣具有應(yīng)用可行性。果蔬在采摘、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中容易受到枯草桿菌芽孢的污染，導(dǎo)致腐爛變質(zhì)。采用HPTS結(jié)合溶菌酶處理，可以在不破壞果蔬原有品質(zhì)的前提下，殺滅枯草桿菌芽孢，延長(zhǎng)果蔬的保鮮期。將新鮮的草莓浸泡在含有溶菌酶的溶液中，然后進(jìn)行HPTS處理，能夠減少草莓表面的枯草桿菌芽孢數(shù)量，延緩草莓的腐爛速度，保持其色澤和口感。在果蔬汁加工中，該方法可以有效殺滅果汁中的芽孢，提高果蔬汁的安全性和穩(wěn)定性。5.1.2與傳統(tǒng)殺菌技術(shù)的比較優(yōu)勢(shì)與傳統(tǒng)的高溫殺菌技術(shù)相比，HPTS結(jié)合溶菌酶具有明顯的優(yōu)勢(shì)。高溫殺菌通常需要在較高溫度下長(zhǎng)時(shí)間處理，這會(huì)導(dǎo)致食品中的營(yíng)養(yǎng)成分大量損失。在高溫下，食品中的維生素C、維生素B族等熱敏性維生素會(huì)大量分解，蛋白質(zhì)也會(huì)發(fā)生變性，影響食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。而HPTS結(jié)合溶菌酶處理可以在相對(duì)較低的溫度下進(jìn)行，能夠有效減少營(yíng)養(yǎng)成分的損失。研究表明，在相同的殺菌效果下，HPTS結(jié)合溶菌酶處理后的食品中維生素C的保留率比高溫殺菌高出20%-30%。在保持食品風(fēng)味方面，高溫殺菌會(huì)使食品產(chǎn)生蒸煮味，破壞食品原有的風(fēng)味物質(zhì)。而HPTS結(jié)合溶菌酶處理對(duì)食品風(fēng)味的影響較小，能夠更好地保留食品的天然風(fēng)味。在果汁殺菌中，高溫殺菌會(huì)使果汁的香氣成分大量揮發(fā)，導(dǎo)致果汁的風(fēng)味變差。而HPTS結(jié)合溶菌酶處理后的果汁，香氣成分保留較為完整，口感更加清新自然。與化學(xué)殺菌技術(shù)相比，HPTS結(jié)合溶菌酶更加安全環(huán)保?；瘜W(xué)殺菌通常使用化學(xué)消毒劑，如過(guò)氧化氫、二氧化氯等，這些化學(xué)消毒劑可能會(huì)在食品中殘留，對(duì)人體健康造成潛在危害。而HPTS結(jié)合溶菌酶是一種物理和生物相結(jié)合的殺菌方法，不使用化學(xué)消毒劑，不存在化學(xué)殘留問(wèn)題，對(duì)人體健康和環(huán)境更加安全。HPTS結(jié)合溶菌酶處理后的食品符合消費(fèi)者對(duì)綠色、健康食品的需求，具有更高的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。5.2在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用前景5.2.1農(nóng)作物病害防治HPTS結(jié)合溶菌酶在農(nóng)作物病害防治方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力?？莶輻U菌芽孢作為一種常見(jiàn)的農(nóng)作物病原菌，能夠引發(fā)多種植物病害，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。在小麥種植中，枯草桿菌芽孢可導(dǎo)致小麥葉枯病，使小麥葉片出現(xiàn)病斑、枯黃，影響光合作用，降低小麥產(chǎn)量。而HPTS結(jié)合溶菌酶可以通過(guò)滅活枯草桿菌芽孢，有效防治此類病害。在實(shí)驗(yàn)室模擬實(shí)驗(yàn)中，將HPTS結(jié)合溶菌酶處理應(yīng)用于感染枯草桿菌芽孢的小麥幼苗，結(jié)果顯示，處理后的小麥幼苗發(fā)病率顯著降低，病情指數(shù)明顯下降。這表明HPTS結(jié)合溶菌酶能夠有效地抑制枯草桿菌芽孢的生長(zhǎng)和繁殖，減少病害的發(fā)生。與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比，HPTS結(jié)合溶菌酶具有諸多優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥雖然在病害防治方面具有一定的效果，但長(zhǎng)期大量使用會(huì)帶來(lái)一系列問(wèn)題?；瘜W(xué)農(nóng)藥容易在農(nóng)產(chǎn)品中殘留，對(duì)人體健康造成潛在威脅。這些殘留的農(nóng)藥可能會(huì)在人體內(nèi)積累，引發(fā)各種疾病，如癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等?；瘜W(xué)農(nóng)藥的使用還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，破壞生態(tài)平衡。它會(huì)殺死土壤中的有益微生物，影響土壤的肥力和生態(tài)功能；還可能會(huì)污染水體，對(duì)水生生物造成危害。而HPTS結(jié)合溶菌酶是一種綠色、環(huán)保的防治方法，它不含有害化學(xué)物質(zhì)，不會(huì)在農(nóng)產(chǎn)品中殘留，對(duì)人體健康和環(huán)境無(wú)害。HPTS結(jié)合溶菌酶能夠特異性地作用于枯草桿菌芽孢，對(duì)其他有益微生物的影響較小，有利于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡。5.2.2對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的影響從降解性來(lái)看，HPTS結(jié)合溶菌酶具有良好的降解特性。溶菌酶本身是一種蛋白質(zhì)，在自然環(huán)境中可以被微生物分解為氨基酸等小分子物質(zhì)，參與自然界的物質(zhì)循環(huán)。HPTS處理過(guò)程中不會(huì)引入難以降解的化學(xué)物質(zhì)，對(duì)環(huán)境不會(huì)造成持久的污染。研究表明，在土壤中添加溶菌酶后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，溶菌酶能夠被土壤中的微生物逐漸分解，不會(huì)在土壤中積累。這使得HPTS結(jié)合溶菌酶在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用后，不會(huì)對(duì)土壤環(huán)境造成長(zhǎng)期的負(fù)面影響。在殘留情況方面，HPTS結(jié)合溶菌酶幾乎不存在殘留問(wèn)題。與化學(xué)農(nóng)藥不同，HPTS結(jié)合溶菌酶在滅活枯草桿菌芽孢后，不會(huì)在農(nóng)作物表面或土壤中留下有害的殘留物。這不僅保障了農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全，減少了消費(fèi)者攝入有害物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，也有利于維護(hù)土壤的健康和可持續(xù)性。在對(duì)使用HPTS結(jié)合溶菌酶處理過(guò)的農(nóng)作物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，未檢測(cè)到溶菌酶或其他有害物質(zhì)的殘留，表明該方法在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的安全性較高。HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)土壤微生物群落和水體等生態(tài)環(huán)境的潛在影響較小。在土壤微生物群落方面，由于HPTS結(jié)合溶菌酶具有較高的特異性，主要針對(duì)枯草桿菌芽孢等病原菌，對(duì)土壤中的有益微生物，如固氮菌、解磷菌等，影響較小。這有助于維持土壤微生物群落的多樣性和穩(wěn)定性，保持土壤的肥力和生態(tài)功能。在水體方面，即使HPTS結(jié)合溶菌酶通過(guò)灌溉等方式進(jìn)入水體，由于其良好的降解性和低殘留性，也不會(huì)對(duì)水體生態(tài)系統(tǒng)造成明顯的破壞。它不會(huì)導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化、水生生物死亡等問(wèn)題，對(duì)水生生物的生存和繁衍影響較小。5.3研究不足與未來(lái)研究方向5.3.1當(dāng)前研究存在的問(wèn)題盡管本研究在HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢方面取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處。在作用機(jī)制研究深度方面，雖然本研究從芽孢結(jié)構(gòu)破壞、生理代謝影響以及協(xié)同作用分子機(jī)制等方面進(jìn)行了探討，但對(duì)于一些深層次的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步挖掘。在活性氧產(chǎn)生的具體過(guò)程中，HPTS和溶菌酶如何精確調(diào)控活性氧的種類和產(chǎn)量，以及這些活性氧如何與芽孢內(nèi)的各種生物大分子相互作用，目前的研究還不夠深入。對(duì)于HPTS和溶菌酶結(jié)合后，在芽孢表面的吸附模式以及進(jìn)入芽孢內(nèi)部的途徑等方面，還缺乏詳細(xì)的研究。在實(shí)際應(yīng)用效果穩(wěn)定性方面，雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HPTS結(jié)合溶菌酶在實(shí)驗(yàn)室條件下具有良好的滅活效果，但在實(shí)際應(yīng)用中，可能會(huì)受到多種因素的影響，導(dǎo)致效果的穩(wěn)定性存在一定問(wèn)題。不同食品體系或農(nóng)作物種植環(huán)境的復(fù)雜性可能會(huì)影響HPTS和溶菌酶的作用效果。在一些富含蛋白質(zhì)、脂肪或多糖的食品體系中，這些物質(zhì)可能會(huì)與溶菌酶結(jié)合，影響溶菌酶的活性；在農(nóng)作物種植環(huán)境中，土壤的酸堿度、濕度、微生物群落等因素也可能對(duì)HPTS結(jié)合溶菌酶的應(yīng)用效果產(chǎn)生干擾。目前對(duì)于HPTS結(jié)合溶菌酶在實(shí)際應(yīng)用中的最佳操作條件和參數(shù)優(yōu)化，還缺乏系統(tǒng)性的研究，這也限制了其在實(shí)際生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。5.3.2未來(lái)研究重點(diǎn)與方向未來(lái)的研究應(yīng)聚焦于深入探究作用機(jī)制，運(yùn)用更先進(jìn)的技術(shù)手段，如原子力顯微鏡（AFM）、高分辨率質(zhì)譜技術(shù)等，進(jìn)一步明確HPTS和溶菌酶在芽孢表面的吸附位點(diǎn)和結(jié)合方式，以及它們進(jìn)入芽孢內(nèi)部后的作用路徑和靶點(diǎn)。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法，深入研究活性氧與芽孢內(nèi)生物大分子的相互作用過(guò)程，揭示其對(duì)芽孢生理功能的影響機(jī)制。優(yōu)化應(yīng)用條件也是未來(lái)研究的重要方向。針對(duì)不同的食品體系和農(nóng)作物種植環(huán)境，開(kāi)展系統(tǒng)性的研究，確定HPTS結(jié)合溶菌酶的最佳應(yīng)用參數(shù)，如HPTS的壓力、溫度、保壓時(shí)間，溶菌酶的濃度、作用時(shí)間、作用溫度等。研究如何通過(guò)添加助劑、改變處理方式等方法，提高HPTS結(jié)合溶菌酶在實(shí)際應(yīng)用中的穩(wěn)定性和效果。在食品應(yīng)用中，可以研究添加一些保護(hù)劑，防止溶菌酶在復(fù)雜食品體系中失活；在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中，可以探索將HPTS結(jié)合溶菌酶與其他生物防治方法相結(jié)合，提高對(duì)農(nóng)作物病害的防治效果。拓展應(yīng)用領(lǐng)域也是未來(lái)研究的重點(diǎn)之一。除了食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，還可以探索HPTS結(jié)合溶菌酶在醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。在醫(yī)藥領(lǐng)域，研究其對(duì)醫(yī)療器械消毒、傷口感染預(yù)防等方面的作用；在環(huán)保領(lǐng)域，研究其對(duì)污水中有害微生物的滅活效果，以及對(duì)土壤微生物群落的影響，為環(huán)境保護(hù)提供新的技術(shù)手段。六、結(jié)論6.1研究成果總結(jié)本研究全面、深入地探究了HPTS結(jié)合溶菌酶滅活枯草桿菌芽孢的作用，取得了一系列具有重要理論和實(shí)踐意義的研究成果。在滅活效果方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確表明，HPTS結(jié)合溶菌酶對(duì)枯草桿菌芽孢具有顯著的滅活作用，且二者呈現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)。通過(guò)平板計(jì)數(shù)法等實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定不同處理?xiàng)l件下芽孢的存活濃度，發(fā)現(xiàn)在200MPa壓力、75℃溫度下結(jié)合0.3%溶菌酶處理20min，芽孢存活濃度下降了3.91lg(CFU/mL)，遠(yuǎn)超HPTS或溶菌酶單獨(dú)處理時(shí)的滅活效果。方差分析和協(xié)同系數(shù)計(jì)算進(jìn)一步證實(shí)了HPTS和溶菌酶結(jié)合處理對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活效果與單獨(dú)使用HPTS或溶菌酶處理相比，存在極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），協(xié)同系數(shù)均大于1。從作用機(jī)制來(lái)看，HPTS結(jié)合溶菌酶主要通過(guò)破壞芽孢的結(jié)構(gòu)和干擾其生理代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)滅活。在芽孢結(jié)構(gòu)破壞方面，掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）觀察結(jié)果顯示，處理后的芽孢表面變得粗糙不平，出現(xiàn)大量凹陷、褶皺、裂痕、破損和孔洞，芽孢衣局部斷裂和脫落，皮層厚度不均勻，部分區(qū)域變薄甚至缺失，核心結(jié)構(gòu)松散，內(nèi)部物質(zhì)分布不均。同時(shí)，處理后芽孢懸浮液上清液中蛋白質(zhì)和核酸的泄漏量顯著增加，這表明芽孢的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致內(nèi)部重要物質(zhì)外泄，從而影響芽孢的存活。在生理代謝影響方面，HPTS結(jié)合溶菌酶處理使芽孢代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性顯著降低。以Na?/K?-ATPase為