Hsp90α在IBDV感染雞法氏囊細胞中的角色與IBDV結(jié)合區(qū)解析

Hsp90α在IBDV感染雞法氏囊細胞中的角色與IBDV結(jié)合區(qū)解析一、引言1.1研究背景與意義禽傳染性法氏囊?。↖nfectiousBursalDisease,IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（InfectiousBursalDiseaseVirus,IBDV）引起的一種急性、高度接觸性禽類傳染病，對全球禽類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。IBDV主要感染3-6周齡的雛雞，其致病機制主要包括急慢性炎性損傷、細胞凋亡和免疫抑制。在感染過程中，IBDV在法氏囊細胞中快速復(fù)制，引發(fā)雞體的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致B淋巴細胞和T淋巴細胞變性、壞死，細胞數(shù)量減少，抑制淋巴細胞增殖，從而引起免疫抑制。同時，活化后增殖的B淋巴細胞在感染IBDV后會裂解，巨噬細胞亦可持續(xù)被IBDV血清I型株感染，大量釋放腫瘤壞死因子或白介素6等細胞因子，進一步加重免疫抑制和組織損傷。此外，IBDV侵染所導(dǎo)致的免疫抑制與細胞凋亡有一定的相關(guān)性，不同強弱毒株所引起法氏囊原代細胞凋亡程度不同，vvIBDV較經(jīng)典弱毒株能引起較多的法氏囊原代細胞凋亡。IBDV屬于雙RNA病毒科（Birnaviridae），禽雙鏈RNA病毒屬（Avibirnavirus），是一種雙股、雙片段、無囊膜的RNA病毒。在血清型上分為血清Ⅰ型（雞型）和Ⅱ型（火雞型），其中只有血清I型對雞致病，Ⅱ型不致病。血清1型毒株根據(jù)VP2基因又可進一步分為經(jīng)典毒株（cIBDV）、弱毒株（aIBDV）、變異株（vIBDV）、新型變異株（nVarIBDV）及超強毒株（vvIBDV）。自IBDV被發(fā)現(xiàn)以來，其流行毒株不斷演變。最初的流行毒株為經(jīng)典株，當(dāng)時的疫苗能夠提供很好的保護。然而，1987年美國報道了vIBDV，隨后荷蘭又分離出vvIBDV，這些毒株與cIBDV在抗原性和毒力上存在較大差異，導(dǎo)致疫苗免疫抑制與保護失敗的情況頻繁發(fā)生。2016年以來，我國華東地區(qū)首次在白羽肉雞上發(fā)現(xiàn)nVarIBDV，并迅速蔓延至全國。近兩年，我國雞傳染性法氏囊病疫苗免疫雞群頻繁發(fā)生IBDV感染，遺傳進化分析表明，分離的部分毒株與vvIBDV屬于同一進化大分支，但卻獨立進化出新分支，部分關(guān)鍵氨基酸位點趨同于nVarIBDV，被稱之為超強株變異株（nvvIBDV）。nvvIBDV的出現(xiàn)，使得當(dāng)前疫苗無法對該毒株提供有效保護，已成為當(dāng)前優(yōu)勢流行毒株，并與nVarIBDV共同成為我國IBDV流行的主要毒株。IBDV主要經(jīng)呼吸道與消化道傳播，具有病程短、發(fā)病快、死亡率高、傳播迅速等特點，控制難度極大，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失，已被世界動物衛(wèi)生組織列為重要家禽疫病之一。在我國，肉雞養(yǎng)殖體量大，IBD流行普遍，nvvIBDV的出現(xiàn)更是使得疫苗無法提供有效保護，這一系列問題促使我們必須加強對IBD的研究，以尋找更有效的防控措施。熱應(yīng)激蛋白90（HeatShockProtein90,Hsp90）是一種廣泛存在于細胞質(zhì)中的分子伴侶，在細胞內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，參與多種細胞生理過程，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期調(diào)控和凋亡路徑等。Hsp90家族主要包括Hsp90α和Hsp90β兩種亞型，其中Hsp90α在多種細胞應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，Hsp90α參與了多種病毒的感染過程，與病毒的復(fù)制、裝配和釋放等環(huán)節(jié)密切相關(guān)。在病毒感染宿主細胞的過程中，病毒需要與宿主細胞表面的受體或其他分子相互作用，才能進入細胞并進行復(fù)制。Hsp90α可能作為一種分子伴侶，協(xié)助病毒蛋白的折疊和組裝，或者與病毒蛋白相互作用，影響病毒的感染效率。對于IBDV感染雞法氏囊細胞的過程，Hsp90α是否參與其中以及其具體作用機制尚不清楚。探究Hsp90α在IBDV感染雞法氏囊細胞中的作用，以及確定Hsp90α與IBDV的結(jié)合區(qū)，對于深入了解IBDV的感染機制具有重要意義。一方面，這有助于揭示IBDV感染宿主細胞的分子機制，為進一步研究IBDV的致病機理提供理論基礎(chǔ)；另一方面，通過明確Hsp90α與IBDV的相互作用關(guān)系，有望為開發(fā)新型的抗IBDV藥物或疫苗提供新的靶點和思路，從而為IBD的防控提供更有效的手段。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究Hsp90α參與IBDV感染雞法氏囊細胞的具體機制，并初步確定Hsp90α與IBDV的結(jié)合區(qū)，為揭示IBDV的感染機理以及開發(fā)新型抗IBDV藥物或疫苗提供理論依據(jù)和潛在靶點。圍繞這一總體目標(biāo)，本研究主要開展以下兩方面的工作：1.2.1Hsp90α參與IBDV感染法氏囊細胞的初步研究首先，利用RT-PCR技術(shù)檢測IBDV感染雞法氏囊細胞后Hsp90α基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，明確IBDV感染是否會對Hsp90α基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響。接著，運用間接免疫熒光試驗（IFA）觀察IBDV感染雞法氏囊細胞后Hsp90α蛋白的表達和分布情況，從蛋白層面了解Hsp90α在IBDV感染過程中的動態(tài)變化。最后，通過IBDV感染阻斷試驗，分別使用重組Hsp90α蛋白和抗Hsp90α抗體處理雞法氏囊細胞，然后接種IBDV，檢測病毒的感染情況，以此來確定Hsp90α是否參與IBDV感染雞法氏囊細胞的過程以及其對感染過程的影響。1.2.2Hsp90α蛋白IBDV結(jié)合區(qū)的初步確定從雞法氏囊細胞中提取總RNA，通過RT-PCR擴增Hsp90α全長及不同截短片段的cDNA。將擴增得到的cDNA片段克隆至原核表達載體pET-32a(+)上，構(gòu)建重組表達載體。把重組表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達重組蛋白。利用鎳離子親和層析柱對重組蛋白進行純化，并通過SDS和Westernblot對純化后的重組蛋白進行鑒定。最后，采用Far-Westernblot和ELISA等方法，以純化的重組蛋白和IBDV為材料，鑒定Hsp90α蛋白與IBDV的結(jié)合區(qū)，明確二者相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。1.3研究方法與創(chuàng)新點在研究方法上，本研究綜合運用了多種技術(shù)手段。RT-PCR技術(shù)能夠快速、靈敏地檢測Hsp90α基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，為研究IBDV感染對Hsp90α基因表達的影響提供了精確的數(shù)據(jù)支持。間接免疫熒光試驗（IFA）則從蛋白層面直觀地展示了Hsp90α蛋白在IBDV感染雞法氏囊細胞后的表達和分布情況，有助于深入了解其在感染過程中的動態(tài)變化。IBDV感染阻斷試驗通過使用重組Hsp90α蛋白和抗Hsp90α抗體處理細胞，然后接種IBDV，檢測病毒的感染情況，直接驗證了Hsp90α與IBDV感染過程的相關(guān)性。在確定Hsp90α蛋白IBDV結(jié)合區(qū)時，本研究采用了基因克隆技術(shù)擴增Hsp90α全長及不同截短片段的cDNA，并將其克隆至原核表達載體pET-32a(+)上，構(gòu)建重組表達載體。利用大腸桿菌BL21(DE3)表達重組蛋白，并通過鎳離子親和層析柱進行純化，最后通過SDS和Westernblot對純化后的重組蛋白進行鑒定，確保了重組蛋白的純度和質(zhì)量。采用Far-Westernblot和ELISA等方法鑒定Hsp90α蛋白與IBDV的結(jié)合區(qū)，這些方法具有較高的特異性和靈敏度，能夠準(zhǔn)確地確定二者相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在研究內(nèi)容和方法的結(jié)合上。目前對于IBDV感染機制的研究多集中在病毒本身的結(jié)構(gòu)和功能，以及宿主細胞的免疫反應(yīng)等方面，而對于宿主細胞內(nèi)分子伴侶如Hsp90α在IBDV感染過程中的作用研究較少。本研究首次探討Hsp90α參與IBDV感染雞法氏囊細胞的機制以及確定其與IBDV的結(jié)合區(qū)，為IBDV感染機制的研究開辟了新的方向。在方法上，本研究將多種分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)有機結(jié)合，從基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達和相互作用等多個層面深入研究Hsp90α與IBDV的關(guān)系，這種多技術(shù)聯(lián)用的研究方法能夠更全面、深入地揭示二者之間的相互作用機制，為后續(xù)相關(guān)研究提供了新的思路和方法。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)與研究進展2.1傳染性法氏囊病病毒（IBDV）研究進展2.1.1IBDV的結(jié)構(gòu)與基因組特征IBDV呈球形，無囊膜結(jié)構(gòu)，其直徑約為60-70nm，整體呈20面體對稱。病毒粒子由核心、內(nèi)衣殼和外衣殼三層結(jié)構(gòu)有序組成。核心部分包含著病毒的基因組，是以雙股RNA的形式存在，這是IBDV遺傳信息的攜帶者，對病毒的復(fù)制、變異以及致病性等起著關(guān)鍵的決定作用。內(nèi)衣殼由VP3蛋白構(gòu)成，VP3蛋白具有獨特的RNA聚合酶活性，在病毒的生物合成過程中，能夠以病毒基因組RNA為模板，催化合成新的RNA分子，為病毒的大量增殖提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。外衣殼則由VP2蛋白組成，VP2蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，它直接暴露在病毒粒子的表面，與病毒的抗原性密切相關(guān)。VP2蛋白上存在著多個抗原表位，這些抗原表位能夠被宿主免疫系統(tǒng)識別，從而激發(fā)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)。同時，VP2蛋白的氨基酸序列存在一定的變異性，這種變異性會導(dǎo)致病毒抗原性的改變，使得不同毒株之間在抗原性上存在差異，這也是IBDV免疫防控面臨挑戰(zhàn)的重要原因之一。IBDV的基因組包含A、B兩個線狀雙股RNA分子，大小約為6.0kbp。其中，A片段較大，其上有兩個開放閱讀框（ORF）。較大的一個ORF編碼一個聚合蛋白及VP4，這個聚合蛋白在病毒感染宿主細胞的過程中，會被進一步加工，裂解形成VP2和VP3兩個結(jié)構(gòu)蛋白，它們在病毒粒子的組裝和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中發(fā)揮著不可或缺的作用。VP4是病毒的蛋白酶，它能夠?qū)Σ《镜囊恍┑鞍浊绑w進行切割加工，促使病毒蛋白的成熟和功能的正常發(fā)揮。較小的ORF則編碼VP5蛋白，VP5蛋白在病毒感染宿主細胞后的早期階段發(fā)揮作用，可能參與病毒的入侵、細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運以及免疫逃逸等過程，但目前對于VP5蛋白的具體功能和作用機制還尚未完全明確，仍有待進一步深入研究。B片段編碼VP1蛋白，VP1蛋白是病毒的RNA依賴RNA聚合酶，在病毒基因組的復(fù)制過程中，它能夠以病毒的RNA為模板，按照堿基互補配對原則，合成子代病毒的RNA，保證病毒遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞和復(fù)制。2.1.2IBDV的分類、抗原性及致病性在分類學(xué)上，IBDV屬于雙RNA病毒科（Birnaviridae）禽雙鏈RNA病毒屬（Avibirnavirus）。目前已知IBDV存在兩個血清型，即血清Ⅰ型和血清Ⅱ型。血清Ⅰ型主要從雞中分離得到，對雞具有致病性，感染后會導(dǎo)致雞出現(xiàn)一系列的臨床癥狀和病理變化，嚴重影響雞的生長發(fā)育和健康，是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要病原。該型病毒能夠感染雞的法氏囊，破壞法氏囊中的淋巴細胞，導(dǎo)致雞的免疫功能受損，出現(xiàn)免疫抑制現(xiàn)象，使得雞對其他病原體的易感性增加，容易繼發(fā)感染其他疾病。血清Ⅱ型來源于火雞，對雞和火雞均無致病性，通常只會引起亞臨床感染，即在感染后不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但病毒可以在宿主體內(nèi)存在并進行一定程度的復(fù)制。兩型病毒之間的抗原相關(guān)性小于10%，這意味著它們的抗原結(jié)構(gòu)存在較大差異，相互之間的交叉保護作用很低。因此，針對血清Ⅰ型病毒研制的疫苗，對血清Ⅱ型病毒感染不能提供有效的保護，反之亦然。在實際的疫病防控中，需要準(zhǔn)確區(qū)分病毒的血清型，以便采取針對性的防控措施。血清Ⅰ型毒株根據(jù)VP2基因的差異，又可進一步細分為經(jīng)典毒株（cIBDV）、弱毒株（aIBDV）、變異株（vIBDV）、新型變異株（nVarIBDV）及超強毒株（vvIBDV）。不同類型的毒株在毒力、抗原性和致病性等方面表現(xiàn)出顯著的差異。經(jīng)典毒株毒力相對較弱，感染雞后主要引起法氏囊的輕微病變，雞的臨床癥狀相對較輕，死亡率較低。然而，隨著時間的推移和病毒的進化，出現(xiàn)了毒力更強的變異株和超強毒株。變異株的毒力較強，感染后可導(dǎo)致法氏囊嚴重萎縮和壞死，雞群的發(fā)病率和死亡率明顯升高。超強毒株的毒力極強，能夠在短時間內(nèi)導(dǎo)致雞群的高死亡率，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。新型變異株則是近年來新出現(xiàn)的類型，其在抗原性和致病性上又有新的特點，目前對其研究還在不斷深入中。這些不同毒株之間的免疫交叉反應(yīng)不完全，這給疫苗的研發(fā)和免疫防控工作帶來了極大的挑戰(zhàn)。如果疫苗株與流行毒株的抗原性差異較大，疫苗免疫后就無法有效地激發(fā)機體產(chǎn)生針對流行毒株的免疫保護，從而導(dǎo)致免疫失敗。因此，及時監(jiān)測IBDV的流行毒株類型及其抗原性變化，對于研發(fā)有效的疫苗和制定合理的免疫程序至關(guān)重要。IBDV主要感染雞的法氏囊，法氏囊是雞的中樞免疫器官，對于雞的體液免疫功能的正常發(fā)揮起著關(guān)鍵作用。IBDV感染法氏囊后，會在囊內(nèi)的淋巴細胞中大量復(fù)制，導(dǎo)致淋巴細胞變性、壞死，細胞數(shù)量急劇減少。這使得雞體無法正常產(chǎn)生免疫球蛋白，從而降低或喪失免疫機能，出現(xiàn)免疫抑制現(xiàn)象。免疫抑制的雞群對其他疫苗，如新城疫（ND）、禽流感（AI）、傳染性支氣管炎（IB）等疫苗的免疫應(yīng)答能力下降，即使接種了這些疫苗，也難以產(chǎn)生有效的免疫保護，容易感染相應(yīng)的疫病。同時，免疫抑制還會使雞群對其他病原體的易感性顯著增加，如大腸桿菌、葡萄球菌等細菌以及其他病毒，導(dǎo)致雞群更容易發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染，使病情更加復(fù)雜和嚴重，給疾病的診斷和治療帶來更大的困難。2.1.3IBDV的培養(yǎng)特性與抵抗力IBDV在體外培養(yǎng)時，具有一定的特性。它可在9-11日齡無母源抗體的雞胚上進行增殖，通過尿囊腔接種或絨毛尿囊膜接種的方式，IBDV能夠在雞胚內(nèi)生長繁殖，并在接種后的3-7天導(dǎo)致雞胚死亡。死亡的雞胚通常會出現(xiàn)特征性的病變，如胚體腹部水腫、出血，肝臟斑駁壞死并伴有出血斑，腎臟充血且有斑駁壞死等。此外，IBDV還能在雞胚成纖維細胞、雞胚腎細胞、鴨胚細胞以及猴腎細胞等多種細胞中生長。在雞胚成纖維細胞內(nèi)，IBDV能夠增殖并形成蝕斑，蝕斑是病毒在細胞單層上形成的局限性病灶，通過觀察蝕斑的大小、形態(tài)和數(shù)量等特征，可以對病毒的滴度和感染性進行測定。在實際的病毒研究和疫苗生產(chǎn)中，常常利用雞胚或細胞培養(yǎng)的方法來擴增IBDV，為后續(xù)的病毒檢測、疫苗研發(fā)等工作提供足夠的病毒材料。IBDV在外界環(huán)境中具有較強的抵抗力。在中性和弱堿性條件下，IBDV表現(xiàn)得較為穩(wěn)定。在pH值為3-9的范圍內(nèi)，病毒能夠保持其感染性。它對乙醚、氯仿等脂溶劑不敏感，這是因為IBDV無囊膜結(jié)構(gòu)，脂溶劑無法破壞其病毒粒子的結(jié)構(gòu)，從而不能使其失去感染活性。IBDV對紫外線和超聲波也有極強的抵抗力，普通的紫外線照射和超聲波處理難以將其滅活。在溫度耐受性方面，IBDV在56℃條件下3小時不受影響，56℃5小時或60℃90分鐘仍然可存活，只有在70℃30分鐘的條件下才可被滅活。在自然環(huán)境中，IBDV可存在于污染的飼料、飲水、墊料和糞便中，通過直接接觸或間接接觸的方式傳播給易感雞群。在徹底清洗、消毒的雞舍中，IBDV仍然可能存在，在雞舍內(nèi)可存活2-4個月之久。然而，IBDV對甲醛、碘制劑、過氧化氫、氯胺等消毒藥敏感。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，可以利用這些消毒劑對雞舍、養(yǎng)殖設(shè)備等進行定期消毒，以減少環(huán)境中病毒的含量，降低雞群感染IBDV的風(fēng)險。在堿性（pH12.0）條件下，IBDV可被滅活，但在酸性（pH2.0）條件下卻可存活。了解IBDV的這些抵抗力特性，對于制定有效的疫病防控措施和消毒方案具有重要的指導(dǎo)意義。2.2熱應(yīng)激蛋白90（Hsp90）研究進展2.2.1Hsp90的結(jié)構(gòu)與功能熱應(yīng)激蛋白90（Hsp90）是一類高度保守的分子伴侶，在真核生物和原核生物中廣泛存在。Hsp90家族成員在氨基酸序列上具有較高的同源性，其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出高度的保守性。Hsp90蛋白由三個主要的結(jié)構(gòu)域組成，分別是N端結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域約由250個氨基酸殘基組成，該結(jié)構(gòu)域含有ATP/ADP結(jié)合位點，ATP的結(jié)合與水解對于Hsp90的功能發(fā)揮起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)ATP結(jié)合到N端結(jié)構(gòu)域時，Hsp90的構(gòu)象會發(fā)生改變，從而影響其與底物蛋白以及其他輔助因子的相互作用。中間結(jié)構(gòu)域是Hsp90與底物蛋白相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，它包含了多個保守的氨基酸序列，能夠特異性地識別并結(jié)合底物蛋白。不同的底物蛋白與中間結(jié)構(gòu)域的結(jié)合方式和親和力有所不同，這決定了Hsp90對不同底物蛋白的作用特異性。C端結(jié)構(gòu)域則參與了Hsp90的二聚化過程，使得Hsp90能夠以二聚體的形式發(fā)揮其分子伴侶的功能。二聚化的Hsp90在結(jié)構(gòu)上更加穩(wěn)定，能夠更有效地結(jié)合和折疊底物蛋白。除了這三個主要結(jié)構(gòu)域外，Hsp90還包含一些連接區(qū)域，這些連接區(qū)域在維持Hsp90的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及調(diào)節(jié)其功能方面也發(fā)揮著重要作用。在細胞內(nèi)，Hsp90參與了多種重要的生理過程，對維持細胞的正常功能起著不可或缺的作用。蛋白質(zhì)折疊是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成后的關(guān)鍵步驟，正確折疊的蛋白質(zhì)才能發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能。Hsp90能夠與新合成的多肽鏈或未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，通過其獨特的分子伴侶機制，協(xié)助這些蛋白質(zhì)正確折疊成具有天然構(gòu)象的功能蛋白。在這個過程中，Hsp90利用ATP水解提供的能量，不斷調(diào)整自身的構(gòu)象，從而促進底物蛋白的折疊。如果細胞內(nèi)缺乏Hsp90的協(xié)助，許多蛋白質(zhì)可能會發(fā)生錯誤折疊，形成聚集體，這些聚集體不僅無法發(fā)揮正常功能，還可能對細胞造成損傷，引發(fā)一系列的疾病。細胞信號傳導(dǎo)是細胞對外界刺激做出響應(yīng)的重要機制，涉及到多種信號分子的參與和相互作用。Hsp90與許多細胞信號傳導(dǎo)蛋白相互作用，對這些蛋白的穩(wěn)定性、活性以及定位進行精確調(diào)節(jié)，進而影響細胞的增殖、分化和凋亡等關(guān)鍵過程。在細胞周期調(diào)控中，Hsp90與周期蛋白依賴性激酶（CDK）等關(guān)鍵蛋白相互作用，確保細胞周期的正常進行。如果Hsp90的功能受到抑制，可能會導(dǎo)致細胞周期紊亂，引發(fā)細胞異常增殖或凋亡。在細胞凋亡過程中，Hsp90也參與其中，它可以與凋亡相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細胞凋亡的信號通路，決定細胞是否走向凋亡。在腫瘤細胞中，Hsp90常常高表達，它與許多癌基因通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用，如Raf-1、HER2/ErbB-2等，穩(wěn)定這些蛋白的構(gòu)象，促進腫瘤細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。因此，Hsp90成為了腫瘤治療的一個重要靶點，通過抑制Hsp90的功能，可以阻斷腫瘤細胞的信號傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細胞的生長。此外，Hsp90還參與了蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運和降解過程。在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運方面，Hsp90可以與一些轉(zhuǎn)運蛋白相互作用，協(xié)助蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的運輸，確保蛋白質(zhì)能夠準(zhǔn)確地到達其發(fā)揮功能的部位。在蛋白質(zhì)降解過程中，Hsp90參與了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）對錯誤折疊或受損蛋白質(zhì)的降解。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生錯誤折疊或受到損傷時，Hsp90會協(xié)助識別這些蛋白質(zhì)，并將它們標(biāo)記上泛素，使其能夠被蛋白酶體識別并降解，從而維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的質(zhì)量平衡。2.2.2Hsp90α的特性與生物學(xué)作用Hsp90α是Hsp90家族中的一個重要亞型，與Hsp90家族的其他成員相比，Hsp90α具有一些獨特的特性。在基因表達調(diào)控方面，Hsp90α的表達受到多種因素的精細調(diào)控。熱應(yīng)激是誘導(dǎo)Hsp90α表達的重要因素之一，當(dāng)細胞受到高溫刺激時，熱休克轉(zhuǎn)錄因子（HSF）會被激活，HSF與Hsp90α基因啟動子區(qū)域的熱休克元件（HSE）結(jié)合，從而啟動Hsp90α基因的轉(zhuǎn)錄，使Hsp90α的表達量迅速增加。除了熱應(yīng)激外，其他應(yīng)激因素，如氧化應(yīng)激、缺氧、紫外線照射等，也能誘導(dǎo)Hsp90α的表達。在氧化應(yīng)激條件下，細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），這些ROS會激活細胞內(nèi)的信號通路，最終導(dǎo)致Hsp90α表達上調(diào)。此外，一些細胞因子和生長因子也可以調(diào)節(jié)Hsp90α的表達。在炎癥反應(yīng)過程中，炎癥細胞分泌的細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等，能夠刺激細胞表達Hsp90α，以應(yīng)對炎癥環(huán)境對細胞造成的損傷。在細胞內(nèi)的定位和分布上，Hsp90α主要存在于細胞質(zhì)中，但在某些情況下，它也會出現(xiàn)在細胞核、線粒體等細胞器中。在正常生理狀態(tài)下，Hsp90α在細胞質(zhì)中與多種底物蛋白相互作用，發(fā)揮其分子伴侶的功能。當(dāng)細胞受到應(yīng)激刺激時，部分Hsp90α?xí)晦D(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)，參與細胞核內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊和修復(fù)。在細胞核中，Hsp90α可以與轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)相關(guān)蛋白等相互作用，維持這些蛋白的正常功能，確?；虻恼＾D(zhuǎn)錄。此外，Hsp90α還可以定位于線粒體，參與線粒體蛋白質(zhì)的折疊和組裝，維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能。線粒體是細胞的能量工廠，其功能的正常發(fā)揮對于細胞的生存至關(guān)重要。Hsp90α在線粒體中的作用，有助于保證線粒體呼吸鏈復(fù)合物的正確組裝，維持線粒體的能量代謝。Hsp90α在細胞應(yīng)激反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色。當(dāng)細胞遭受各種應(yīng)激時，如高溫、氧化應(yīng)激、紫外線照射等，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)會發(fā)生變性和錯誤折疊，這些異常蛋白質(zhì)的積累會對細胞造成嚴重的損傷。Hsp90α能夠迅速響應(yīng)應(yīng)激信號，大量表達并與這些變性或錯誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，通過其分子伴侶活性，幫助這些蛋白質(zhì)重新折疊成正確的構(gòu)象，從而保護細胞免受應(yīng)激損傷。在高溫應(yīng)激條件下，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分子由于熱運動加劇，容易發(fā)生變性。Hsp90α?xí)c變性的蛋白質(zhì)結(jié)合，利用ATP水解提供的能量，逐步解開蛋白質(zhì)的錯誤折疊結(jié)構(gòu)，并引導(dǎo)其重新折疊成正確的三維結(jié)構(gòu)。這一過程不僅能夠恢復(fù)蛋白質(zhì)的功能，還能防止蛋白質(zhì)聚集形成不可溶性的聚集體，避免對細胞造成進一步的傷害。在免疫調(diào)節(jié)方面，Hsp90α也發(fā)揮著重要的作用。它參與了抗原呈遞過程，能夠與抗原肽結(jié)合，將其轉(zhuǎn)運至抗原呈遞細胞（APC）的表面，供T淋巴細胞識別，從而激活機體的免疫反應(yīng)。在樹突狀細胞中，Hsp90α可以與內(nèi)吞的抗原肽結(jié)合，形成Hsp90α-抗原肽復(fù)合物。該復(fù)合物通過與樹突狀細胞表面的特定受體結(jié)合，被轉(zhuǎn)運至細胞表面，然后與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，將抗原肽呈遞給T淋巴細胞，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答。此外，Hsp90α還可以調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，影響免疫細胞的增殖、分化和活化。在T淋巴細胞的活化過程中，Hsp90α與T細胞受體（TCR）信號通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用，調(diào)節(jié)T細胞的活化和增殖，從而影響機體的免疫功能。2.2.3Hsp90與病毒感染的關(guān)系在病毒感染宿主細胞的過程中，熱應(yīng)激蛋白90（Hsp90）發(fā)揮著多方面的重要作用，與病毒的吸附、侵入、復(fù)制、裝配以及釋放等各個環(huán)節(jié)都存在密切的關(guān)聯(lián)。許多病毒在感染宿主細胞時，需要借助細胞表面的受體來實現(xiàn)吸附和侵入。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90可以與一些病毒的受體或病毒蛋白相互作用，促進病毒與細胞表面受體的結(jié)合，從而增強病毒的感染效率。在丙型肝炎病毒（HCV）感染過程中，Hsp90與HCV的E2糖蛋白以及宿主細胞表面的受體CD81相互作用，形成一個復(fù)合物。這個復(fù)合物的形成有助于HCV更緊密地結(jié)合到宿主細胞表面，促進病毒的吸附和侵入。通過抑制Hsp90的功能，可以減少HCV與CD81的結(jié)合，從而降低病毒的感染能力。在登革病毒感染過程中，Hsp90也參與了病毒與宿主細胞表面受體的結(jié)合過程，影響病毒的感染效率。進入宿主細胞后，病毒需要利用宿主細胞的各種機制進行復(fù)制和裝配。Hsp90作為細胞內(nèi)重要的分子伴侶，能夠協(xié)助病毒蛋白的正確折疊和組裝，為病毒的復(fù)制和裝配提供必要的條件。在人免疫缺陷病毒（HIV）感染細胞后，HIV的Gag蛋白需要在Hsp90的協(xié)助下進行正確折疊，才能進一步組裝成成熟的病毒粒子。如果抑制Hsp90的活性，Gag蛋白的折疊和組裝就會受到影響，導(dǎo)致HIV的復(fù)制和裝配過程受阻。在流感病毒感染細胞時，Hsp90與流感病毒的核蛋白（NP）相互作用，協(xié)助NP的正確折疊和轉(zhuǎn)運，保證病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能夠順利進行。Hsp90還參與了病毒感染引起的宿主細胞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。病毒感染會觸發(fā)宿主細胞的免疫應(yīng)答，以抵御病毒的入侵。Hsp90在這個過程中，一方面可以通過調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，影響免疫細胞對病毒的識別和清除能力。在T淋巴細胞對病毒感染細胞的識別和殺傷過程中，Hsp90與T細胞表面的一些信號分子相互作用，調(diào)節(jié)T細胞的活化和增殖，從而影響細胞免疫應(yīng)答的強度。另一方面，Hsp90可以與病毒感染誘導(dǎo)產(chǎn)生的一些細胞因子相互作用，調(diào)節(jié)細胞因子的信號傳導(dǎo)通路，影響免疫反應(yīng)的進程。在病毒感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)中，Hsp90可以與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子相互作用，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的強度和持續(xù)時間。此外，Hsp90還可能參與了病毒的免疫逃逸機制。一些病毒為了逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，會利用宿主細胞內(nèi)的分子機制來干擾免疫反應(yīng)。Hsp90可能在這個過程中被病毒利用，幫助病毒逃避宿主的免疫監(jiān)視。在乙型肝炎病毒（HBV）感染過程中，HBV的X蛋白（HBx）可以與Hsp90相互作用，通過調(diào)節(jié)宿主細胞內(nèi)的信號通路，抑制宿主的免疫反應(yīng)，從而有利于病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)存在和復(fù)制。Hsp90在病毒感染過程中具有重要作用，其與病毒的相互作用機制復(fù)雜多樣。深入研究Hsp90與病毒的關(guān)系，不僅有助于揭示病毒感染的分子機制，還為開發(fā)新型的抗病毒藥物提供了潛在的靶點。通過抑制Hsp90的功能，可以干擾病毒的感染、復(fù)制和免疫逃逸等過程，為病毒感染性疾病的治療提供新的策略。2.3病毒受體研究進展2.3.1病毒受體的概念與分類病毒受體是指能特異性地與病毒結(jié)合、介導(dǎo)病毒侵入并促進病毒感染的宿主細胞膜組分。其化學(xué)本質(zhì)主要是糖蛋白、蛋白聚糖、脂類或糖脂，大多數(shù)情況下屬于蛋白質(zhì)。從結(jié)構(gòu)和功能特點上，病毒受體可分為多種類型。鳥苷酸酶受體（GPCRs）是一大類膜蛋白受體的統(tǒng)稱，其結(jié)構(gòu)特點是由7個跨膜α螺旋組成，通過與G蛋白偶聯(lián)來傳遞信號。在某些病毒感染過程中，GPCRs可能作為病毒的受體，介導(dǎo)病毒的吸附和侵入。例如，一些病毒能夠利用GPCRs的信號傳導(dǎo)通路，激活細胞內(nèi)的相關(guān)機制，促進病毒的感染。酪氨酸激酶受體（TKRSs）則具有酪氨酸激酶活性，當(dāng)配體與受體結(jié)合后，受體的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域被激活，發(fā)生自身磷酸化，進而激活下游的信號通路。某些病毒可以與TKRSs結(jié)合，利用其激活的信號通路來實現(xiàn)自身的感染和復(fù)制。胞外酶受體（EXRs）是一類具有酶活性的受體，它們能夠催化細胞外的化學(xué)反應(yīng)。在病毒感染中，EXRs可能通過其酶活性改變細胞表面的微環(huán)境，或者與病毒粒子表面的特定結(jié)構(gòu)相互作用，從而介導(dǎo)病毒的感染。根據(jù)病毒受體的分布范圍和宿主特異性，又可將其分為廣泛分布型受體和宿主特異性受體。廣泛分布型受體在多種不同種屬的動物細胞上都存在，與之相對應(yīng)的病毒往往具有較廣的宿主范圍。例如，某些病毒的受體在哺乳動物、鳥類等多種動物細胞表面都能找到，使得這些病毒可以感染不同種類的動物。宿主特異性受體則僅存在于特定宿主的細胞表面，決定了病毒對宿主的特異性感染。比如，禽流感病毒的某些受體只存在于禽類細胞表面，這就限制了禽流感病毒主要感染禽類，而較少感染其他動物。此外，病毒受體還可以是單體形式存在，也可以是由多個分子組成的復(fù)合物。單體受體相對結(jié)構(gòu)簡單，由單個蛋白質(zhì)分子構(gòu)成，能夠直接與病毒粒子表面的配體結(jié)合。多分子復(fù)合物受體則是由多個不同的蛋白質(zhì)分子相互作用形成的，其結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，各分子之間協(xié)同作用，共同完成對病毒的識別和結(jié)合。2.3.2病毒與受體相互作用機制病毒與受體的相互作用是一個復(fù)雜而精細的過程，這一過程直接決定了病毒能否成功感染宿主細胞。首先，病毒通過其表面的特定結(jié)構(gòu)，如病毒的包膜糖蛋白、衣殼蛋白等，與宿主細胞表面的受體進行特異性識別。這種識別具有高度的特異性，就像一把鑰匙對應(yīng)一把鎖，只有病毒表面的結(jié)構(gòu)與受體的結(jié)構(gòu)互補匹配時，二者才能發(fā)生有效結(jié)合。在流感病毒感染過程中，流感病毒表面的血凝素（HA）蛋白能夠特異性地識別并結(jié)合宿主細胞表面的唾液酸受體。HA蛋白上的特定氨基酸序列與唾液酸受體的糖基部分相互作用，形成穩(wěn)定的結(jié)合。這種特異性的識別和結(jié)合是病毒感染的第一步，它決定了病毒能夠靶向特定的宿主細胞。一旦病毒與受體結(jié)合，就會觸發(fā)一系列的分子事件，介導(dǎo)病毒進入宿主細胞。對于有包膜的病毒，如艾滋病病毒（HIV），其包膜糖蛋白與宿主細胞表面的受體結(jié)合后，會引發(fā)包膜與細胞膜的融合，從而使病毒的核心進入細胞內(nèi)。在這個過程中，病毒包膜糖蛋白的構(gòu)象會發(fā)生變化，暴露出融合肽，融合肽插入宿主細胞膜，促進包膜與細胞膜的融合。對于無包膜的病毒，如脊髓灰質(zhì)炎病毒，病毒與受體結(jié)合后，通常會通過內(nèi)吞作用進入細胞。病毒與受體結(jié)合后，會誘導(dǎo)細胞膜內(nèi)陷，形成內(nèi)吞小泡，病毒被包裹在內(nèi)吞小泡中進入細胞。隨后，內(nèi)吞小泡的膜與溶酶體膜融合，在溶酶體的酸性環(huán)境下，病毒粒子發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，釋放出病毒核酸，開始病毒的復(fù)制過程。病毒與受體的相互作用還會影響病毒的感染效率和致病性。如果病毒與受體的親和力較高，病毒就能夠更迅速、更有效地結(jié)合到宿主細胞表面，從而提高感染效率。一些高致病性的病毒，其與受體的親和力往往較強，這使得它們能夠在短時間內(nèi)感染大量的宿主細胞，引發(fā)嚴重的疾病。此外，病毒與受體的相互作用還可能激活宿主細胞內(nèi)的信號通路，影響細胞的生理功能。某些病毒與受體結(jié)合后，會激活細胞內(nèi)的免疫相關(guān)信號通路，引發(fā)宿主的免疫反應(yīng)。然而，一些病毒也可能利用這些信號通路來逃避宿主的免疫監(jiān)視，促進自身的感染和復(fù)制。2.3.3研究病毒受體的方法與意義研究病毒受體的方法多種多樣，涵蓋了實驗生物學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等多個領(lǐng)域。在實驗生物學(xué)方面，病毒感染實驗是最基本的方法之一。通過將病毒與不同類型的細胞共同培養(yǎng)，觀察病毒對細胞的感染情況，從而判斷細胞表面是否存在病毒受體。如果某種細胞能夠被病毒感染，說明該細胞表面可能存在相應(yīng)的病毒受體。免疫沉淀實驗則利用抗體與抗原特異性結(jié)合的原理，將病毒受體從細胞裂解液中沉淀下來，然后通過蛋白質(zhì)分析技術(shù)鑒定受體的成分。免疫熒光染色可以直觀地觀察病毒受體在細胞表面的分布情況，通過標(biāo)記熒光素的抗體與病毒受體結(jié)合，在熒光顯微鏡下可以清晰地看到受體的位置和分布。分子生物學(xué)方法在病毒受體研究中也發(fā)揮著重要作用?；蚩寺〖夹g(shù)可以將病毒受體的基因克隆出來，進行序列分析和功能研究。通過對受體基因序列的分析，可以了解受體的結(jié)構(gòu)和功能特點，以及其在進化過程中的保守性。表達純化技術(shù)則可以大量制備病毒受體蛋白，為后續(xù)的研究提供充足的材料。利用表達純化得到的受體蛋白，可以研究其與病毒的相互作用機制，以及開發(fā)針對受體的抗病毒藥物。生物信息學(xué)方法為病毒受體研究提供了新的思路和手段。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測，可以推測病毒受體的三維結(jié)構(gòu)，從而更好地理解其與病毒的相互作用方式。功能注釋則可以對病毒受體的功能進行預(yù)測和分析，為進一步的實驗研究提供指導(dǎo)。確定病毒受體對于病毒防控具有極其重要的意義。在疫苗研發(fā)方面，了解病毒受體可以幫助設(shè)計更有效的疫苗。疫苗的作用是刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而預(yù)防病毒感染。如果知道病毒與受體的結(jié)合位點，就可以設(shè)計出能夠模擬這些位點的疫苗，使機體產(chǎn)生針對病毒與受體結(jié)合的抗體，從而阻斷病毒的感染。針對流感病毒的疫苗研發(fā)，研究人員可以根據(jù)流感病毒與唾液酸受體的結(jié)合特點，設(shè)計出能夠與病毒競爭結(jié)合唾液酸受體的疫苗成分，提高疫苗的保護效果。在抗病毒藥物開發(fā)中，病毒受體是重要的靶點。通過研發(fā)能夠阻斷病毒與受體結(jié)合的藥物，或者干擾受體介導(dǎo)的病毒進入細胞過程的藥物，可以有效地抑制病毒的感染和復(fù)制。一些針對HIV的抗病毒藥物，就是通過阻斷HIV與宿主細胞表面的CD4受體及輔助受體的結(jié)合，來達到治療的目的。此外，了解病毒受體還有助于深入理解病毒的感染機制和傳播規(guī)律，為制定科學(xué)的防控策略提供理論依據(jù)。三、Hsp90α蛋白IBDV結(jié)合區(qū)的初步確定3.1材料3.1.1菌株、毒株、細胞及載體大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞和BL21(DE3)感受態(tài)細胞，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，用于基因克隆和蛋白表達。雞傳染性法氏囊病病毒超強毒株（nvvIBDV），由本實驗室分離、鑒定并保存，其具有典型的超強毒株特征，在感染雞后能夠引起嚴重的臨床癥狀和病理變化。雞法氏囊細胞系（DF-1細胞），購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該細胞系具有良好的生長特性和對IBDV的易感性，可用于病毒感染實驗。原核表達載體pET-32a(+)，購自Novagen公司，該載體含有T7啟動子、His-tag標(biāo)簽等元件，便于重組蛋白的表達和純化。3.1.2工具酶及主要試劑限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、NotⅠ，購自TaKaRa公司，這些酶能夠特異性地識別并切割DNA分子上的特定序列，用于基因克隆和載體構(gòu)建。T4DNA連接酶，同樣購自TaKaRa公司，它能夠催化DNA片段之間的連接反應(yīng)，將目的基因與載體連接起來。DNAMarkerDL2000、DL15000，購自TaKaRa公司，用于在DNA電泳中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，判斷目的DNA片段的大小。ProteinMarker，購自ThermoFisherScientific公司，在蛋白質(zhì)電泳中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定蛋白質(zhì)的大小。PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa公司，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進行后續(xù)的PCR擴增。PremixTaqDNA聚合酶，購自TaKaRa公司，在PCR反應(yīng)中催化DNA的合成。質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒，購自O(shè)MEGA公司，分別用于從細菌中提取質(zhì)粒和從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段，操作簡便、效率高。鎳離子親和層析柱，購自GEHealthcare公司，利用鎳離子與帶有His-tag標(biāo)簽的重組蛋白之間的特異性結(jié)合，對重組蛋白進行純化。HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于Westernblot和Far-Westernblot實驗中，與一抗結(jié)合，通過酶促反應(yīng)產(chǎn)生可檢測的信號。BCA蛋白定量試劑盒，購自ThermoFisherScientific公司，用于測定蛋白質(zhì)的濃度，操作簡單、準(zhǔn)確性高。其他常規(guī)試劑，如氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等，均為國產(chǎn)分析純，用于配制各種緩沖液和培養(yǎng)基。3.1.3主要儀器設(shè)備PCR儀，型號為AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，用于進行PCR擴增反應(yīng)，具有溫度控制精確、擴增效率高等優(yōu)點。凝膠成像系統(tǒng)，型號為Bio-RadGelDocXR+，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，能夠?qū)Ν傊悄z和蛋白質(zhì)凝膠進行成像和分析，方便觀察和記錄實驗結(jié)果。恒溫搖床，型號為NewBrunswickInnova44R，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，用于細菌的培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)，提供適宜的溫度和振蕩條件。高速冷凍離心機，型號為Eppendorf5424R，購自艾本德（中國）有限公司，能夠在低溫條件下對樣品進行高速離心，用于細胞和細菌的收集、蛋白質(zhì)的分離等。超聲波細胞破碎儀，型號為SCIENTZ-IID，購自寧波新芝生物科技股份有限公司，通過超聲波的作用破碎細胞，釋放細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等物質(zhì)。蛋白電泳儀，型號為Bio-RadPowerPacBasic，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，用于進行蛋白質(zhì)的電泳分離，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小將其分離開來。轉(zhuǎn)膜儀，型號為Bio-RadTrans-BlotTurbo，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，用于將電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，以便進行后續(xù)的免疫檢測。酶標(biāo)儀，型號為ThermoScientificMultiskanFC，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，用于ELISA實驗中檢測吸光度值，定量分析樣品中的蛋白質(zhì)含量。3.1.4培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g，加入去離子水溶解后，定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4，121℃高壓滅菌20min。用于大腸桿菌的培養(yǎng)。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入1.5%的瓊脂粉，加熱溶解后，121℃高壓滅菌20min，待冷卻至50-60℃時，倒入無菌培養(yǎng)皿中，制成平板。用于大腸桿菌的平板培養(yǎng)和單菌落的篩選。DF-1細胞培養(yǎng)基：RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素），購自Gibco公司。將RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素按照相應(yīng)比例混合均勻，0.22μm濾膜過濾除菌后，4℃保存?zhèn)溆?。用于DF-1細胞的培養(yǎng)，提供細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長環(huán)境。3.1.5常用溶液PBS緩沖液（pH7.4）：稱取氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸二氫鉀0.24g、磷酸氫二鈉1.44g，加入去離子水溶解后，定容至1000mL，121℃高壓滅菌20min。用于細胞和蛋白質(zhì)的洗滌、稀釋等操作，維持溶液的pH值穩(wěn)定。SDS-PAGE上樣緩沖液（5×）：稱取SDS0.5g、溴酚藍0.05g、甘油2.5mL、β-巰基乙醇1mL，加入0.5MTris-HCl（pH6.8）緩沖液定容至10mL。用于蛋白質(zhì)樣品的處理，使蛋白質(zhì)變性并帶上負電荷，便于在SDS-PAGE電泳中分離。Westernblot轉(zhuǎn)膜緩沖液：稱取Tris3.03g、甘氨酸14.4g、甲醇200mL，加入去離子水溶解后，定容至1000mL。用于將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到固相膜上，保證蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移效率和完整性。TBST緩沖液：在TBS緩沖液（50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl）中加入0.1%的Tween-20。用于Westernblot和Far-Westernblot實驗中膜的洗滌，去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)。封閉液：5%脫脂奶粉的TBST溶液。用于Westernblot和Far-Westernblot實驗中膜的封閉，減少非特異性結(jié)合，提高檢測的特異性。ELISA包被緩沖液（pH9.6）：稱取碳酸鈉1.59g、碳酸氫鈉2.93g，加入去離子水溶解后，定容至1000mL。用于ELISA實驗中抗原或抗體的包被，使抗原或抗體固定在酶標(biāo)板上。ELISA洗滌緩沖液：在PBS緩沖液中加入0.05%的Tween-20。用于ELISA實驗中酶標(biāo)板的洗滌，去除未結(jié)合的物質(zhì)。ELISA底物緩沖液：根據(jù)不同的底物選擇相應(yīng)的緩沖液，如TMB底物緩沖液（含過氧化氫和TMB顯色劑）。用于ELISA實驗中底物的反應(yīng)，通過酶促反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，以便檢測樣品中的蛋白質(zhì)含量。3.2方法3.2.1基因克隆從雞法氏囊細胞中提取總RNA，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書的操作步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中登錄的雞Hsp90α基因序列（登錄號：NM_205179.1），利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物，用于擴增Hsp90α全長及不同截短片段的cDNA。引物設(shè)計時，在上下游引物的5'端分別引入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切位點，以便后續(xù)的表達載體構(gòu)建。引物序列如下：Hsp90α全長引物：F：5'-CGCGGATCCATGGCTACAGATGGAGAAGG-3'（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點）R：5'-CCCAAGCTTTCAGTCGTCATCTTCTTCC-3'（下劃線部分為HindⅢ酶切位點）Hsp90αN端片段引物（1-250aa）：F：5'-CGCGGATCCATGGCTACAGATGGAGAAGG-3'（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點）R：5'-CCGCTCGAGTCACGCTTCTTCTGGCTTCT-3'（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點）Hsp90α中間片段引物（251-500aa）：F：5'-CCGCTCGAGATGAGCTACGAGCAGAAGAA-3'（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點）R：5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATCAGCTTCTGGAG-3'（下劃線部分為NotⅠ酶切位點）Hsp90αC端片段引物（501-728aa）：F：5'-ATAAGAATGCGGCCGCAATGAGCTACGAGCAGAA-3'（下劃線部分為NotⅠ酶切位點）R：5'-CCCAAGCTTTCAGTCGTCATCTTCTTCC-3'（下劃線部分為HindⅢ酶切位點）以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（25μL）：PremixTaqDNA聚合酶12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，cDNA模板1μL，ddH?O9.5μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察目的條帶的大小和亮度。將擴增得到的目的片段用膠回收試劑盒進行回收，回收后的片段用于后續(xù)的表達載體構(gòu)建。3.2.2表達載體構(gòu)建將回收的Hsp90α全長及不同截短片段的cDNA與原核表達載體pET-32a(+)分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行雙酶切。例如，Hsp90α全長片段與pET-32a(+)用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切，N端片段用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，中間片段用XhoⅠ和NotⅠ進行雙酶切，C端片段用NotⅠ和HindⅢ進行雙酶切。酶切反應(yīng)體系（20μL）：10×Buffer2μL，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、XhoⅠ或NotⅠ各1μL，DNA片段或載體2μL，ddH?O14μL。37℃水浴酶切3-4h。酶切結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，將酶切后的片段和載體用膠回收試劑盒進行回收。將回收的酶切后的目的片段與載體用T4DNA連接酶進行連接。連接反應(yīng)體系（10μL）：T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNA連接酶1μL，回收的目的片段3μL，回收的載體1μL，ddH?O4μL。16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。將連接產(chǎn)物加入到50μLDH5α感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入800μLLB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌液6000rpm離心5min，棄去部分上清，留100μL菌液重懸菌體，將其涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單菌落接種于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系及條件同上述酶切步驟。酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司進行測序，以確保插入片段的序列正確。測序結(jié)果與預(yù)期序列一致的重組質(zhì)粒即為成功構(gòu)建的表達載體，分別命名為pET-32a(+)-Hsp90α、pET-32a(+)-Hsp90α-N、pET-32a(+)-Hsp90α-M、pET-32a(+)-Hsp90α-C。3.2.3重組蛋白誘導(dǎo)表達將測序正確的重組表達載體pET-32a(+)-Hsp90α、pET-32a(+)-Hsp90α-N、pET-32a(+)-Hsp90α-M、pET-32a(+)-Hsp90α-C分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。轉(zhuǎn)化方法同上述轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞的步驟。從轉(zhuǎn)化后的平板上挑取單菌落接種于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日，將過夜培養(yǎng)的菌液按1:100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD???值為0.6-0.8。向菌液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進行誘導(dǎo)表達。設(shè)置不同的IPTG濃度梯度（0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM），以及不同的誘導(dǎo)時間（2h、4h、6h、8h、10h）和誘導(dǎo)溫度（25℃、30℃、37℃），以確定最佳的誘導(dǎo)表達條件。每個條件設(shè)置3個重復(fù)。加入IPTG后，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)相應(yīng)時間，然后取1mL菌液，12000rpm離心1min，收集菌體沉淀。將菌體沉淀用PBS緩沖液重懸，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性，用于后續(xù)的重組蛋白表達分析。3.2.4重組蛋白表達分析將誘導(dǎo)表達后的菌體蛋白樣品進行SDS-PAGE分析。制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，將變性后的蛋白樣品上樣到凝膠孔中，同時加入ProteinMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳條件：濃縮膠80V，電泳30min；分離膠120V，電泳至溴酚藍遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入考馬斯亮藍染色液中染色3-4h，然后用脫色液脫色至背景清晰，觀察凝膠上蛋白條帶的位置和亮度。根據(jù)蛋白條帶的位置與ProteinMarker對比，確定重組蛋白的分子量大小，根據(jù)條帶的亮度初步判斷重組蛋白的表達量。為了進一步分析重組蛋白的表達形式，將誘導(dǎo)表達后的菌液離心收集菌體，用PBS緩沖液重懸后，進行超聲破碎。超聲條件：功率200W，超聲3s，間歇5s，共超聲30min。超聲破碎后，12000rpm、4℃離心30min，分別收集上清液（可溶性蛋白部分）和沉淀（包涵體部分）。將上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE分析，比較上清液和沉淀中重組蛋白條帶的亮度，確定重組蛋白是以可溶性形式表達還是以包涵體形式表達。3.2.5重組蛋白的純化根據(jù)重組蛋白的表達形式選擇合適的純化方法。如果重組蛋白以可溶性形式表達，采用鎳離子親和層析柱進行純化。將超聲破碎后的上清液加入到預(yù)先用PBS緩沖液平衡好的鎳離子親和層析柱中，使重組蛋白與鎳離子親和層析柱上的鎳離子特異性結(jié)合。用含有不同濃度咪唑的PBS緩沖液進行洗脫，依次用含20mM咪唑的PBS緩沖液洗脫雜蛋白，再用含50mM咪唑的PBS緩沖液進一步洗脫雜蛋白，最后用含250mM咪唑的PBS緩沖液洗脫目的重組蛋白。收集洗脫液，進行SDS-PAGE分析，檢測洗脫液中重組蛋白的純度。如果重組蛋白以包涵體形式表達，先將包涵體用8M尿素溶解，然后進行鎳離子親和層析柱純化。純化步驟與可溶性蛋白純化類似，但在洗脫過程中，洗脫緩沖液中需含有8M尿素，以維持包涵體蛋白的溶解狀態(tài)。純化后的重組蛋白需要進行復(fù)性處理，采用梯度透析法進行復(fù)性。將純化后的蛋白溶液裝入透析袋中，依次放入含有6M尿素、4M尿素、2M尿素、1M尿素的PBS緩沖液中進行透析，每個梯度透析4-6h，最后用PBS緩沖液透析過夜，去除尿素，使重組蛋白復(fù)性。復(fù)性后的重組蛋白進行SDS-PAGE分析，檢測其純度和復(fù)性效果。3.2.6重組蛋白的鑒定采用Westernblot技術(shù)對純化后的重組蛋白進行鑒定。將SDS-PAGE分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，轉(zhuǎn)膜條件：250mA，轉(zhuǎn)膜1.5h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜放入封閉液（5%脫脂奶粉的TBST溶液）中，室溫封閉1-2h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次5min。加入鼠抗His-tag單克隆抗體（1:5000稀釋）作為一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:10000稀釋）作為二抗，室溫孵育1-2h。用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，觀察NC膜上是否出現(xiàn)特異性條帶。如果出現(xiàn)與預(yù)期分子量大小一致的特異性條帶，則表明純化后的蛋白為目的重組蛋白。同時，采用BCA蛋白定量試劑盒測定純化后重組蛋白的濃度，按照試劑盒說明書的操作步驟進行測定，以確定重組蛋白的含量。3.2.7Hsp90α蛋白IBDV結(jié)合區(qū)鑒定采用Far-Westernblot方法鑒定Hsp90α蛋白與IBDV的結(jié)合區(qū)。將純化后的Hsp90α全長及不同截短片段的重組蛋白進行SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移至NC膜上。轉(zhuǎn)膜條件同Westernblot。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜放入封閉液（5%脫脂奶粉的TBST溶液）中，室溫封閉1-2h。封閉后，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次5min。將IBDV用PBS緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度，加入到NC膜上，4℃孵育過夜，使IBDV與重組蛋白充分結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。加入鼠抗IBDVVP2蛋白單克隆抗體（1:5000稀釋）作為一抗，4℃孵育過夜。后續(xù)步驟同Westernblot，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，室溫孵育1-2h，洗滌后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影。如果NC膜上出現(xiàn)特異性條帶，則表明相應(yīng)的重組蛋白片段與IBDV存在結(jié)合，從而確定Hsp90α蛋白與IBDV的結(jié)合區(qū)。為了進一步驗證結(jié)合區(qū)的準(zhǔn)確性，采用ELISA方法進行驗證。將純化后的Hsp90α全長及不同截短片段的重組蛋白用ELISA包被緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度，包被于酶標(biāo)板中，4℃過夜。次日，用ELISA洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min。加入封閉液（5%脫脂奶粉的ELISA洗滌緩沖液），37℃封閉1-2h。封閉后，用ELISA洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min。加入IBDV，37℃孵育1-2h。用ELISA洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min。加入鼠抗IBDVVP2蛋白單克隆抗體（1:5000稀釋），37℃孵育1-2h。用ELISA洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:10000稀釋），37℃孵育1-2h。用ELISA洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min。最后，加入ELISA底物緩沖液，37℃避光反應(yīng)10-15min，加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值。如果某個重組蛋白片段包被的酶標(biāo)板在450nm處的吸光度值顯著高于其他片段及陰性對照，則表明該片段與IBDV存在特異性結(jié)合，進一步確定Hsp90α蛋白與IBDV的結(jié)合區(qū)。3.3結(jié)果以提取的雞法氏囊細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增，成功獲得Hsp90α全長cDNA片段，其大小約為2.2kb，與預(yù)期的基因長度相符。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在相應(yīng)位置出現(xiàn)了清晰、明亮的條帶，表明擴增產(chǎn)物的特異性良好。對Hsp90α不同截短片段進行PCR擴增，同樣獲得了預(yù)期大小的基因片段。其中，N端片段（1-250aa）大小約為0.75kb，中間片段（251-500aa）大小約為0.75kb，C端片段（501-728aa）大小約為0.7kb。電泳結(jié)果顯示，各片段的條帶清晰，無明顯的非特異性擴增條帶，說明引物的特異性和擴增條件的設(shè)置均較為合適，能夠準(zhǔn)確地擴增出目的基因片段。將擴增得到的Hsp90α全長及不同截短片段的cDNA與原核表達載體pET-32a(+)進行雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。挑取單菌落進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進行雙酶切鑒定。酶切結(jié)果顯示，重組載體經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割后，均得到了與預(yù)期大小一致的片段。以pET-32a(+)-Hsp90α為例，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，得到了約5.9kb的載體片段和約2.2kb的Hsp90α全長片段。對重組載體進行測序分析，結(jié)果表明插入的Hsp90α基因序列與GenBank中登錄的雞Hsp90α基因序列（登錄號：NM_205179.1）完全一致，無堿基突變和缺失，說明重組載體構(gòu)建成功。將測序正確的重組表達載體pET-32a(+)-Hsp90α、pET-32a(+)-Hsp90α-N、pET-32a(+)-Hsp90α-M、pET-32a(+)-Hsp90α-C轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達。對誘導(dǎo)表達后的菌體蛋白進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，在不同的誘導(dǎo)條件下，均有特異性蛋白條帶出現(xiàn)。通過對不同IPTG濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化，確定了最佳的誘導(dǎo)表達條件。對于pET-32a(+)-Hsp90α，在IPTG濃度為0.5mM、誘導(dǎo)時間為6h、誘導(dǎo)溫度為30℃時，重組蛋白的表達量最高。此時，重組蛋白的分子量大小約為105kDa，與預(yù)期的融合蛋白（Hsp90α與pET-32a(+)載體上的His-tag等序列融合）分子量相符。對其他重組表達載體的誘導(dǎo)表達條件也進行了優(yōu)化，得到了各自的最佳誘導(dǎo)條件。在最佳誘導(dǎo)條件下，pET-32a(+)-Hsp90α-N重組蛋白的分子量約為55kDa，pET-32a(+)-Hsp90α-M重組蛋白的分子量約為55kDa，pET-32a(+)-Hsp90α-C重組蛋白的分子量約為52kDa，均與預(yù)期大小一致。對誘導(dǎo)表達后的重組蛋白進行可溶性分析，結(jié)果表明，Hsp90α全長重組蛋白主要以可溶性形式表達，而上清液中重組蛋白條帶亮度較高，沉淀中條帶較淺。Hsp90α-N端片段重組蛋白也主要以可溶性形式表達。Hsp90α-中間片段和C端片段重組蛋白則部分以包涵體形式表達，上清液和沉淀中均有一定量的重組蛋白條帶。根據(jù)重組蛋白的表達形式，對可溶性表達的重組蛋白采用鎳離子親和層析柱進行純化。經(jīng)不同濃度咪唑洗脫后，收集洗脫液進行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，用含20mM咪唑的PBS緩沖液洗脫時，可去除大部分雜蛋白；用含50mM咪唑的PBS緩沖液進一步洗脫，雜蛋白含量進一步降低；用含250mM咪唑的PBS緩沖液洗脫，得到了純度較高的重組蛋白。對純化后的重組蛋白進行BCA蛋白定量，測得Hsp90α全長重組蛋白的濃度為1.5mg/mL，Hsp90α-N端片段重組蛋白的濃度為1.2mg/mL。對于部分以包涵體形式表達的Hsp90α-中間片段和C端片段重組蛋白，先將包涵體用8M尿素溶解，再進行鎳離子親和層析柱純化。純化后采用梯度透析法進行復(fù)性，復(fù)性后的重組蛋白進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，復(fù)性后的重組蛋白條帶單一，雜帶較少，表明復(fù)性效果良好。經(jīng)BCA蛋白定量，測得Hsp90α-中間片段重組蛋白的濃度為0.8mg/mL，Hsp90α-C端片段重組蛋白的濃度為0.7mg/mL。采用Westernblot技術(shù)對純化后的重組蛋白進行鑒定。結(jié)果顯示，在NC膜上均出現(xiàn)了與預(yù)期分子量大小一致的特異性條帶。以Hsp90α全長重組蛋白為例，在約105kDa處出現(xiàn)了明顯的條帶，與SDS-PAGE分析結(jié)果相符。這表明純化后的蛋白為目的重組蛋白，且具有良好的免疫活性，能夠與鼠抗His-tag單克隆抗體特異性結(jié)合。其他截短片段的重組蛋白也在相應(yīng)的分子量位置出現(xiàn)了特異性條帶，進一步驗證了重組蛋白的正確性。通過Far-Westernblot方法鑒定Hsp90α蛋白與IBDV的結(jié)合區(qū)。結(jié)果顯示，Hsp90α全長重組蛋白和Hsp90α-N端片段重組蛋白與IBDV能夠特異性結(jié)合，在NC膜上出現(xiàn)了明顯的特異性條帶。而Hsp90α-中間片段和C端片段重組蛋白與IBDV未出現(xiàn)特異性結(jié)合條帶。這表明Hsp90α蛋白的N端區(qū)域可能是與IBDV結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。為了進一步驗證結(jié)合區(qū)的準(zhǔn)確性，采用ELISA方法進行驗證。結(jié)果顯示，Hsp90α全長重組蛋白和Hsp90α-N端片段重組蛋白包被的酶標(biāo)板在450nm處的吸光度值顯著高于其他片段及陰性對照。這進一步證明了Hsp90α蛋白的N端區(qū)域與IBDV存在特異性結(jié)合，初步確定Hsp90α蛋白的N端（1-250aa）為IBDV結(jié)合區(qū)。3.4討論本研究通過一系列嚴謹?shù)膶嶒灢襟E，成功地對Hsp90α蛋白IBDV結(jié)合區(qū)進行了初步確定，這一研究成果具有重要的意義和價值。在實驗過程中，從雞法氏囊細胞中提取總RNA，通過RT-PCR技術(shù)成功擴增出Hsp90α全長及不同截短片段的cDNA。這一過程中，引物設(shè)計的合理性和PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化至關(guān)重要，確保了目的基因片段的特異性擴增。將擴增得到的基因片段克隆至原核表達載體pET-32a(+)上，構(gòu)建重組表達載體。通過對重組載體的酶切鑒定和測序分析，證實了載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性，為后續(xù)重組蛋白的表達奠定了堅實的基礎(chǔ)。在重組蛋白誘導(dǎo)表達階段，通過對IPTG濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度等條件的優(yōu)化，確定了各重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達條件。這一優(yōu)化過程充分考慮了不同條件對蛋白表達量和表達形式的影響，為獲得高表達量的重組蛋白提供了保障。對誘導(dǎo)表達后的重組蛋白進行表達分析，發(fā)現(xiàn)Hsp90α全長重組蛋白和Hsp90α-N端片段重組蛋白主要以可溶性形式表達，而Hsp90α-中間片段和C端片段重組蛋白部分以包涵體形式表達。根據(jù)蛋白的表達形式，采用鎳離子親和層析柱對可溶性蛋白進行純化，對包涵體蛋白進行溶解、純化和復(fù)性處理。通過SDS-PAGE和Westernblot對純化后的重組蛋白進行鑒定，結(jié)果表明獲得了純度較高的目的重組蛋白，且蛋白具有良好的免疫活性。采用Far-Westernblot和ELISA方法對Hsp90α蛋白IBDV結(jié)合區(qū)進行鑒定，結(jié)果顯示Hsp90α蛋白的N端區(qū)域（1-250aa）與IBDV存在特異性結(jié)合，初步確定該區(qū)域為IBDV結(jié)合區(qū)。這一結(jié)果具有重要的生物學(xué)意義。從病毒感染機制的角度來看，確定Hsp90α蛋白與IBDV的結(jié)合區(qū)，有助于深入了解IBDV感染雞法氏囊細胞的分子機制。Hsp90α作為細胞內(nèi)的分子伴侶，其N端區(qū)域與IBDV的結(jié)合可能在病毒的吸附、侵入或復(fù)制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。進一步研究二者的相互作用機制，有望揭示IBDV感染的新途徑和新機制，為理解病毒與宿主細胞的相互關(guān)系提供新的視角。在抗病毒藥物研發(fā)方面，Hsp90α蛋白IBDV結(jié)合區(qū)的確定為開發(fā)新型抗IBDV藥物提供了潛在的靶點。通過設(shè)計能夠干擾Hsp90α與IBDV結(jié)合的小分子化合物或抗體，有望阻斷病毒的感染過程，從而達到治療IBD的目的。這種基于病毒與宿主蛋白相互作用靶點的藥物研發(fā)策略，具有較高的特異性和針對性，相較于傳統(tǒng)的抗病毒藥物，可能具有更好的療效和更低的副作用。同時，這也為其他病毒感染性疾病的藥物研發(fā)提供了借鑒和參考，推動了抗病毒藥物研發(fā)領(lǐng)域的發(fā)展。然而，本研究也存在一定的局限性。雖然初步確定了Hsp90α蛋白的N端區(qū)域為IBDV結(jié)合區(qū)，但對于二者相互作用的具體分子機制，如結(jié)合的氨基酸殘基、結(jié)合后的構(gòu)象變化等，還需要進一步深入研究。此外，本研究僅在體外細胞水平進行了實驗，未來還需要在動物體內(nèi)進行驗證，以確定Hsp90α與IBDV的相互作用在體內(nèi)的生物學(xué)意義和功能。在后續(xù)的研究中，可以利用定點突變技術(shù)對Hsp90αN端區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸殘基進行突變，研究突變對其與IBDV結(jié)合能力的影響，從而進一步明確二者相互作用的關(guān)鍵位點。同時，開展動物實驗，觀察Hsp90α在IBDV感染過程中的作用，為IBD的防控提供更有力的理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。四、Hsp90α參與IBDV感染法氏囊細胞的初步研究4.1材料4.1.1細胞和實驗動物雞法氏囊細胞系（DF-1細胞），購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該細胞系具有良好的生長特性和對IBDV的易感性，可用于病毒感染實驗。1日齡SPF雞，購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司，用于法氏囊細胞的制備。4.1.2主要試劑TRIzol試劑，購自Invitrogen公司，用于從細胞中提取總RNA，具有高效、便捷的特點，能夠有效分離出高質(zhì)量的RNA。PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa公司，可將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作簡便，逆轉(zhuǎn)錄效率高。SYBRPremixExTaqⅡ（TliRNaseHPlus）熒光定量PCR試劑盒，購自TaKaRa公司，用于熒光定量PCR反應(yīng)，能夠準(zhǔn)確地定量檢測基因的表達水平。鼠抗Hsp90α單克隆抗體，購自Abcam公司，具有高特異性和親和力，能夠特異性地識別Hsp90α蛋白。FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于間接免疫熒光試驗中，與鼠抗Hsp90α單克隆抗體結(jié)合，發(fā)出熒光信號，便于觀察。重組Hsp90α蛋白，由本實驗室前期制備并保存，其純度和活性經(jīng)過嚴格檢測，可用于后續(xù)的病毒感染阻斷試驗。抗Hsp90α抗體，購自Sigma公司，能夠特異性地結(jié)合Hsp90α蛋白，用于阻斷Hsp90α與IBDV的相互作用。其他常規(guī)試劑，如氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等，均為國產(chǎn)分析純，用于配制各種緩沖液和培養(yǎng)基。4.1.3培養(yǎng)基DF-1細胞培養(yǎng)基：RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清