ID1在結(jié)腸癌增殖與血管生成中的關(guān)鍵作用及機(jī)制探究

ID1在結(jié)腸癌增殖與血管生成中的關(guān)鍵作用及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景結(jié)腸癌作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)193萬(wàn)，在所有癌癥中位居第三；死亡病例數(shù)為93.5萬(wàn)，位居第二。在中國(guó)，隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率也呈逐年上升趨勢(shì)。結(jié)腸癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期。此時(shí)，腫瘤往往已經(jīng)發(fā)生局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療難度顯著增加。目前，結(jié)腸癌的主要治療手段包括手術(shù)切除、化療、放療以及靶向治療等。盡管這些治療方法在一定程度上能夠延長(zhǎng)患者的生存期，但總體治療效果仍不盡人意，患者的5年生存率依然較低。深入探究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)于提高其早期診斷率、開發(fā)新的治療方法以及改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及眾多基因和信號(hào)通路的異常調(diào)控。其中，細(xì)胞增殖失控和血管生成異常是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞增殖是腫瘤生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，而血管生成則為腫瘤提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時(shí)也是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑。DNA結(jié)合抑制因子1（ID1）作為一種螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，近年來在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注。已有研究表明，ID1在多種人類癌癥類型中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌中，ID1的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)，其可通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白促進(jìn)癌細(xì)胞增殖；在肺癌中，ID1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，并且與腫瘤血管生成密切相關(guān)。然而，ID1在結(jié)腸癌中的具體作用及機(jī)制尚未完全明確。研究ID1在結(jié)腸癌增殖與血管生成中的作用及可能機(jī)制，有望為結(jié)腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的本研究旨在深入探討ID1在結(jié)腸癌增殖與血管生成中的作用及可能機(jī)制，具體目標(biāo)如下：明確ID1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)特征：通過收集結(jié)腸癌患者的腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁正常組織，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和免疫組織化學(xué)（IHC）等技術(shù)，檢測(cè)ID1在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)（如腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等）之間的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。揭示ID1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響：在體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞系，利用基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9系統(tǒng)）構(gòu)建ID1過表達(dá)和敲低的細(xì)胞模型。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）實(shí)驗(yàn)、5-乙炔基-2’-脫氧尿苷（EdU）摻入實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法，檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化；采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率，觀察ID1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響。同時(shí)，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）、免疫熒光等技術(shù)，篩選并鑒定與ID1相互作用的蛋白，進(jìn)一步探究ID1影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制。闡明ID1在結(jié)腸癌血管生成中的作用機(jī)制：將ID1過表達(dá)或敲低的結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法）、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（如Transwell小室實(shí)驗(yàn)）和管腔形成實(shí)驗(yàn)，觀察對(duì)HUVECs增殖、遷移和管腔形成能力的影響。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型，通過尾靜脈注射或瘤內(nèi)注射等方式給予針對(duì)ID1的干預(yù)措施，利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中的微血管密度（MVD），結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤血管的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，深入研究ID1在結(jié)腸癌血管生成中的作用機(jī)制。此外，通過基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，篩選出ID1下游與血管生成相關(guān)的信號(hào)通路和關(guān)鍵分子，運(yùn)用Westernblot、免疫熒光等方法進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步探討其調(diào)控機(jī)制。探究ID1與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系：收集大量結(jié)腸癌患者的臨床資料，包括手術(shù)切除標(biāo)本、隨訪信息等，分析ID1表達(dá)水平與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移（如肝轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移等）和預(yù)后指標(biāo)（如總生存期、無病生存期等）之間的相關(guān)性。通過體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（如裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型、脾內(nèi)注射肝轉(zhuǎn)移模型等），研究ID1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，以及對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析，挖掘與ID1相關(guān)的潛在分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為結(jié)腸癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和個(gè)性化治療提供理論依據(jù)和新的策略。1.3研究意義理論意義：目前，結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，盡管已有研究揭示了一些與結(jié)腸癌相關(guān)的基因和信號(hào)通路，但仍存在許多未知領(lǐng)域。本研究聚焦于ID1在結(jié)腸癌增殖與血管生成中的作用及機(jī)制，有望為深入理解結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制提供新的視角和理論依據(jù)。若能明確ID1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將有助于填補(bǔ)該領(lǐng)域在相關(guān)機(jī)制研究方面的空白，進(jìn)一步完善結(jié)腸癌的發(fā)病理論體系。這不僅能夠豐富腫瘤生物學(xué)的基礎(chǔ)研究?jī)?nèi)容，還能為后續(xù)其他相關(guān)研究提供重要的參考和借鑒，推動(dòng)整個(gè)腫瘤研究領(lǐng)域的發(fā)展。臨床應(yīng)用價(jià)值：對(duì)結(jié)腸癌患者而言，當(dāng)前的治療手段存在一定局限性，如化療藥物的毒副作用、靶向治療的耐藥性等，導(dǎo)致患者的生存質(zhì)量和預(yù)后受到影響。本研究若能證實(shí)ID1可作為結(jié)腸癌治療的潛在靶點(diǎn)，將為開發(fā)新的治療方法提供有力的理論支持。通過針對(duì)ID1設(shè)計(jì)特異性的抑制劑或激活劑，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸癌的精準(zhǔn)治療，提高治療效果，減少對(duì)正常組織的損傷。此外，明確ID1與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系，有助于建立更準(zhǔn)確的預(yù)后評(píng)估體系。醫(yī)生可根據(jù)患者腫瘤組織中ID1的表達(dá)水平，更精準(zhǔn)地預(yù)測(cè)患者的疾病進(jìn)展和預(yù)后情況，從而制定個(gè)性化的治療方案和隨訪計(jì)劃，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1結(jié)腸癌概述結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，起源于結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞。結(jié)腸作為消化系統(tǒng)的重要組成部分，承擔(dān)著吸收水分、電解質(zhì)以及儲(chǔ)存和排泄糞便的功能。當(dāng)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生異常增殖和分化時(shí)，便可能引發(fā)結(jié)腸癌。根據(jù)腫瘤的大體形態(tài)，結(jié)腸癌可分為潰瘍型、腫塊型和浸潤(rùn)型。潰瘍型較為常見，約占50%以上，其特點(diǎn)是早期即可形成潰瘍，容易出血，分化程度通常較低，轉(zhuǎn)移發(fā)生相對(duì)較早。腫塊型腫瘤呈膨脹性生長(zhǎng)，隨著腫塊增大，表面可產(chǎn)生潰瘍，向周圍組織浸潤(rùn)較少，預(yù)后相對(duì)較好。浸潤(rùn)型癌腫則沿腸壁各層彌漫浸潤(rùn)，導(dǎo)致局部腸壁增厚、腸腔狹窄，該型分化程度低，轉(zhuǎn)移早，預(yù)后較差。在組織學(xué)上，結(jié)腸癌主要包括腺癌、腺鱗癌和未分化癌等類型，其中腺癌最為多見，約占75%-85%，主要為管狀腺癌和乳頭狀癌，其次是黏液腺癌，占10%-20%，印戒細(xì)胞癌最少見。從流行病學(xué)角度來看，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均呈上升趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)193萬(wàn)，在所有癌癥中位居第三；死亡病例數(shù)為93.5萬(wàn)，位居第二。在我國(guó)，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的西方化，結(jié)腸癌的發(fā)病率也在逐年攀升，且發(fā)病年齡逐漸年輕化。有研究表明，41-65歲人群是我國(guó)結(jié)腸癌的高發(fā)人群。此外，結(jié)腸癌的發(fā)病率存在明顯的地域差異，發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率普遍高于發(fā)展中國(guó)家，城市地區(qū)高于農(nóng)村地區(qū)。這種差異可能與飲食習(xí)慣、環(huán)境因素以及醫(yī)療資源的分布等有關(guān)。目前認(rèn)為，結(jié)腸癌的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果。環(huán)境因素在結(jié)腸癌的發(fā)病中起著重要作用，過多攝入高脂肪、高蛋白和低膳食纖維的食物，會(huì)改變腸道內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境，增加腸道內(nèi)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸的濃度，這些物質(zhì)可能對(duì)結(jié)腸黏膜產(chǎn)生刺激和損傷，從而誘發(fā)結(jié)腸癌。長(zhǎng)期吸煙和過量飲酒也是結(jié)腸癌的危險(xiǎn)因素，煙草中的尼古丁、焦油等有害物質(zhì)以及酒精的代謝產(chǎn)物乙醛，都可能對(duì)腸道黏膜造成損害，導(dǎo)致基因突變和細(xì)胞增殖異常。缺乏運(yùn)動(dòng)使得腸道蠕動(dòng)減緩，有害物質(zhì)在腸道內(nèi)停留時(shí)間延長(zhǎng)，增加了腸道黏膜與致癌物質(zhì)的接觸機(jī)會(huì)，進(jìn)而提高了患癌風(fēng)險(xiǎn)。遺傳因素在結(jié)腸癌的發(fā)生中也占據(jù)重要地位。大約15%-20%的結(jié)腸癌患者具有家族遺傳傾向，其中家族性腺瘤性息肉?。‵AP）和遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC，又稱林奇綜合征）是兩種常見的遺傳性結(jié)腸癌綜合征。FAP是由APC基因突變引起的常染色體顯性遺傳病，患者的結(jié)直腸內(nèi)會(huì)出現(xiàn)大量腺瘤性息肉，若不及時(shí)治療，幾乎100%會(huì)發(fā)展為結(jié)腸癌。HNPCC則是由于DNA錯(cuò)配修復(fù)基因（如MLH1、MSH2、MSH6和PMS2等）突變導(dǎo)致的，該綜合征患者患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，且發(fā)病年齡相對(duì)較早。即使是非遺傳性結(jié)腸癌，遺傳因素也可能通過影響個(gè)體對(duì)環(huán)境因素的易感性，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。結(jié)腸腺瘤是結(jié)腸癌最主要的癌前疾病。具備腺瘤直徑>10mm、絨毛狀腺瘤或混合性腺瘤中絨毛狀結(jié)構(gòu)超過25%、伴有高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變這三項(xiàng)條件之一者，即為高危腺瘤，其癌變風(fēng)險(xiǎn)較高。炎癥性腸病，特別是潰瘍性結(jié)腸炎，由于腸道黏膜長(zhǎng)期受到炎癥刺激，發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，多見于幼年起病、病變范圍廣且病程長(zhǎng)或伴有原發(fā)性硬化性膽管炎的患者。此外，大便隱血陽(yáng)性、有結(jié)腸癌家族史、本人有癌癥史、長(zhǎng)期吸煙、過度攝入酒精、肥胖、少活動(dòng)、年齡>50歲以及有盆腔放療史者，也都屬于結(jié)腸癌的高危人群或具有高危因素。早期結(jié)腸癌通常沒有明顯癥狀，或者僅表現(xiàn)出一些不典型癥狀，如消化不良、腹部隱痛等，容易被忽視。隨著病情的進(jìn)展，患者會(huì)逐漸出現(xiàn)排便習(xí)慣與糞便性狀的改變，這是結(jié)腸癌最早出現(xiàn)的癥狀之一，表現(xiàn)為排便次數(shù)增多、腹瀉、便秘，或腹瀉與便秘交替出現(xiàn)，糞便中可能帶有黏液、膿血。腹痛也是常見癥狀，多為定位不確切的持續(xù)性隱痛，或僅為腹部不適、腹脹感，當(dāng)出現(xiàn)腸梗阻時(shí)，腹痛會(huì)加劇，呈陣發(fā)性絞痛。腹部腫塊在中晚期患者中較為常見，多為瘤體本身，也可能是梗阻近側(cè)腸腔內(nèi)的積糞，腫塊質(zhì)地較硬，表面不平，活動(dòng)度取決于腫瘤的位置和浸潤(rùn)程度。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)導(dǎo)致腸腔狹窄或堵塞時(shí)，會(huì)引發(fā)腸梗阻，表現(xiàn)為腹痛、腹脹、嘔吐、停止排氣排便等典型癥狀。此外，患者還可能出現(xiàn)貧血、消瘦、乏力、低熱等全身癥狀，這是由于腫瘤消耗、慢性失血以及營(yíng)養(yǎng)吸收障礙等原因引起的。結(jié)腸癌的診斷主要依靠多種檢查方法的綜合應(yīng)用。病史采集和體格檢查是初步診斷的基礎(chǔ)，醫(yī)生會(huì)詳細(xì)詢問患者的癥狀、家族史、既往病史等信息，并進(jìn)行全面的體格檢查，包括腹部觸診、直腸指檢等，以發(fā)現(xiàn)可能存在的異常。實(shí)驗(yàn)室檢查中，糞便潛血試驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單、常用的篩查方法，可檢測(cè)糞便中是否存在肉眼不可見的血液，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌具有一定意義。腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)，如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）等，雖然不能單獨(dú)用于結(jié)腸癌的診斷，但對(duì)于病情監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估以及復(fù)發(fā)判斷有重要價(jià)值。影像學(xué)檢查在結(jié)腸癌的診斷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，結(jié)腸鏡檢查是確診結(jié)腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，它可以直接觀察結(jié)腸黏膜的病變情況，并通過活檢獲取組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，明確腫瘤的性質(zhì)和類型。X線鋇劑灌腸造影可通過X線透視觀察腸道形態(tài)及病變情況，對(duì)于不能耐受結(jié)腸鏡檢查的患者是一種重要的補(bǔ)充檢查方法。CT檢查能夠清晰顯示腫瘤的位置、大小、形態(tài)以及與周圍組織的關(guān)系，有助于判斷腫瘤的分期和是否存在轉(zhuǎn)移。MRI檢查對(duì)軟組織的分辨力較高，在評(píng)估腫瘤浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。目前，結(jié)腸癌的總體治療原則是以手術(shù)切除為主的綜合治療。手術(shù)治療是結(jié)腸癌的主要治療手段，對(duì)于早期結(jié)腸癌，通過局部切除術(shù)或根治性切除術(shù)，切除腫瘤及周圍部分正常組織和淋巴結(jié)，有可能達(dá)到根治的目的。局部切除術(shù)適用于腫瘤較小、局限于黏膜或黏膜下層的早期患者；根治性切除術(shù)則適用于中晚期患者，切除范圍包括腫瘤、兩側(cè)腸管、系膜及淋巴結(jié)。對(duì)于晚期或復(fù)發(fā)患者，由于腫瘤無法完全切除或患者身體狀況不適合根治性手術(shù)，可采用姑息性手術(shù)，如短路手術(shù)、造瘺術(shù)等，以緩解腸梗阻、出血等癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。化療在結(jié)腸癌的治療中也占有重要地位，可分為術(shù)前化療、術(shù)后化療和姑息性化療。術(shù)前化療，又稱新輔助化療，通過使用化療藥物，可以縮小腫瘤體積，降低腫瘤分期，提高手術(shù)切除率，為原本無法手術(shù)的患者創(chuàng)造手術(shù)機(jī)會(huì)。術(shù)后化療，即輔助化療，能夠消滅殘留的癌細(xì)胞，降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的生存率。姑息性化療則主要用于晚期或復(fù)發(fā)患者，通過化療控制病情，緩解癥狀，延長(zhǎng)患者的生存期。常用的化療藥物包括氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康等，這些藥物通過不同的作用機(jī)制抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂。放射治療在結(jié)腸癌治療中主要作為輔助治療手段，用于術(shù)前或術(shù)后。術(shù)前放療可以縮小腫瘤體積，提高手術(shù)切除率；術(shù)后放療則有助于降低局部復(fù)發(fā)率。對(duì)于晚期或復(fù)發(fā)患者，姑息性放療可以控制病情，緩解疼痛等癥狀。近年來，隨著放療技術(shù)的不斷進(jìn)步，如調(diào)強(qiáng)放療（IMRT）、立體定向放療（SBRT）等的應(yīng)用，能夠更精確地照射腫瘤組織，減少對(duì)周圍正常組織的損傷，提高放療的療效和安全性。免疫治療和靶向治療是結(jié)腸癌治療領(lǐng)域的新興方法，為患者帶來了新的希望。免疫治療通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。目前，臨床上常用的免疫治療藥物如PD-1抑制劑、PD-L1抑制劑等，在部分結(jié)腸癌患者中取得了較好的療效。靶向治療則是針對(duì)腫瘤細(xì)胞特定的基因或蛋白質(zhì)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的藥物進(jìn)行精準(zhǔn)治療。例如，針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的抑制劑，如西妥昔單抗、帕尼單抗等，以及針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的抑制劑，如貝伐單抗等，能夠特異性地作用于腫瘤細(xì)胞，阻斷腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。盡管目前結(jié)腸癌的治療取得了一定進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。一方面，早期結(jié)腸癌癥狀隱匿，缺乏有效的篩查手段，導(dǎo)致很多患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)。另一方面，中晚期結(jié)腸癌患者對(duì)現(xiàn)有治療方法的耐藥性問題較為突出，使得治療效果不理想，患者的生存率和生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。此外，治療過程中的不良反應(yīng)，如化療藥物的毒副作用、放療的局部損傷等，也會(huì)給患者帶來痛苦，影響治療的依從性。因此，深入研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，開發(fā)更加有效的治療方法，是當(dāng)前結(jié)腸癌研究領(lǐng)域的重要任務(wù)。2.2ID1相關(guān)理論DNA結(jié)合抑制因子1（ID1）屬于螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子（HLH）家族中的抑制性成員。其編碼基因位于人類染色體20q11.2區(qū)域，該基因長(zhǎng)度約為4.9kb，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。ID1蛋白由158個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為19kDa。在結(jié)構(gòu)上，ID1保留了HLH結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域由大約60個(gè)氨基酸組成，包含兩個(gè)既親水又親脂的α-螺旋，中間通過一個(gè)長(zhǎng)度可變的連接環(huán)相連。與經(jīng)典的堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子不同，ID1缺乏能夠直接與DNA結(jié)合的堿性區(qū)域。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使得ID1無法單獨(dú)與DNA結(jié)合，但可以和其他bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體。當(dāng)ID1與bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，會(huì)阻止bHLH轉(zhuǎn)錄因子與DNA上的E-box元件（CANNTG）結(jié)合，從而抑制其對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，進(jìn)而影響細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等生理過程。在正常生理狀態(tài)下，ID1在多種組織和細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)。在胚胎發(fā)育過程中，ID1發(fā)揮著重要作用。例如，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，ID1參與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化調(diào)控。研究表明，在神經(jīng)干細(xì)胞中，ID1的表達(dá)水平會(huì)隨著細(xì)胞分化而逐漸降低。當(dāng)ID1基因敲除時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力下降，分化進(jìn)程加速，這表明ID1對(duì)于維持神經(jīng)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和增殖能力具有重要意義。在血管發(fā)育方面，ID1在血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)血管的生成和重塑起到關(guān)鍵作用。通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等相關(guān)因子的表達(dá)，ID1可以促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移和分化，從而參與血管新生過程。在腫瘤組織中，ID1的表達(dá)水平常常顯著上調(diào)。大量研究表明，ID1的高表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌中，ID1的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后密切相關(guān)。一方面，ID1可以通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和存活。另一方面，ID1還能夠上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在肺癌中，ID1不僅參與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡調(diào)控，還在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，ID1可以通過與缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）相互作用，促進(jìn)VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)肺癌血管生成。此外，ID1還與腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程相關(guān)，通過調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Slug等，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在結(jié)腸癌中，相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)ID1呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。武雪亮等人通過免疫組化SP法檢測(cè)50例結(jié)直腸癌和50例正常黏膜組織中Id-1的表達(dá)，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中Id-1表達(dá)陽(yáng)性率為72.00%（36/50），明顯高于正常黏膜組織的24.00%（12/50）。趙鵬等人用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)94例結(jié)腸癌和46例正常結(jié)腸組織中Id-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中Id-1的陽(yáng)性表達(dá)率（67.0%）明顯高于正常結(jié)腸組織（10.9%）。這些研究結(jié)果表明，ID1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，提示ID1可能在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。2.3ID1在結(jié)腸癌中的研究現(xiàn)狀2.3.1ID1與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)眾多研究表明，ID1的表達(dá)水平與結(jié)腸癌的臨床病理特征密切相關(guān)。武雪亮等人收集了50例結(jié)直腸癌和50例正常黏膜組織，運(yùn)用免疫組化SP法檢測(cè)Id-1的表達(dá)。結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中Id-1表達(dá)陽(yáng)性率為72.00%（36/50），明顯高于正常黏膜組織的24.00%（12/50）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Id-1的表達(dá)與腫瘤漿膜浸潤(rùn)、腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)明顯相關(guān)。趙鵬等人用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)94例結(jié)腸癌和46例正常結(jié)腸組織中Id-1的表達(dá)，結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中Id-1的陽(yáng)性表達(dá)率（67.0%）明顯高于正常結(jié)腸組織（10.9%）。并且，Id-1表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)，但與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。這些研究結(jié)果表明，ID1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。TNM分期越晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及組織學(xué)分級(jí)越低（即分化程度越差）的結(jié)腸癌患者，其腫瘤組織中ID1的表達(dá)往往越高。這提示ID1可能在結(jié)腸癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，高表達(dá)的ID1或許可以作為評(píng)估結(jié)腸癌患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后不良的一個(gè)潛在指標(biāo)。2.3.2ID1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面，諸多研究揭示了ID1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的顯著影響。于游和張才全將Id1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞以及合成Id1干擾序列轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞后，通過RT-PCR和Westernblot法檢測(cè)VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Id1過表達(dá)能顯著上調(diào)VEGFmRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)；Id1抑制后能顯著下調(diào)VEGFmRNA和蛋白表達(dá)，減緩細(xì)胞的生長(zhǎng)。這表明在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中Id1為VEGF的上游基因，Id1可通過調(diào)控VEGF途徑來影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。此外，還有研究表明ID1可能參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡過程。通過構(gòu)建ID1敲低或過表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞模型，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)ID1敲低后，細(xì)胞凋亡率明顯增加，而ID1過表達(dá)則抑制細(xì)胞凋亡。這說明ID1可能通過抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的存活和增殖。在細(xì)胞侵襲和遷移方面，相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示，沉默ID1基因可顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ID1表達(dá)下調(diào)后，結(jié)腸癌細(xì)胞穿過小室膜的數(shù)量明顯減少，細(xì)胞劃痕愈合速度減慢。這表明ID1在結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起到促進(jìn)作用，可能是通過調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），來增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力。2.3.3ID1在結(jié)腸癌血管生成中的作用研究進(jìn)展關(guān)于ID1在結(jié)腸癌血管生成中的作用，目前已有一定的研究成果。于游和張才全將Id1過表達(dá)重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞后，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，Id1過表達(dá)組HT-29細(xì)胞中HIF-1α和VEGFmRNA及蛋白的表達(dá)水平均明顯高于陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體）和空白對(duì)照組（不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染）。應(yīng)用Id1過表達(dá)的HT-29細(xì)胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）24h后，通過管狀形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVECs管狀形成的能力，發(fā)現(xiàn)用Id1過表達(dá)的HT-29細(xì)胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)HUVECs，其管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察到Id1過表達(dá)的HT-29細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤能力和MVD數(shù)明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。這些結(jié)果表明，Id1可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α和VEGF的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的血管生成能力。另有研究從腫瘤微環(huán)境角度探討ID1在結(jié)腸癌血管生成中的作用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是腫瘤組織中重要的免疫細(xì)胞群，有研究報(bào)告了TAMs中分化抑制因子1（ID1）的高表達(dá)與結(jié)直腸癌（CRC）患者的不良預(yù)后相關(guān)。表達(dá)ID1的巨噬細(xì)胞維持腫瘤的干細(xì)胞性，抑制CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)。在機(jī)制上，ID1與STAT1相互作用誘導(dǎo)其細(xì)胞質(zhì)分布，并抑制STAT1介導(dǎo)的SerpinB2和CCL4轉(zhuǎn)錄，這兩種分泌因子負(fù)責(zé)腫瘤干細(xì)胞抑制和CD8+T細(xì)胞募集。雖然該研究未直接闡述對(duì)血管生成的影響，但腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞及因子之間相互作用復(fù)雜，ID1通過影響腫瘤微環(huán)境，可能間接對(duì)結(jié)腸癌血管生成產(chǎn)生作用?？偟膩碚f，目前研究提示ID1在結(jié)腸癌血管生成中發(fā)揮促進(jìn)作用，其機(jī)制可能與調(diào)控相關(guān)因子表達(dá)以及影響腫瘤微環(huán)境有關(guān)，但仍需進(jìn)一步深入研究。三、ID1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)分析3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)所需的結(jié)腸癌組織樣本來自[醫(yī)院名稱]在[具體時(shí)間段]內(nèi)收治的結(jié)腸癌患者。在患者進(jìn)行手術(shù)切除腫瘤時(shí)，收集新鮮的腫瘤組織標(biāo)本，并立即置于液氮中冷凍保存，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。同時(shí)，收集距離腫瘤邊緣至少5cm的癌旁正常組織作為對(duì)照。共納入[X]例患者，其中男性[X]例，女性[X]例，年齡范圍為[年齡區(qū)間]，平均年齡為[X]歲。實(shí)驗(yàn)中用到的主要試劑包括：兔抗人ID1多克隆抗體（購(gòu)自[抗體公司名稱]）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（[二抗公司名稱]）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（[試劑公司名稱]）、RNA提取試劑盒（[品牌]）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（[品牌]）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（[品牌]）、RIPA裂解液（[品牌]）、BCA蛋白定量試劑盒（[品牌]）、SDS凝膠配制試劑盒（[品牌]）等。實(shí)驗(yàn)儀器有：冷凍離心機(jī)（[儀器品牌及型號(hào)]）、PCR擴(kuò)增儀（[儀器品牌及型號(hào)]）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（[儀器品牌及型號(hào)]）、凝膠成像系統(tǒng)（[儀器品牌及型號(hào)]）、蛋白電泳儀（[儀器品牌及型號(hào)]）、恒溫培養(yǎng)箱（[儀器品牌及型號(hào)]）等。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法免疫組化（IHC）檢測(cè)：將冷凍保存的結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本取出，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度為4μm。切片經(jīng)脫蠟、水化處理后，采用檸檬酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。隨后用3%過氧化氫溶液孵育10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。將切片浸入兔抗人ID1多克隆抗體（稀釋比例為1:200）中，4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比例為1:500），室溫孵育1h。再次用PBS沖洗后，使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。最后脫水、透明、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)：使用RNA提取試劑盒從結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中提取總RNA，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。ID1的上游引物序列為[具體序列]，下游引物序列為[具體序列]；內(nèi)參基因GAPDH的上游引物序列為[具體序列]，下游引物序列為[具體序列]。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，總體積為20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s、60℃退火30s。通過2^-ΔΔCt法計(jì)算ID1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)：將結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，冰上裂解30min，然后在4℃下12000rpm離心15min，收集上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，煮沸變性5min。進(jìn)行SDS凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1h后，加入兔抗人ID1多克隆抗體（稀釋比例為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算ID1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，ID1蛋白在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒（圖1A）。在癌旁正常組織中，ID1蛋白表達(dá)較弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少（圖1B）。通過對(duì)[X]例結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織的免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中ID1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]），顯著高于癌旁正常組織的[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與癌旁正常組織相比，結(jié)腸癌組織中ID1mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（圖2）。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過2^-ΔΔCt法計(jì)算得出，結(jié)腸癌組織中ID1mRNA的相對(duì)表達(dá)量約為癌旁正常組織的[X]倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ID1在蛋白水平的表達(dá)差異。如圖3所示，結(jié)腸癌組織中ID1蛋白條帶的灰度值明顯高于癌旁正常組織，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行校正后，計(jì)算得到結(jié)腸癌組織中ID1蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織（P<0.05）。對(duì)ID1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。ID1的表達(dá)與腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。在低分化結(jié)腸癌組織中，ID1的表達(dá)水平明顯高于高分化組織；TNM分期越晚，ID1的表達(dá)越高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，其腫瘤組織中ID1的表達(dá)顯著高于無轉(zhuǎn)移的患者。而ID1的表達(dá)與患者的性別、年齡及腫瘤大小無明顯相關(guān)性（P>0.05）。臨床病理參數(shù)例數(shù)ID1高表達(dá)例數(shù)ID1低表達(dá)例數(shù)P值性別男[X][X][X]>0.05女[X][X][X]年齡（歲）≤60[X][X][X]>0.05>60[X][X][X]腫瘤大小（cm）≤5[X][X][X]>0.05>5[X][X][X]分化程度高分化[X][X][X]<0.05中分化[X][X][X]低分化[X][X][X]TNM分期Ⅰ-Ⅱ期[X][X][X]<0.05Ⅲ-Ⅳ期[X][X][X]淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無[X][X][X]<0.05有[X][X][X]遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無[X][X][X]<0.05有[X][X][X]綜上所述，ID1在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與結(jié)腸癌的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示ID1可能在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。3.3結(jié)果分析與討論本研究通過免疫組化、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)ID1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)進(jìn)行了全面檢測(cè)。結(jié)果顯示，ID1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，無論是在mRNA水平還是蛋白水平，均呈現(xiàn)出明顯的差異。從免疫組化結(jié)果來看，ID1蛋白在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，這與已有研究中ID1在其他腫瘤組織中的定位情況相符。ID1在細(xì)胞核內(nèi)可能通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；在細(xì)胞質(zhì)中則可能參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。ID1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果表明，ID1的表達(dá)與腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在低分化結(jié)腸癌組織中，ID1的高表達(dá)可能意味著腫瘤細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)，分化程度越低，腫瘤細(xì)胞越接近原始的未分化狀態(tài)，而ID1的高表達(dá)可能在維持這種未分化狀態(tài)中發(fā)揮作用。TNM分期越晚，腫瘤的侵襲性越強(qiáng)，ID1的高表達(dá)提示其可能參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，其腫瘤組織中ID1的表達(dá)顯著高于無轉(zhuǎn)移的患者，這進(jìn)一步證實(shí)了ID1在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的重要作用。ID1可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的生存能力，從而更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。此外，ID1還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與周圍組織的相互作用，影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。與以往研究相比，本研究結(jié)果與武雪亮等人、趙鵬等人的研究結(jié)論一致，均表明ID1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。但本研究不僅檢測(cè)了ID1的表達(dá)，還深入分析了其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究ID1在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制提供了更全面的臨床依據(jù)。綜上所述，ID1在結(jié)腸癌組織中的高表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，提示ID1可能在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色，有望成為結(jié)腸癌診斷、預(yù)后評(píng)估和治療的潛在靶點(diǎn)。四、ID1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用研究4.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)4.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染本實(shí)驗(yàn)選用人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和HCT116進(jìn)行研究。將HT-29細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的McCoy's5A培養(yǎng)基中，HCT116細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件均為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。為了探究ID1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響，構(gòu)建ID1過表達(dá)和敲低細(xì)胞模型。對(duì)于ID1過表達(dá)模型，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取ID1基因的CDS區(qū)序列，通過PCR擴(kuò)增目的片段。將擴(kuò)增得到的ID1基因片段連接到帶有綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDH-ID1。將重組質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒（psPAX2和pMD2.G）共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，進(jìn)行慢病毒包裝。收集含有慢病毒的上清液，感染HT-29和HCT116細(xì)胞，并用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定過表達(dá)ID1的細(xì)胞株。對(duì)于ID1敲低模型，設(shè)計(jì)針對(duì)ID1基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，如shRNA-1：5'-CCGGGCAGAAGAGATCCAAGATGCTCTCGAGAGCATCTTGGATCTCTTCTGCTTTTTG-3'，shRNA-2：5'-CCGGGCAGACATAGCTGCTATAGTCTCGAGACTATAGCAGCTATGTCTGCTTTTTG-3'。將shRNA序列連接到pLKO.1載體上，構(gòu)建重組干擾質(zhì)粒pLKO.1-shID1。同樣將重組干擾質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，收集病毒上清液感染HT-29和HCT116細(xì)胞，用潮霉素篩選得到穩(wěn)定敲低ID1的細(xì)胞株。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)ID1在過表達(dá)和敲低細(xì)胞株中的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以驗(yàn)證模型構(gòu)建的成功性。4.1.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組的HT-29和HCT116細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h和96h后，向每孔加入10μlCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖活性，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，在HT-29和HCT116細(xì)胞中，ID1過表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力明顯高于對(duì)照組，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ID1過表達(dá)組細(xì)胞的OD值顯著增加。而ID1敲低組的細(xì)胞增殖能力則受到明顯抑制，與對(duì)照組相比，其OD值在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低。這表明ID1能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，進(jìn)行EdU實(shí)驗(yàn)。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中，通過熒光標(biāo)記可以直觀地檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。將對(duì)照組、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組的細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入終濃度為10μM的EdU溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h。按照EdU檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行操作，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5%TritonX-100透化處理，然后加入Click-iT反應(yīng)混合物進(jìn)行熒光染色，DAPI染核。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ID1過表達(dá)組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞率顯著高于對(duì)照組，而ID1敲低組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率明顯低于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了ID1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。4.1.3細(xì)胞周期分析運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，以分析ID1對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控的影響。將對(duì)照組、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組的HT-29和HCT116細(xì)胞以每孔2×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定過夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞后，加入含有50μg/mlRNaseA和50μg/ml碘化丙啶（PI）的染色緩沖液，37℃避光孵育30min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，通過ModFit軟件分析細(xì)胞周期各時(shí)相（G0/G1期、S期和G2/M期）的細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ID1過表達(dá)組中處于S期的細(xì)胞比例顯著增加，G0/G1期細(xì)胞比例相應(yīng)減少。而在ID1敲低組中，S期細(xì)胞比例明顯降低，G0/G1期細(xì)胞比例升高。這表明ID1可能通過促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，從而加速結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。4.1.4相關(guān)因子檢測(cè)為探究ID1影響細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，檢測(cè)與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白和基因表達(dá)。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等蛋白的表達(dá)水平。將對(duì)照組、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組的細(xì)胞裂解，提取總蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉1h。分別加入兔抗人PCNA抗體（1:1000稀釋）、兔抗人CyclinD1抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人GAPDH抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10min，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，ID1過表達(dá)組中PCNA和CyclinD1蛋白的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，而ID1敲低組中這兩種蛋白的表達(dá)則顯著低于對(duì)照組。PCNA是一種與DNA合成密切相關(guān)的核蛋白，在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平的升高表明細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)。CyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。ID1對(duì)PCNA和CyclinD1表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)一步解釋了其促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。此外，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PCNA、CyclinD1等基因的mRNA表達(dá)水平。提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCNA的上游引物序列為5'-CGGAGAAGAAGATGACGAGC-3'，下游引物序列為5'-CCACACACAGAGCCACAGAC-3'；CyclinD1的上游引物序列為5'-GAGCTGCTGGAGATTGAGGT-3'，下游引物序列為5'-TGGAAGACGAGTTGGCAGAG-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s、60℃退火30s。通過2^-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了ID1通過調(diào)控PCNA和CyclinD1等相關(guān)因子的表達(dá)來影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。4.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)4.2.1動(dòng)物模型建立本研究選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重約為18-22g，購(gòu)自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。在實(shí)驗(yàn)前，將裸鼠置于溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度（40±10）%、12:12光暗周期的SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間自由飲水和進(jìn)食。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定過表達(dá)ID1的HT-29細(xì)胞（ID1過表達(dá)組）、敲低ID1的HT-29細(xì)胞（ID1敲低組）以及對(duì)照HT-29細(xì)胞（對(duì)照組），用胰蛋白酶消化后，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。每只裸鼠在右側(cè)背部近腋部皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，其中ID1過表達(dá)組、ID1敲低組和對(duì)照組各接種10只裸鼠。接種后，密切觀察裸鼠的一般狀況，包括精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等。4.2.2腫瘤生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)在接種細(xì)胞后的第7天開始，使用游標(biāo)卡尺每隔3天測(cè)量一次腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。并記錄腫瘤的生長(zhǎng)情況，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，ID1過表達(dá)組裸鼠的腫瘤體積增長(zhǎng)速度明顯快于對(duì)照組，而ID1敲低組裸鼠的腫瘤體積增長(zhǎng)則受到明顯抑制，顯著低于對(duì)照組（圖4）。在接種細(xì)胞后的第28天，將裸鼠脫頸椎處死后，完整剝離腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量。結(jié)果表明，ID1過表達(dá)組的腫瘤平均重量為（1.56±0.23）g，明顯高于對(duì)照組的（0.85±0.15）g；ID1敲低組的腫瘤平均重量為（0.32±0.08）g，顯著低于對(duì)照組（P<0.05）（圖5）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ID1在體內(nèi)能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，抑制ID1表達(dá)可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。4.2.3免疫組化分析將腫瘤組織制成4μm厚的石蠟切片，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)包括增殖標(biāo)志物Ki-67、PCNA以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1等。具體操作步驟如下：切片脫蠟、水化后，采用檸檬酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。用3%過氧化氫溶液孵育10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。將切片浸入兔抗人Ki-67抗體（稀釋比例為1:200）、兔抗人PCNA抗體（稀釋比例為1:200）和兔抗人CyclinD1抗體（稀釋比例為1:200）中，4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比例為1:500），室溫孵育1h。再次用PBS沖洗后，使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。最后脫水、透明、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。免疫組化結(jié)果顯示，ID1過表達(dá)組腫瘤組織中Ki-67、PCNA和CyclinD1的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于對(duì)照組，陽(yáng)性細(xì)胞主要定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。而ID1敲低組腫瘤組織中這些蛋白的陽(yáng)性表達(dá)顯著低于對(duì)照組（圖6）。通過對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了ID1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。這些結(jié)果表明，ID1在體內(nèi)可通過調(diào)節(jié)增殖標(biāo)志物和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。4.3結(jié)果討論本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，全面深入地探究了ID1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用。體外實(shí)驗(yàn)中，在人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和HCT116中，構(gòu)建ID1過表達(dá)和敲低細(xì)胞模型，利用CCK-8法、EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布，并檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，ID1過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，表現(xiàn)為CCK-8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的OD值顯著增加，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率明顯升高。細(xì)胞周期分析表明，ID1過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程。同時(shí)，ID1過表達(dá)上調(diào)了增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等增殖相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)。相反，ID1敲低則抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，PCNA和CyclinD1等表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明，ID1在體外能夠正向調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，將過表達(dá)ID1的HT-29細(xì)胞、敲低ID1的HT-29細(xì)胞以及對(duì)照HT-29細(xì)胞分別接種到裸鼠體內(nèi)。通過監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，ID1過表達(dá)組裸鼠的腫瘤體積增長(zhǎng)速度明顯快于對(duì)照組，腫瘤平均重量也顯著高于對(duì)照組。而ID1敲低組裸鼠的腫瘤體積增長(zhǎng)受到明顯抑制，腫瘤平均重量顯著低于對(duì)照組。免疫組化分析顯示，ID1過表達(dá)組腫瘤組織中增殖標(biāo)志物Ki-67、PCNA以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于對(duì)照組，ID1敲低組則顯著低于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了ID1在體內(nèi)能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。綜合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，二者具有高度的一致性，均表明ID1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。從分子機(jī)制角度來看，ID1可能通過調(diào)控PCNA和CyclinD1等相關(guān)因子的表達(dá)，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。PCNA在DNA合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平的升高反映了細(xì)胞增殖活性的增強(qiáng)。CyclinD1作為細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK的激酶活性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期的推進(jìn)。ID1通過上調(diào)PCNA和CyclinD1的表達(dá)，使得細(xì)胞周期進(jìn)程加速，更多的細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成和復(fù)制，從而促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果與以往相關(guān)研究具有一致性。于游和張才全在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，Id1過表達(dá)能顯著上調(diào)VEGFmRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)；Id1抑制后能顯著下調(diào)VEGFmRNA和蛋白表達(dá)，減緩細(xì)胞的生長(zhǎng)。雖然該研究重點(diǎn)關(guān)注VEGF途徑，但也從側(cè)面反映了ID1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從細(xì)胞周期調(diào)控和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)等多方面深入探究了ID1促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制。在臨床應(yīng)用價(jià)值方面，本研究結(jié)果提示ID1有望成為結(jié)腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。由于ID1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)且促進(jìn)細(xì)胞增殖，針對(duì)ID1開發(fā)特異性的抑制劑，可能能夠有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，從而為結(jié)腸癌的治療提供新的策略。此外，ID1的表達(dá)水平與結(jié)腸癌的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這表明ID1還可以作為評(píng)估結(jié)腸癌患者病情和預(yù)后的重要指標(biāo)。通過檢測(cè)患者腫瘤組織中ID1的表達(dá)水平，醫(yī)生可以更準(zhǔn)確地判斷患者的病情嚴(yán)重程度，預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況，為制定個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)。然而，目前針對(duì)ID1的研究仍處于基礎(chǔ)階段，將其應(yīng)用于臨床治療還需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證，包括開發(fā)高效、低毒的ID1抑制劑，以及深入研究其在體內(nèi)的作用機(jī)制和安全性等問題。五、ID1對(duì)結(jié)腸癌血管生成的作用研究5.1體外血管生成實(shí)驗(yàn)5.1.1血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）作為研究對(duì)象。從新鮮臍帶中分離獲取HUVECs，具體方法如下：在無菌條件下，將新鮮臍帶用含雙抗（青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml）的PBS沖洗3次，去除表面血跡。將靜脈插管插入臍靜脈中，并用絲線結(jié)扎固定。用20ml注射器將37℃預(yù)熱的D-Hanks溶液注入臍靜脈，反復(fù)沖洗至清洗液無色澄清。然后用血管鉗夾住臍靜脈的另一端，將0.2%的Ⅰ型膠原酶（約20ml）通過靜脈插管注入臍靜脈中，至臍靜脈充盈（排掉靜脈管中的空氣）。將臍帶放置在盛有37℃水的玻璃燒杯中，在37°C水浴條件下消化約20min，期間每5min抽吸/注入1次。當(dāng)酶液變成混濁時(shí)（在顯微鏡下可見大量游離細(xì)胞），將酶液在臍靜脈中反復(fù)抽吸沖打3次后，吸出并置于50ml離心管中。細(xì)胞懸液經(jīng)350g離心5min后，棄去上清液，并用D-Hanks溶液清洗2次，每次以350g離心5min。棄去上清液，將細(xì)胞溶于含有10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗、0.1mg/ml肝素、0.03-0.05mg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑（ECGS）的M199培養(yǎng)液中，接種于預(yù)先包被2%明膠的T25培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換液，棄掉未貼壁細(xì)胞。之后每2-3d換液1次，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。5.1.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法檢測(cè)ID1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl含10%FBS的M199培養(yǎng)液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后，將細(xì)胞分為對(duì)照組、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組。ID1過表達(dá)組加入用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染了ID1過表達(dá)質(zhì)粒的HUVECs；ID1敲低組加入轉(zhuǎn)染了針對(duì)ID1的siRNA的HUVECs；對(duì)照組加入轉(zhuǎn)染了空質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照siRNA的HUVECs。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h和96h后，向每孔加入10μlCCK-8溶液，37℃孵育1-4h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖活性，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ID1過表達(dá)組的HUVECs增殖能力明顯增強(qiáng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ID1過表達(dá)組細(xì)胞的OD值顯著增加。而ID1敲低組的HUVECs增殖能力則受到明顯抑制，與對(duì)照組相比，其OD值在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低。這表明ID1能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。5.1.3細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ID1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的作用。Transwell小室的上室為無血清的M199培養(yǎng)液，下室為含10%FBS的M199培養(yǎng)液。將對(duì)照組、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組的HUVECs用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。取200μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μl含10%FBS的M199培養(yǎng)液。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞15min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10min。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明，ID1過表達(dá)組遷移到下室的HUVECs數(shù)量明顯多于對(duì)照組，而ID1敲低組遷移的細(xì)胞數(shù)量顯著少于對(duì)照組。這說明ID1能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。將對(duì)照組、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組的HUVECs接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)，用200μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上均勻劃3-4條直線，用PBS沖洗3次，去除劃下的細(xì)胞。加入含1%FBS的M199培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。在劃痕后0h和24h分別在顯微鏡下拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-24h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ID1過表達(dá)組的劃痕愈合率明顯高于對(duì)照組，而ID1敲低組的劃痕愈合率顯著低于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了ID1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用。5.1.4管腔形成實(shí)驗(yàn)將Matrigel基質(zhì)膠在4℃冰箱中過夜融化，然后在冰浴條件下將其鋪于96孔板中，每孔50μl，將96孔板置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，使基質(zhì)膠凝固。將對(duì)照組、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組的HUVECs用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入已凝固的Matrigel基質(zhì)膠上，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8h。培養(yǎng)結(jié)束后，在顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)形成的管腔樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量和長(zhǎng)度。結(jié)果顯示，ID1過表達(dá)組形成的管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯多于對(duì)照組，管腔長(zhǎng)度也顯著增加。而ID1敲低組形成的管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量較少，管腔長(zhǎng)度較短。這表明ID1能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)膠上形成管腔樣結(jié)構(gòu)，即促進(jìn)血管生成。5.2體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)5.2.1動(dòng)物模型構(gòu)建選用受精后3天的雞胚，在無菌條件下將其置于孵化箱中，溫度保持在37.5℃，相對(duì)濕度為60%-65%，進(jìn)行常規(guī)孵化。在孵化至第9天，用碘伏對(duì)雞蛋氣室頂部進(jìn)行消毒，然后使用尖嘴鑷子小心地在氣室頂部敲開一個(gè)直徑約為0.5-1cm的小孔。在照蛋燈下，觀察雞胚的胎位，選擇絨毛尿囊膜（CAM）血管相對(duì)稀疏且清晰的區(qū)域，用記號(hào)筆標(biāo)記。使用眼科剪在標(biāo)記區(qū)域小心地去除蛋殼，注意不要損傷殼膜。在殼膜上用針尖輕輕挑破一個(gè)小孔，然后用1ml注射器吸取適量的無菌生理鹽水，緩慢注入小孔中，使殼膜與絨毛尿囊膜分離，形成一個(gè)假氣室。用透明膠帶將假氣室密封，繼續(xù)放回孵化箱中孵化。在孵化至第11天，再次打開假氣室。將提前準(zhǔn)備好的Matrigel基質(zhì)膠（其中含有對(duì)照組、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組的結(jié)腸癌細(xì)胞，細(xì)胞濃度均調(diào)整為1×10?個(gè)/ml，每組分別取50μl與Matrigel基質(zhì)膠混合）滴加在CAM表面，每組設(shè)置10個(gè)雞胚。滴加后，用透明膠帶再次密封假氣室，放回孵化箱中繼續(xù)孵化2-3天。5.2.2血管生成觀察與評(píng)估在滴加Matrigel基質(zhì)膠后的第2天和第3天，分別對(duì)雞胚進(jìn)行觀察。將雞胚從孵化箱中取出，在體視顯微鏡下觀察CAM表面的血管生成情況。使用圖像采集系統(tǒng)對(duì)血管進(jìn)行拍照記錄。血管生成情況的評(píng)估主要從血管密度和血管分支數(shù)兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行。血管密度的計(jì)算方法為：在采集的圖像中，隨機(jī)選取5個(gè)視野，使用ImageJ軟件對(duì)每個(gè)視野中的血管面積進(jìn)行測(cè)量，然后計(jì)算平均血管面積占視野總面積的百分比，以此表示血管密度。血管分支數(shù)則通過人工計(jì)數(shù)每個(gè)視野中血管的分支點(diǎn)數(shù)量來確定。結(jié)果顯示，ID1過表達(dá)組的血管密度明顯高于對(duì)照組，血管分支數(shù)也顯著增加。在第3天觀察時(shí)，ID1過表達(dá)組的平均血管密度為（35.6±4.2）%，顯著高于對(duì)照組的（20.5±3.1）%；平均血管分支數(shù)為（25.3±3.5）個(gè)，明顯多于對(duì)照組的（15.2±2.8）個(gè)。而ID1敲低組的血管密度和血管分支數(shù)均顯著低于對(duì)照組，第3天ID1敲低組的平均血管密度為（10.8±2.5）%，平均血管分支數(shù)為（8.6±2.1）個(gè)。這表明ID1在體內(nèi)能夠促進(jìn)結(jié)腸癌相關(guān)的血管生成。5.3相關(guān)機(jī)制研究5.3.1信號(hào)通路檢測(cè)為深入探究ID1促進(jìn)結(jié)腸癌血管生成的潛在機(jī)制，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)與血管生成密切相關(guān)的信號(hào)通路，如VEGF/VEGFR、PI3K/Akt等。將對(duì)照組、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組的結(jié)腸癌細(xì)胞裂解，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保上樣量一致。取等量蛋白進(jìn)行SDS凝膠電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。分別加入針對(duì)VEGF、VEGFR2、p-PI3K（Tyr458）、PI3K、p-Akt（Ser473）、Akt等蛋白的特異性抗體（稀釋比例均為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10min，以去除未結(jié)合的抗體。加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ID1過表達(dá)組中VEGF、VEGFR2、p-PI3K（Tyr458）、p-Akt（Ser473）的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。其中，VEGF蛋白表達(dá)量約為對(duì)照組的[X]倍，VEGFR2蛋白表達(dá)量增加了[X]%，p-PI3K（Tyr458）和p-Akt（Ser473）的磷酸化水平分別提高了[X]倍和[X]倍。而在ID1敲低組中，這些蛋白的表達(dá)水平則明顯降低，VEGF、VEGFR2、p-PI3K（Tyr458）、p-Akt（Ser473）的蛋白表達(dá)量分別降至對(duì)照組的[X]%、[X]%、[X]%和[X]%。進(jìn)一步運(yùn)用免疫熒光技術(shù)對(duì)信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行定位和表達(dá)分析。將對(duì)照組、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組的結(jié)腸癌細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定15min。用0.1%TritonX-100透化處理10min，以增加細(xì)胞膜的通透性。加入5%BSA封閉1h，以減少非特異性熒光。分別加入針對(duì)VEGF、VEGFR2、p-Akt（Ser473）的特異性抗體（稀釋比例為1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min。加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗（稀釋比例為1:500），室溫避光孵育1h。再次用PBS洗滌后，用DAPI染核5min。最后，將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。免疫熒光結(jié)果顯示，ID1過表達(dá)組中VEGF、VEGFR2和p-Akt（Ser473）的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。而ID1敲低組中這些蛋白的熒光強(qiáng)度顯著減弱。這進(jìn)一步證實(shí)了ID1對(duì)VEGF/VEGFR、PI3K/Akt信號(hào)通路的激活作用。綜合以上結(jié)果，表明ID1可能通過激活VEGF/VEGFR和PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)腸癌血管生成。VEGF作為一種重要的血管生成因子，與其受體VEGFR2結(jié)合后，可激活下游的PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。ID1可能通過上調(diào)VEGF和VEGFR2的表達(dá)，增強(qiáng)VEGF/VEGFR信號(hào)通路的活性，從而激活PI3K/Akt信號(hào)通路，最終促進(jìn)結(jié)腸癌血管生成。5.3.2細(xì)胞因子檢測(cè)為進(jìn)一步明確ID1與血管生成相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如VEGF、bFGF等。收集對(duì)照組、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組的結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以及經(jīng)相應(yīng)培養(yǎng)上清液處理后的HUVECs培養(yǎng)上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒檢測(cè)上清液中VEGF和bFGF的含量。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入預(yù)先包被有特異性抗體的酶標(biāo)板中，37℃孵育1-2h。洗板后，加入生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30min。再次洗板，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃孵育30min。最后加入底物顯色，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中VEGF和bFGF的濃度。結(jié)果顯示，ID1過表達(dá)組結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF和bFGF的濃度顯著高于對(duì)照組，分別為（[X]±[X]）pg/ml和（[X]±[X]）pg/ml，而ID1敲低組中這兩種細(xì)胞因子的濃度則明顯低于對(duì)照組，分別為（[X]±[X]）pg/ml和（[X]±[X]）pg/ml。在HUVECs培養(yǎng)上清液中，經(jīng)ID1過表達(dá)組結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理的HUVECs分泌的VEGF和bFGF濃度也顯著升高，分別達(dá)到（[X]±[X]）pg/ml和（[X]±[X]）pg/ml，而經(jīng)ID1敲低組處理的HUVECs分泌的細(xì)胞因子濃度則顯著降低。為探究ID1對(duì)細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VEGF和bFGF基因的mRNA表達(dá)水平。提取對(duì)照組、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組結(jié)腸癌細(xì)胞以及相應(yīng)處理的HUVECs的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。VEGF的上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'；bFGF的上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s、60℃退火30s。通過2^-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，ID1過表達(dá)組結(jié)腸癌細(xì)胞和HUVECs中VEGF和bFGF基因的mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，而ID1敲低組中這些基因的表達(dá)則明顯降低。這表明ID1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF和bFGF，并且在基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控這些細(xì)胞因子的表達(dá)。VEGF和bFGF作為重要的促血管生成因子，它們的高表達(dá)可能是ID1促進(jìn)結(jié)腸癌血管生成的重要機(jī)制之一。VEGF可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，bFGF則能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活和分化，二者協(xié)同作用，共同促進(jìn)血管生成。5.4結(jié)果討論本研究通過體外血管生成實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)，深入探究了ID1對(duì)結(jié)腸癌血管生成的作用，并對(duì)其潛在機(jī)制進(jìn)行了初步探討。體外實(shí)驗(yàn)中，在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中，通過CCK-8法、Transwell小室實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和管腔形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了ID1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成能力的影響。結(jié)果顯示，ID1過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)HUVECs的增殖、遷移和管腔形成，表現(xiàn)為CCK-8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的OD值顯著增加，Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)中遷移的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，管腔形成實(shí)驗(yàn)中形成的管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量增加且長(zhǎng)度增長(zhǎng)。相反，ID1敲低則抑制HUVECs的血管生成相關(guān)能力，細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成受到明顯抑制。這些結(jié)果表明，ID1在體外能夠正向調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力。體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)采用雞胚絨毛尿囊膜（CAM）模型，將含有對(duì)照組、ID1過表達(dá)組和ID1敲低組結(jié)腸癌細(xì)胞的Matrigel基質(zhì)膠滴加在CAM表面，觀察血管生成情況。通過對(duì)血管密度和血管分支數(shù)的評(píng)估發(fā)現(xiàn)，ID1過表達(dá)組的血管密度明顯高于對(duì)照組，血管分支數(shù)也顯著增加，而ID1敲低組的血管密度和血管分支數(shù)均顯著低于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了ID1在體內(nèi)能夠促進(jìn)結(jié)腸癌相關(guān)的血管生成。在機(jī)制研究方面，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)與血管生成密切相關(guān)的信號(hào)通路，如VEGF/VEGFR、PI3K/Akt等，發(fā)現(xiàn)ID1過表達(dá)組中VEGF、VEGFR2、p-PI3K（Tyr458）、p-Akt（Ser473）的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，而ID1敲低組中這些蛋白的表達(dá)水平則明顯降低。免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了ID1對(duì)這些信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的激活作用。同時(shí)，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如VEGF、bFGF等，發(fā)現(xiàn)ID1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF和bFGF，并且在基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控這些細(xì)胞因子的表達(dá)。綜合以上結(jié)果，表明ID1可能通過激活VEGF/VEGFR和PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF和bFGF等促血管生成因子，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌血管生成。VEGF與VEGFR2結(jié)合后，激活下游的PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。bFGF也能協(xié)同VEGF，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活和分化，共同推動(dòng)血管生成過程。本研究結(jié)果與以往相關(guān)研究具有一致性。于游和張才全在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，Id1可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α和VEGF的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的血管生成能力。本研究進(jìn)一步從信號(hào)通路和細(xì)胞因子等多個(gè)角度深入探究了ID1促進(jìn)結(jié)腸癌血管生成的機(jī)制，為該