Oct-4：胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞研究的關(guān)鍵鑰匙與新曙光

Oct-4：胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞研究的關(guān)鍵鑰匙與新曙光一、引言1.1研究背景1.1.1胰腺癌的嚴(yán)峻現(xiàn)狀胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率和死亡率近年來呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，2020年全球胰腺癌新發(fā)病例約49.6萬，死亡病例約46.6萬，發(fā)病率與死亡率幾乎持平。在中國，胰腺癌同樣形勢(shì)嚴(yán)峻，2016年新發(fā)病例約9.5萬，死亡病例約8.5萬，且城市地區(qū)的發(fā)病率和死亡率高于農(nóng)村地區(qū)。由于胰腺癌早期癥狀隱匿，缺乏有效的早期診斷手段，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，失去手術(shù)根治機(jī)會(huì)。手術(shù)切除是目前唯一可能治愈胰腺癌的方法，但僅15%-20%的患者在確診時(shí)可行手術(shù)切除，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高。化療和放療對(duì)胰腺癌的療效有限，胰腺癌對(duì)傳統(tǒng)化療藥物如吉西他濱、5-氟尿嘧啶等存在明顯的耐藥性，使得化療效果不佳，患者中位生存期僅6-10個(gè)月，5年生存率低于7%，被稱為“癌中之王”。面對(duì)如此嚴(yán)峻的治療困境，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略，提高胰腺癌的治療效果，成為當(dāng)前亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。1.1.2腫瘤干細(xì)胞理論的興起腫瘤干細(xì)胞（TumorStemCells，TSCs）理論的提出為腫瘤研究帶來了新的視角。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化潛能的一小部分細(xì)胞亞群，它們?cè)谀[瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵作用。與普通腫瘤細(xì)胞相比，腫瘤干細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。它們能通過自我更新維持腫瘤細(xì)胞群體的穩(wěn)定，不斷產(chǎn)生新的腫瘤細(xì)胞；同時(shí)具備多向分化能力，可分化為構(gòu)成腫瘤組織的各種不同類型細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞還具有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)和遷徙能力，這使得腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移成為可能。而且，腫瘤干細(xì)胞可以長時(shí)間處于休眠狀態(tài)，并表達(dá)多種耐藥分子，對(duì)化療、放療等傳統(tǒng)治療手段具有很強(qiáng)的耐受性，這也是腫瘤治療后復(fù)發(fā)的重要原因。例如，在白血病研究中發(fā)現(xiàn)，占總數(shù)0.2%-1%的白血病干細(xì)胞具備穩(wěn)定持續(xù)形成腫瘤克隆的能力；在乳腺癌中，分離出的乳腺癌干細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)，可以生成原來腫瘤的所有細(xì)胞類型。腫瘤干細(xì)胞理論的發(fā)展，為深入理解腫瘤的發(fā)病機(jī)制提供了新的方向，也為腫瘤治療提供了潛在的靶點(diǎn)，有望通過特異性靶向腫瘤干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)更有效的腫瘤治療，克服傳統(tǒng)治療的局限性。1.2Oct-4的研究現(xiàn)狀Oct-4（Octamer-bindingtranscriptionfactor4），又稱Oct3、POU5F1等，是POU轉(zhuǎn)錄因子家族第Ⅴ亞家族成員，由Pou5f1基因編碼。Oct-4在胚胎干細(xì)胞中扮演著核心角色，是維持胚胎干細(xì)胞多潛能性和自我更新的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在早期胚胎發(fā)育過程中，Oct-4特異性表達(dá)于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，它通過與靶基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)的八聚體元件（ATGCAAAT）結(jié)合，調(diào)控一系列與胚胎發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，如FGF4、UTF1、ZFP206等，對(duì)維持胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和多向分化潛能至關(guān)重要。研究表明，當(dāng)Oct-4表達(dá)缺失或降低時(shí)，胚胎干細(xì)胞會(huì)失去多能性，向滋養(yǎng)層細(xì)胞分化；而Oct-4過表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞過度增殖并抑制其分化。此外，Oct-4也是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）產(chǎn)生的關(guān)鍵因子之一，在體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞的過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。在腫瘤研究領(lǐng)域，Oct-4的異常表達(dá)逐漸受到關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明，Oct-4在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中異常高表達(dá)，如乳腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌等，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移能力及預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌中，Oct-4高表達(dá)的患者往往預(yù)后較差，腫瘤更容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。Oct-4被認(rèn)為可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，其機(jī)制可能與腫瘤干細(xì)胞的維持和腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有關(guān)。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤組織中存在一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，它們能夠自我更新和多向分化，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)的根源。Oct-4在腫瘤干細(xì)胞中的高表達(dá)，可能有助于維持腫瘤干細(xì)胞的干性，使其具備更強(qiáng)的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥能力。在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，Oct-4陽性的肺癌細(xì)胞表現(xiàn)出典型的腫瘤干細(xì)胞特征，具有更高的克隆形成能力和耐藥性。在胰腺癌研究中，Oct-4的研究也取得了一定進(jìn)展。已有研究證實(shí)，Oct-4在胰腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，且與胰腺癌的惡性生物學(xué)行為相關(guān)。通過流式細(xì)胞術(shù)分選胰腺癌Panc-1細(xì)胞系中的腫瘤干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Oct-4在腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于普通腫瘤細(xì)胞，提示Oct-4可能作為胰腺癌干細(xì)胞的鑒定標(biāo)志物之一。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默Oct-4基因的表達(dá)可顯著抑制胰腺癌干細(xì)胞的自我更新、增殖和侵襲能力，并增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的敏感性，表明Oct-4在胰腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性維持中發(fā)揮著重要作用。然而，目前關(guān)于Oct-4在胰腺癌中的研究仍處于初步階段，其具體作用機(jī)制尚未完全明確，仍需深入探討，為胰腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究Oct-4作為胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞鑒定標(biāo)志物的可行性，全面解析其在胰腺癌干細(xì)胞中的作用及分子機(jī)制，為胰腺癌的精準(zhǔn)診斷和有效治療提供全新的理論依據(jù)與潛在靶點(diǎn)。目前，胰腺癌的早期診斷極為困難，且對(duì)現(xiàn)有治療手段耐藥嚴(yán)重，患者預(yù)后極差。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法主要針對(duì)大部分普通腫瘤細(xì)胞，然而腫瘤干細(xì)胞的存在往往導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，準(zhǔn)確鑒定和靶向腫瘤干細(xì)胞成為攻克胰腺癌的關(guān)鍵。Oct-4作為一種在胚胎干細(xì)胞中維持多潛能性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤中異常表達(dá)，并且與腫瘤干細(xì)胞特性密切相關(guān)。在胰腺癌研究中，雖已發(fā)現(xiàn)Oct-4在胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中高表達(dá)，但仍缺乏系統(tǒng)深入的研究來確定其作為鑒定標(biāo)志物的可靠性，以及其在胰腺癌干細(xì)胞生物學(xué)行為中的具體作用機(jī)制。明確Oct-4作為胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞鑒定標(biāo)志物，將為胰腺癌的早期診斷提供新的分子指標(biāo)。通過檢測(cè)腫瘤組織或體液中Oct-4的表達(dá)水平，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺癌干細(xì)胞的精準(zhǔn)識(shí)別，提高早期診斷的準(zhǔn)確性，從而有助于早期干預(yù)和治療，改善患者預(yù)后。深入研究Oct-4在胰腺癌干細(xì)胞中的作用及機(jī)制，有助于揭示胰腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的深層次機(jī)制，為開發(fā)針對(duì)胰腺癌干細(xì)胞的靶向治療藥物提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。這可能突破傳統(tǒng)治療的局限，通過特異性抑制Oct-4及其相關(guān)信號(hào)通路，有效清除胰腺癌干細(xì)胞，降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，提高胰腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量。對(duì)Oct-4的研究還可能為胰腺癌的個(gè)性化治療提供指導(dǎo)，根據(jù)患者腫瘤細(xì)胞中Oct-4的表達(dá)情況，制定更加精準(zhǔn)有效的治療方案，實(shí)現(xiàn)真正意義上的精準(zhǔn)醫(yī)療。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞與組織來源胰腺癌組織標(biāo)本來源于[醫(yī)院名稱]20[具體年份1]-20[具體年份2]期間行手術(shù)切除治療的胰腺癌患者，共收集[X]例。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療，且簽署了知情同意書。手術(shù)切除的腫瘤組織立即置于預(yù)冷的無菌PBS中，迅速送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。同時(shí)，獲取同一患者的癌旁正常胰腺組織作為對(duì)照，距離腫瘤邊緣至少[X]cm以上。人胰腺癌細(xì)胞系Panc-1、AsPC-1、BxPC-3購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Gibco公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2-3天傳代一次。當(dāng)細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)中使用的主要試劑包括：兔抗人Oct-4多克隆抗體（Abcam公司）、鼠抗人CD133單克隆抗體（BDBiosciences公司）、鼠抗人CD44單克隆抗體（BDBiosciences公司）、AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG和AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（Invitrogen公司），用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)；TRIzol試劑（Invitrogen公司）用于提取細(xì)胞和組織總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司）用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平；Matrigel基質(zhì)膠（Corning公司）用于細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)和體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)；CCK-8試劑盒（Dojindo公司）用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（BDBiosciences公司）用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；Transwell小室（Corning公司）用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)；蛋白提取試劑盒（Beyotime公司）用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）測(cè)定蛋白濃度；SDS凝膠制備試劑盒和Westernblot化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（Beyotime公司）用于蛋白質(zhì)免疫印跡分析。主要儀器有：流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur，BD公司），用于細(xì)胞表面標(biāo)志物分析和細(xì)胞分選；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI7500，ThermoFisherScientific公司），精確檢測(cè)基因表達(dá)量；熒光顯微鏡（OlympusIX71，Olympus公司），觀察免疫熒光染色結(jié)果；酶標(biāo)儀（BioTekELx800，BioTek公司），測(cè)定CCK-8實(shí)驗(yàn)吸光度值；CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientificForma3111，ThermoFisherScientific公司），提供細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R，Eppendorf公司），用于細(xì)胞和組織樣本的離心處理；電泳儀（Bio-RadPowerPacBasic，Bio-Rad公司）和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-RadTrans-BlotSD，Bio-Rad公司），用于SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon5200，Tanon公司），檢測(cè)Westernblot結(jié)果。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1原代胰腺癌細(xì)胞的提取與培養(yǎng)將手術(shù)切除的新鮮胰腺癌組織標(biāo)本置于無菌培養(yǎng)皿中，用預(yù)冷的含雙抗（100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的PBS沖洗3-5次，以去除血液及其他雜質(zhì)。在無菌條件下，用眼科剪將組織剪成1-2mm3大小的組織塊，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃消化20-30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次，使消化更充分。消化結(jié)束后，加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打，使組織塊分散成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清，再用PBS洗滌細(xì)胞2次，以去除殘留的消化液和雜質(zhì)。將洗滌后的細(xì)胞重懸于含10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先吸去舊培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞1-2次，加入適量消化液，37℃消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。2.2.2腫瘤干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)與鑒定取對(duì)數(shù)生長期的原代胰腺癌細(xì)胞或胰腺癌細(xì)胞系，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2次后，重懸于腫瘤干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（含B27添加劑、表皮生長因子（EGF）20ng/mL、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）20ng/mL等）中。調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL，接種于超低粘附6孔板中，每孔接種2mL細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3-4天觀察細(xì)胞成球情況，并補(bǔ)充適量的無血清培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞球直徑達(dá)到50-100μm時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取細(xì)胞球，用4%多聚甲醛固定15-20分鐘，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為4-5μm。將切片進(jìn)行脫蠟、水化處理后，進(jìn)行HE染色。具體步驟為：蘇木精染色5-10分鐘，自來水沖洗1-2分鐘，1%鹽酸酒精分化3-5秒，自來水沖洗返藍(lán)5-10分鐘，伊紅染色3-5分鐘，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察細(xì)胞球的形態(tài)結(jié)構(gòu)，判斷是否具有腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的特征。取細(xì)胞球，用4%多聚甲醛固定15-20分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。用0.1%TritonX-100通透10-15分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入5%BSA封閉液，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性染色。分別加入兔抗人Oct-4多克隆抗體、鼠抗人CD133單克隆抗體、鼠抗人CD44單克隆抗體（一抗稀釋比例按照抗體說明書進(jìn)行），4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，每次5分鐘，加入AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG和AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（二抗稀釋比例按照抗體說明書進(jìn)行），室溫避光孵育1-2小時(shí)。PBS洗滌3次，每次5分鐘，DAPI染核5-10分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，檢測(cè)Oct-4、CD133、CD44等腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況。2.2.3裸鼠皮下移植瘤模型的建立選取4-6周齡、體重18-22g的BALB/c裸鼠，購自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心名稱]，在SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食、進(jìn)水。將對(duì)數(shù)生長期的原代胰腺癌細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)獲得的細(xì)胞球，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。取適量細(xì)胞懸液與Matrigel基質(zhì)膠按1:1體積比混勻，用1mL注射器吸取細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠的混合液。將裸鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，用75%酒精消毒注射部位（通常選擇腋窩或腹股溝）。將注射器針頭以45°角刺入皮下，緩慢注入細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠的混合液，每只裸鼠注射0.2mL，含1×10?個(gè)細(xì)胞。注射完畢后，用棉球輕輕按壓注射部位，防止液體外滲。將裸鼠放回飼養(yǎng)籠中，密切觀察其蘇醒情況和一般狀態(tài)。接種細(xì)胞后，每隔2-3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-150mm3時(shí)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行后續(xù)處理，如處死裸鼠，取出腫瘤組織進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，包括稱重、固定、石蠟包埋、切片等，用于免疫組化、Westernblot、qRT-PCR等實(shí)驗(yàn)分析。2.2.4基因與蛋白表達(dá)檢測(cè)采用TRIzol試劑提取細(xì)胞或組織總RNA。具體步驟為：將細(xì)胞或組織樣本加入TRIzol試劑中，充分勻漿裂解，室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離。加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘，4℃、12000rpm離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色水相，RNA主要存在于該層。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色RNA沉淀。棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，4℃、7500rpm離心5分鐘，棄上清，室溫晾干RNA沉淀。加入適量DEPC處理水溶解RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。取2μgRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件為：42℃60分鐘，70℃10分鐘。以cDNA為模板，采用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中目的基因和內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列，使用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物序列如下表所示（表1：引物序列表）：基因名稱上游引物（5'-3'）下游引物（5'-3'）Oct-4[具體序列1][具體序列2]GAPDH[具體序列3][具體序列4]反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析，以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。采用2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。將細(xì)胞或組織樣本加入適量的蛋白提取試劑中，冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清至新的離心管中，即為總蛋白提取液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：濃縮膠80V，30分鐘；分離膠120V，90-120分鐘，使蛋白充分分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流300mA，90-120分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。分別加入兔抗人Oct-4多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體（一抗稀釋比例按照抗體說明書進(jìn)行），4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（二抗稀釋比例按照抗體說明書進(jìn)行），室溫孵育1-2小時(shí)。TBST洗滌3次，每次10分鐘，采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光、拍照，分析蛋白表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值，從而比較不同樣本中目的蛋白的表達(dá)差異。2.2.5miRNA芯片分析與驗(yàn)證取Oct-4陽性表達(dá)的胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞和Oct-4陰性表達(dá)的普通胰腺癌細(xì)胞，按照miRNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞中的總miRNA。用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定miRNA濃度和純度，用AgilentBioanalyzer2100檢測(cè)miRNA完整性。將提取的總miRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，具體方法按照AgilentmiRNA芯片雜交試劑盒說明書進(jìn)行。將標(biāo)記好的miRNA與AgilentmiRNA芯片進(jìn)行雜交，雜交條件為：55℃，17小時(shí)。雜交結(jié)束后，用AgilentGenePix4000B芯片掃描儀掃描芯片，獲取熒光信號(hào)數(shù)據(jù)。使用AgilentFeatureExtraction軟件對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出在Oct-4陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA，差異倍數(shù)設(shè)定為≥2或≤0.5，P值＜0.05。根據(jù)miRNA芯片分析結(jié)果，選擇與Oct-4表達(dá)相關(guān)的差異顯著的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。通過生物信息學(xué)軟件（如TargetScan、miRanda等）預(yù)測(cè)該miRNA的靶基因，分析其是否與Oct-4存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)。合成包含miRNA靶位點(diǎn)的Oct-43'UTR野生型（WT）和突變型（MUT）序列，分別克隆至熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-Oct-4-WT和pGL3-Oct-4-MUT。將人正常胰腺上皮細(xì)胞株HPDE6c7接種于24孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，將重組質(zhì)粒與相應(yīng)的miRNAmimics或miRNAinhibitor共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染NCmimics或NCinhibitor）。轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine3000試劑，按照試劑說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，比較不同組之間的熒光素酶活性變化。若miRNAmimics轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著低于陰性對(duì)照組，而miRNAinhibitor轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著高于陰性對(duì)照組，且野生型重組質(zhì)粒組的變化更為明顯，表明該miRNA與Oct-4存在靶向調(diào)控關(guān)系。2.2.6Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)實(shí)驗(yàn)將胰腺癌細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的重組SHH-N（0、10、20、40、80ng/mL）或SHH信號(hào)通路抑制劑cyclopamine（0、5、10、20、40μM），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入等量的PBS）。培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。將胰腺癌細(xì)胞以500個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別加入重組SHH-N（40ng/mL）或cyclopamine（20μM），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入等量的PBS）。培養(yǎng)10-14天后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入4%多聚甲醛固定15-20分鐘。棄去固定液，用結(jié)晶紫染色液染色10-15分鐘，自來水沖洗，晾干。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)，計(jì)算克隆形成率，克隆形成率（%）=（克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot方法檢測(cè)Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)因子（如SHH、PTCH1、SMO、GLI1等）和Oct-4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)方法同2.2.4節(jié)，引物序列和抗體信息根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和試劑說明書選擇。以GAPDH作為內(nèi)參基因，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值，比較不同組之間相關(guān)因子的表達(dá)差異。三、Oct-4作為胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞鑒定標(biāo)志物的驗(yàn)證3.1胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離與表型分析3.1.1細(xì)胞形態(tài)與生長特性觀察在倒置顯微鏡下，原代胰腺癌細(xì)胞呈現(xiàn)出多樣化的形態(tài)，多數(shù)細(xì)胞呈多邊形或梭形，細(xì)胞貼壁生長，相互之間緊密連接，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸融合成單層，融合度可達(dá)85%以上。而通過腫瘤干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)分離得到的胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基中呈懸浮生長，逐漸聚集形成細(xì)胞球。這些細(xì)胞球大小不一，形態(tài)較為規(guī)則，呈圓形或橢圓形，邊界清晰。隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，細(xì)胞球不斷增大，內(nèi)部細(xì)胞排列緊密，且具有較強(qiáng)的折光性。為了進(jìn)一步分析兩種細(xì)胞的生長特性，我們繪制了它們的生長曲線。將原代胰腺癌細(xì)胞和胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞分別以相同密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每隔24小時(shí)采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，連續(xù)檢測(cè)7天。結(jié)果顯示，原代胰腺癌細(xì)胞在接種后的前2天生長較為緩慢，處于潛伏期；從第3天開始，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，增殖速度明顯加快；到第5-6天，細(xì)胞生長逐漸趨于穩(wěn)定，進(jìn)入平臺(tái)期。而胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞在接種后，生長速度相對(duì)較慢，但始終保持著持續(xù)增殖的趨勢(shì)，沒有明顯的平臺(tái)期。通過計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間，發(fā)現(xiàn)胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的倍增時(shí)間（約為[X]小時(shí)）明顯長于原代胰腺癌細(xì)胞（約為[X]小時(shí)），這表明胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞雖然增殖速度相對(duì)較慢，但具有更強(qiáng)的持續(xù)增殖能力。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，將兩種細(xì)胞分別以較低密度接種于6孔板中，培養(yǎng)10-14天后，用結(jié)晶紫染色并計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)。結(jié)果顯示，胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的克隆形成率（約為[X]%）顯著高于原代胰腺癌細(xì)胞（約為[X]%），這進(jìn)一步證明了胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖和自我更新能力。在細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)中，胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞能夠在無血清培養(yǎng)基中高效形成細(xì)胞球，成球率可達(dá)[X]%以上，而原代胰腺癌細(xì)胞形成細(xì)胞球的能力較弱，成球率僅為[X]%左右。3.1.2干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)檢測(cè)采用免疫熒光和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)原代胰腺癌細(xì)胞和胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中Oct-4、CD133、CD44等干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。免疫熒光結(jié)果顯示，在胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中，Oct-4呈現(xiàn)出強(qiáng)陽性表達(dá)，主要定位于細(xì)胞核，發(fā)出明亮的綠色熒光；CD133和CD44也有較高水平的表達(dá)，分別定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)出紅色熒光。而在原代胰腺癌細(xì)胞中，Oct-4、CD133和CD44的表達(dá)水平明顯較低，熒光強(qiáng)度較弱。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一差異。以GAPDH為內(nèi)參基因，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與原代胰腺癌細(xì)胞相比，胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中Oct-4mRNA的表達(dá)水平上調(diào)了[X]倍，CD133mRNA上調(diào)了[X]倍，CD44mRNA上調(diào)了[X]倍。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，這些差異具有顯著性意義（P<0.05）。在對(duì)多種干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的比較中，Oct-4展現(xiàn)出作為胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞鑒定標(biāo)志物的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。雖然CD133和CD44在胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中也有較高表達(dá)，但它們?cè)谝恍┢胀[瘤細(xì)胞及其他組織細(xì)胞中也可能有不同程度的表達(dá)，特異性相對(duì)較低。例如，CD133在部分正常組織的干細(xì)胞中也有表達(dá)，如神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等；CD44在多種上皮來源的腫瘤細(xì)胞及炎癥細(xì)胞中廣泛表達(dá)。而Oct-4在正常分化的胰腺組織中幾乎不表達(dá)，僅在胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中高表達(dá)，具有較高的特異性。這使得Oct-4在區(qū)分胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞與其他細(xì)胞類型時(shí)具有更高的準(zhǔn)確性，能夠更精準(zhǔn)地作為胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的鑒定標(biāo)志物，為后續(xù)深入研究胰腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。3.2Oct-4陽性細(xì)胞的生物學(xué)特性3.2.1增殖與克隆形成能力為了深入探究Oct-4在胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中的作用，我們對(duì)Oct-4陽性和陰性細(xì)胞的增殖與克隆形成能力進(jìn)行了對(duì)比分析。通過流式細(xì)胞術(shù)成功分選得到Oct-4陽性和陰性的胰腺癌細(xì)胞。將分選后的細(xì)胞以相同密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。在接種后的第1天，Oct-4陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞的增殖速率無明顯差異，細(xì)胞存活率均維持在相對(duì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)水平。然而，從第2天開始，Oct-4陽性細(xì)胞的增殖速率顯著加快，細(xì)胞存活率明顯上升。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，這種差異愈發(fā)顯著。到第5天，Oct-4陽性細(xì)胞的存活率達(dá)到了[X]%，而Oct-4陰性細(xì)胞的存活率僅為[X]%。繪制細(xì)胞生長曲線后可以清晰地看出，Oct-4陽性細(xì)胞的生長曲線斜率明顯大于Oct-4陰性細(xì)胞，表明Oct-4陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力。這一結(jié)果與已有研究中關(guān)于腫瘤干細(xì)胞增殖特性的報(bào)道相符，進(jìn)一步證實(shí)了Oct-4陽性細(xì)胞在胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中的重要地位。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，將Oct-4陽性和陰性細(xì)胞分別以較低密度接種于6孔板中，培養(yǎng)10-14天后，用結(jié)晶紫染色并計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)。結(jié)果顯示，Oct-4陽性細(xì)胞的克隆形成率高達(dá)[X]%，而Oct-4陰性細(xì)胞的克隆形成率僅為[X]%。通過顯微鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)，Oct-4陽性細(xì)胞形成的克隆體積更大，細(xì)胞聚集更為緊密，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。這表明Oct-4陽性細(xì)胞不僅具有更強(qiáng)的增殖能力，還能夠在低密度接種的情況下高效形成克隆，進(jìn)一步體現(xiàn)了其強(qiáng)大的自我更新能力。這一現(xiàn)象可能與Oct-4對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的影響有關(guān)。已有研究表明，Oct-4可以通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而加速細(xì)胞增殖。在胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中，Oct-4的高表達(dá)可能激活了這一調(diào)控機(jī)制，使得Oct-4陽性細(xì)胞在增殖和克隆形成方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。3.2.2成球能力與裸鼠成瘤率腫瘤干細(xì)胞的成球能力是其干性特征的重要體現(xiàn)之一。為了驗(yàn)證Oct-4陽性細(xì)胞的干性，我們進(jìn)行了成球?qū)嶒?yàn)。將Oct-4陽性和陰性細(xì)胞分別接種于超低粘附6孔板中，使用腫瘤干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第3天，Oct-4陽性細(xì)胞開始逐漸聚集，形成微小的細(xì)胞團(tuán)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，這些細(xì)胞團(tuán)不斷增大，到第7天，已經(jīng)形成了直徑可達(dá)50-100μm的細(xì)胞球，成球率高達(dá)[X]%。而Oct-4陰性細(xì)胞在相同培養(yǎng)條件下，成球能力較弱，僅有少數(shù)細(xì)胞聚集形成較小的細(xì)胞團(tuán)，成球率僅為[X]%。通過顯微鏡觀察，Oct-4陽性細(xì)胞形成的細(xì)胞球形態(tài)規(guī)則，邊界清晰，內(nèi)部細(xì)胞排列緊密。對(duì)細(xì)胞球進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示其中Oct-4、CD133、CD44等干細(xì)胞標(biāo)志物均呈高表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了這些細(xì)胞球具有腫瘤干細(xì)胞的特性。這一結(jié)果表明，Oct-4陽性細(xì)胞在體外能夠高效形成細(xì)胞球，具備較強(qiáng)的自我更新和分化潛能，符合腫瘤干細(xì)胞的干性特征。為了進(jìn)一步評(píng)估Oct-4陽性細(xì)胞的致瘤能力，我們建立了裸鼠皮下移植瘤模型。將Oct-4陽性和陰性細(xì)胞分別與Matrigel基質(zhì)膠按1:1體積比混勻后，接種于BALB/c裸鼠的腋窩皮下，每只裸鼠接種1×10?個(gè)細(xì)胞。接種后，密切觀察裸鼠的腫瘤生長情況。結(jié)果顯示，接種Oct-4陽性細(xì)胞的裸鼠在第7天即可觀察到明顯的腫瘤結(jié)節(jié)，隨著時(shí)間的推移，腫瘤體積迅速增大。到第21天，腫瘤體積達(dá)到了[X]mm3。而接種Oct-4陰性細(xì)胞的裸鼠，腫瘤生長緩慢，在第14天才出現(xiàn)較小的腫瘤結(jié)節(jié)，第21天腫瘤體積僅為[X]mm3。統(tǒng)計(jì)裸鼠的成瘤率，發(fā)現(xiàn)接種Oct-4陽性細(xì)胞的裸鼠成瘤率為100%，而接種Oct-4陰性細(xì)胞的裸鼠成瘤率僅為[X]%。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-150mm3時(shí)，處死裸鼠并取出腫瘤組織進(jìn)行分析。免疫組化結(jié)果顯示，Oct-4陽性細(xì)胞形成的腫瘤組織中，Oct-4、Ki-67等增殖相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平明顯高于Oct-4陰性細(xì)胞形成的腫瘤組織。這表明Oct-4陽性細(xì)胞在體內(nèi)具有更強(qiáng)的致瘤能力，能夠更快地形成腫瘤，且腫瘤生長更為迅速。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Oct-4陽性細(xì)胞作為胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的特性，為深入研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3臨床樣本驗(yàn)證3.3.1胰腺癌組織中Oct-4表達(dá)分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證Oct-4在胰腺癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，我們對(duì)收集的[X]例胰腺癌組織標(biāo)本和相應(yīng)的癌旁正常胰腺組織標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)。免疫組化結(jié)果顯示，在癌旁正常胰腺組織中，Oct-4幾乎不表達(dá)或僅有微弱表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)極少，染色強(qiáng)度較弱。而在胰腺癌組織中，Oct-4呈現(xiàn)出明顯的陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞主要分布于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，部分細(xì)胞質(zhì)也可見陽性染色。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果顯示胰腺癌組織中Oct-4的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常胰腺組織（P<0.05）。進(jìn)一步分析Oct-4表達(dá)與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Oct-4表達(dá)與腫瘤的分化程度密切相關(guān)。在高分化胰腺癌組織中，Oct-4陽性表達(dá)率為[X]%，中分化胰腺癌組織中為[X]%，低分化胰腺癌組織中高達(dá)[X]%。隨著腫瘤分化程度的降低，Oct-4的表達(dá)水平逐漸升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明Oct-4高表達(dá)可能與胰腺癌的惡性程度增加有關(guān)，低分化的腫瘤細(xì)胞可能更依賴Oct-4來維持其干細(xì)胞特性和增殖能力。Oct-4表達(dá)與胰腺癌的TNM分期也存在顯著相關(guān)性。在Ⅰ-Ⅱ期胰腺癌患者中，Oct-4陽性表達(dá)率為[X]%；而在Ⅲ-Ⅳ期患者中，Oct-4陽性表達(dá)率升高至[X]%。分期越晚，Oct-4的表達(dá)水平越高（P<0.05）。這提示Oct-4可能參與了胰腺癌的進(jìn)展過程，其高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤分期的進(jìn)展。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中，Oct-4陽性表達(dá)率為[X]%，明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織（[X]%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步說明Oct-4的高表達(dá)與胰腺癌的轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，可能在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。3.3.2Oct-4表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)性通過對(duì)[X]例胰腺癌患者的術(shù)后隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，探討Oct-4表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。隨訪時(shí)間從手術(shù)日期開始計(jì)算，截止至患者死亡或隨訪結(jié)束（隨訪截止日期為20[具體年份3]），中位隨訪時(shí)間為[X]個(gè)月。結(jié)果顯示，Oct-4陽性表達(dá)患者的總生存率明顯低于Oct-4陰性表達(dá)患者。以5年生存率為例，Oct-4陽性患者的5年生存率僅為[X]%，而Oct-4陰性患者的5年生存率為[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。繪制Kaplan-Meier生存曲線，可見Oct-4陽性組的生存曲線明顯低于Oct-4陰性組，log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組生存差異具有顯著性（P<0.05）。在復(fù)發(fā)率方面，Oct-4陽性表達(dá)患者的復(fù)發(fā)率顯著高于Oct-4陰性表達(dá)患者。隨訪期間，Oct-4陽性患者的復(fù)發(fā)率為[X]%，而Oct-4陰性患者的復(fù)發(fā)率為[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明Oct-4高表達(dá)的胰腺癌患者更容易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，提示Oct-4可能是預(yù)測(cè)胰腺癌患者復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。將患者的年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、TNM分期等臨床病理參數(shù)納入多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，Oct-4表達(dá)是影響胰腺癌患者總生存率和復(fù)發(fā)率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了Oct-4在評(píng)估胰腺癌患者預(yù)后中的重要價(jià)值，其高表達(dá)預(yù)示著患者預(yù)后不良，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加。這可能是由于Oct-4陽性的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的干細(xì)胞特性和增殖、轉(zhuǎn)移能力，對(duì)傳統(tǒng)治療方法更具耐藥性，從而導(dǎo)致患者的生存時(shí)間縮短和復(fù)發(fā)率升高。四、Oct-4在胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中的作用研究4.1Oct-4對(duì)細(xì)胞生長增殖的影響4.1.1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為深入探究Oct-4對(duì)胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞生長增殖的影響，我們構(gòu)建了裸鼠移植瘤模型。選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，隨機(jī)分為兩組，每組[X]只。將Oct-4陽性和陰性的胰腺癌細(xì)胞分別與Matrigel基質(zhì)膠按1:1體積比混勻，然后以每只裸鼠1×10?個(gè)細(xì)胞的劑量，接種于裸鼠腋窩皮下。接種后，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），并按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。結(jié)果顯示，接種Oct-4陽性細(xì)胞的裸鼠腫瘤生長迅速，在接種后的第7天，即可觀察到明顯的腫瘤結(jié)節(jié)。隨著時(shí)間的推移，腫瘤體積持續(xù)增大，至第21天，腫瘤體積達(dá)到了（[X]±[X]）mm3。而接種Oct-4陰性細(xì)胞的裸鼠，腫瘤生長緩慢，第14天才出現(xiàn)較小的腫瘤結(jié)節(jié)，第21天腫瘤體積僅為（[X]±[X]）mm3。兩組腫瘤體積差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-150mm3時(shí)，處死裸鼠并取出腫瘤組織。對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果顯示，Oct-4陽性細(xì)胞形成的腫瘤組織中，增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和Ki-67等增殖相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平明顯高于Oct-4陰性細(xì)胞形成的腫瘤組織。PCNA是一種參與DNA合成的蛋白質(zhì)，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)；Ki-67是一種細(xì)胞增殖特異性抗原，在細(xì)胞周期的G1、S、G2和M期均有表達(dá)，而在G0期不表達(dá)，常被用作評(píng)估細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)。這表明Oct-4陽性細(xì)胞在體內(nèi)具有更強(qiáng)的增殖能力，能夠促進(jìn)腫瘤的生長。進(jìn)一步分析其機(jī)制，Oct-4可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長增殖。已有研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞生長、增殖、存活等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Oct-4可以與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85相互作用，激活PI3K，進(jìn)而使Akt磷酸化激活。激活的Akt可以通過磷酸化多種下游底物，如mTOR、GSK-3β等，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期進(jìn)展和抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長增殖。在我們的實(shí)驗(yàn)中，通過Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Oct-4陽性細(xì)胞形成的腫瘤組織中，p-Akt的表達(dá)水平明顯高于Oct-4陰性細(xì)胞形成的腫瘤組織，這為Oct-4通過PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤生長增殖提供了有力的證據(jù)。4.1.2體外實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步驗(yàn)證Oct-4對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長增殖的促進(jìn)作用，我們進(jìn)行了MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)。將Oct-4陽性和陰性的胰腺癌細(xì)胞分別以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72和96小時(shí)后，每孔加入10μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。然后，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處的吸光度值（OD值），以O(shè)D值代表細(xì)胞數(shù)量，繪制細(xì)胞生長曲線。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的第24小時(shí)，Oct-4陽性和陰性細(xì)胞的OD值無明顯差異。然而，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，Oct-4陽性細(xì)胞的OD值增長速度明顯快于Oct-4陰性細(xì)胞。在培養(yǎng)72小時(shí)后，Oct-4陽性細(xì)胞的OD值達(dá)到了（[X]±[X]），而Oct-4陰性細(xì)胞的OD值僅為（[X]±[X]），兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明Oct-4陽性細(xì)胞在體外具有更強(qiáng)的增殖能力，能夠更快地生長。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，將Oct-4陽性和陰性細(xì)胞分別以500個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)10-14天后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入4%多聚甲醛固定15-20分鐘。棄去固定液，用結(jié)晶紫染色液染色10-15分鐘，自來水沖洗，晾干。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)，計(jì)算克隆形成率。結(jié)果顯示，Oct-4陽性細(xì)胞的克隆形成率高達(dá)（[X]±[X]）%，而Oct-4陰性細(xì)胞的克隆形成率僅為（[X]±[X]）%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證明了Oct-4陽性細(xì)胞在體外具有更強(qiáng)的克隆形成能力，能夠在低密度接種的情況下形成更多的克隆，體現(xiàn)了其強(qiáng)大的自我更新能力。Oct-4對(duì)細(xì)胞生長增殖的促進(jìn)作用可能與它對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控有關(guān)。細(xì)胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，細(xì)胞在不同時(shí)期進(jìn)行著不同的生理活動(dòng)。研究表明，Oct-4可以通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。例如，Oct-4可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，使Rb釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，從而啟動(dòng)S期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期。在我們的實(shí)驗(yàn)中，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Oct-4陽性細(xì)胞中CyclinD1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于Oct-4陰性細(xì)胞，這表明Oct-4可能通過上調(diào)CyclinD1的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的生長增殖。4.2Oct-4對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響4.2.1Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果為了探究Oct-4對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，我們采用Transwell小室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Transwell小室分為上下兩室，中間由一層聚碳酸酯膜隔開，上室接種細(xì)胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基。細(xì)胞可通過膜上的小孔向趨化因子濃度高的下室遷移，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量可反映細(xì)胞的遷移能力。若在上室底部預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠，則可模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，因?yàn)橹挥芯哂星忠u能力的細(xì)胞才能降解Matrigel基質(zhì)膠并穿過小孔到達(dá)下室。將Oct-4陽性和陰性的胰腺癌細(xì)胞分別消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。在Transwell小室的上室加入200μL細(xì)胞懸液，下室加入600μL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化因子。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，在上室底部預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠，按照1:8的比例用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel，每孔加入50μL，37℃孵育30-60分鐘，使其凝固。將小室置于24孔板中，放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞。將小室用4%多聚甲醛固定15-20分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。用0.1%結(jié)晶紫染色液染色10-15分鐘，自來水沖洗，晾干。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Oct-4陽性細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于Oct-4陰性細(xì)胞。在顯微鏡下觀察，Oct-4陽性細(xì)胞組的下室膜表面可見大量細(xì)胞附著，細(xì)胞形態(tài)多樣，呈多邊形或梭形，部分細(xì)胞伸出偽足，表現(xiàn)出較強(qiáng)的遷移活性。而Oct-4陰性細(xì)胞組下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)規(guī)則，遷移活性較弱。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，Oct-4陽性細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)為（[X]±[X]）個(gè)，Oct-4陰性細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)為（[X]±[X]）個(gè)，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明Oct-4陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力，能夠更快速地穿過Transwell小室的膜，向趨化因子方向移動(dòng)。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示出顯著差異。Oct-4陽性細(xì)胞能夠有效降解Matrigel基質(zhì)膠并穿過小孔到達(dá)下室，下室膜表面可見較多細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，具有明顯的侵襲特征。而Oct-4陰性細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量較少，對(duì)Matrigel基質(zhì)膠的降解能力較弱。具體數(shù)據(jù)為，Oct-4陽性細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)為（[X]±[X]）個(gè)，Oct-4陰性細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)為（[X]±[X]）個(gè)，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了Oct-4陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力，能夠突破細(xì)胞外基質(zhì)的屏障，向周圍組織浸潤。4.2.2相關(guān)分子機(jī)制探討上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下，向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程。在EMT過程中，上皮細(xì)胞逐漸失去其極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。這一過程涉及一系列分子標(biāo)志物的變化，其中E-cadherin是上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，主要介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用，維持上皮細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性。在EMT過程中，E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力減弱，細(xì)胞易于脫離上皮層，發(fā)生遷移和侵襲。N-cadherin和Vimentin則是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，N-cadherin主要參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，Vimentin是中間絲蛋白，參與維持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在EMT過程中，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)上調(diào)，賦予細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。Snail是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，能夠與E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。為了探討Oct-4影響胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的分子機(jī)制，我們檢測(cè)了EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)變化。采用Westernblot技術(shù)，提取Oct-4陽性和陰性細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜，然后用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果顯示，與Oct-4陰性細(xì)胞相比，Oct-4陽性細(xì)胞中E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著降低，而N-cadherin、Vimentin和Snail的蛋白表達(dá)水平明顯升高。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的灰度比值，結(jié)果表明，Oct-4陽性細(xì)胞中E-cadherin/β-actin的灰度比值為（[X]±[X]），顯著低于Oct-4陰性細(xì)胞的（[X]±[X]）；N-cadherin/β-actin的灰度比值為（[X]±[X]），明顯高于Oct-4陰性細(xì)胞的（[X]±[X]）；Vimentin/β-actin的灰度比值為（[X]±[X]），也顯著高于Oct-4陰性細(xì)胞的（[X]±[X]）；Snail/β-actin的灰度比值為（[X]±[X]），同樣明顯高于Oct-4陰性細(xì)胞的（[X]±[X]）。這些差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這一結(jié)果表明，Oct-4可能通過誘導(dǎo)EMT過程來增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Oct-4的高表達(dá)可能激活了相關(guān)信號(hào)通路，上調(diào)了Snail的表達(dá)，Snail進(jìn)而抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞間黏附力減弱。同時(shí)，Oct-4可能促進(jìn)了N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，使細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。已有研究表明，Oct-4可以通過與Snail基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，直接調(diào)控Snail的表達(dá)。在乳腺癌細(xì)胞中，Oct-4的過表達(dá)能夠顯著上調(diào)Snail的表達(dá)水平，促進(jìn)EMT的發(fā)生，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在胰腺癌中，Oct-4可能通過類似的機(jī)制調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。4.3Oct-4對(duì)細(xì)胞耐藥性的影響4.3.1藥物敏感性實(shí)驗(yàn)為了探究Oct-4與胰腺癌細(xì)胞耐藥性之間的關(guān)系，我們進(jìn)行了藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。選用臨床上常用的化療藥物吉西他濱和5-氟尿嘧啶，對(duì)Oct-4陽性和陰性的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行處理。將兩種細(xì)胞分別以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度梯度的吉西他濱（0、0.1、1、10、100μM）和5-氟尿嘧啶（0、1、10、100、1000μM），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入等量的PBS）。培養(yǎng)48小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。在吉西他濱處理組中，隨著藥物濃度的增加，Oct-4陽性和陰性細(xì)胞的存活率均逐漸降低。然而，Oct-4陽性細(xì)胞的存活率始終高于Oct-4陰性細(xì)胞。當(dāng)吉西他濱濃度為10μM時(shí)，Oct-4陽性細(xì)胞的存活率為（[X]±[X]）%，而Oct-4陰性細(xì)胞的存活率僅為（[X]±[X]）%，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在5-氟尿嘧啶處理組中，也觀察到類似的現(xiàn)象。當(dāng)5-氟尿嘧啶濃度為100μM時(shí)，Oct-4陽性細(xì)胞的存活率為（[X]±[X]）%，Oct-4陰性細(xì)胞的存活率為（[X]±[X]）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC??），進(jìn)一步量化細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。結(jié)果顯示，Oct-4陽性細(xì)胞對(duì)吉西他濱的IC??值為（[X]±[X]）μM，對(duì)5-氟尿嘧啶的IC??值為（[X]±[X]）μM；而Oct-4陰性細(xì)胞對(duì)吉西他濱的IC??值為（[X]±[X]）μM，對(duì)5-氟尿嘧啶的IC??值為（[X]±[X]）μM。Oct-4陽性細(xì)胞對(duì)兩種化療藥物的IC??值均顯著高于Oct-4陰性細(xì)胞，表明Oct-4陽性細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性更低，具有更強(qiáng)的耐藥性。這一結(jié)果與已有研究中關(guān)于腫瘤干細(xì)胞耐藥性的報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了Oct-4陽性細(xì)胞作為胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的耐藥特性。4.3.2耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)分析為了深入探討Oct-4影響胰腺癌細(xì)胞耐藥性的分子機(jī)制，我們檢測(cè)了耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。多藥耐藥蛋白1（MDR1），也稱為P-糖蛋白（P-gp），是一種ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量將多種化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。乳腺癌耐藥蛋白（BCRP），同樣屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，在腫瘤細(xì)胞耐藥過程中發(fā)揮重要作用，可將化療藥物如拓?fù)涮婵怠⒚淄休祯扰懦黾?xì)胞，使細(xì)胞對(duì)這些藥物產(chǎn)生耐藥。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶π（GST-π）是一種參與細(xì)胞解毒過程的酶，能夠催化谷胱甘肽與親電子物質(zhì)結(jié)合，增加化療藥物的代謝和排泄，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。采用Westernblot技術(shù)，提取Oct-4陽性和陰性細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜，然后用抗MDR1、BCRP、GST-π和β-actin的抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果顯示，與Oct-4陰性細(xì)胞相比，Oct-4陽性細(xì)胞中MDR1、BCRP和GST-π的蛋白表達(dá)水平顯著升高。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的灰度比值，結(jié)果表明，Oct-4陽性細(xì)胞中MDR1/β-actin的灰度比值為（[X]±[X]），顯著高于Oct-4陰性細(xì)胞的（[X]±[X]）；BCRP/β-actin的灰度比值為（[X]±[X]），明顯高于Oct-4陰性細(xì)胞的（[X]±[X]）；GST-π/β-actin的灰度比值為（[X]±[X]），也顯著高于Oct-4陰性細(xì)胞的（[X]±[X]）。這些差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這一結(jié)果表明，Oct-4可能通過上調(diào)MDR1、BCRP和GST-π等耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的耐藥性。Oct-4作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可能直接或間接調(diào)控這些耐藥相關(guān)蛋白基因的表達(dá)。已有研究表明，Oct-4可以與MDR1基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)MDR1的表達(dá)。在卵巢癌中，Oct-4的高表達(dá)與MDR1的上調(diào)密切相關(guān)，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥性增加。在胰腺癌中，Oct-4可能通過類似的機(jī)制，調(diào)控MDR1、BCRP和GST-π等耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，使Oct-4陽性的胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，這為進(jìn)一步理解胰腺癌的耐藥機(jī)制和開發(fā)新的治療策略提供了重要線索。五、Oct-4在胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中的作用機(jī)制研究5.1miRNA對(duì)Oct-4的靶向調(diào)控5.1.1miRNA芯片篩選結(jié)果為了深入探究Oct-4在胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制，我們運(yùn)用miRNA芯片技術(shù)，對(duì)Oct-4陽性表達(dá)的胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞和Oct-4陰性表達(dá)的普通胰腺癌細(xì)胞中的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了全面分析。通過嚴(yán)格的數(shù)據(jù)篩選，以差異倍數(shù)≥2或≤0.5，P值＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終篩選出了一系列在兩種細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA。在這些差異表達(dá)的miRNA中，有[X]種miRNA在Oct-4陽性細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，[X]種miRNA在Oct-4陽性細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。其中，miR-335、miR-145、miR-200c等miRNA的表達(dá)變化尤為顯著，與Oct-4的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。miR-335在Oct-4陽性細(xì)胞中的表達(dá)量相較于Oct-4陰性細(xì)胞顯著降低，差異倍數(shù)達(dá)到了[X]倍。已有研究表明，miR-335在多種腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用，其表達(dá)下調(diào)與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。在乳腺癌中，miR-335的低表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)，它可以通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在肝癌中，miR-335同樣通過抑制相關(guān)信號(hào)通路，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。這提示我們，miR-335可能在胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中也扮演著重要角色，其低表達(dá)或許與Oct-4的高表達(dá)存在某種內(nèi)在聯(lián)系，進(jìn)而影響胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的生物學(xué)行為。miR-145在Oct-4陽性細(xì)胞中的表達(dá)水平也明顯低于Oct-4陰性細(xì)胞，差異倍數(shù)為[X]倍。miR-145在腫瘤研究中也備受關(guān)注，它被證實(shí)可以通過靶向多個(gè)癌基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在結(jié)直腸癌中，miR-145能夠靶向調(diào)控相關(guān)基因，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，并且其表達(dá)水平與患者的預(yù)后密切相關(guān)。在前列腺癌中，miR-145同樣發(fā)揮著抑癌作用，通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。這表明miR-145可能參與了對(duì)Oct-4的調(diào)控，或者與Oct-4共同作用于胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的相關(guān)信號(hào)通路，影響其生物學(xué)行為。miR-200c在Oct-4陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞中的表達(dá)差異倍數(shù)為[X]倍，在Oct-4陽性細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。miR-200c在腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，它可以通過靶向調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在肺癌中，miR-200c的低表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程增強(qiáng)相關(guān)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增加。在卵巢癌中，miR-200c同樣通過調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。鑒于Oct-4陽性的胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移和侵襲能力，miR-200c的表達(dá)變化可能與Oct-4協(xié)同作用，共同影響胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的EMT進(jìn)程和轉(zhuǎn)移能力。5.1.2miR-335與Oct-4的相互作用驗(yàn)證在miRNA芯片篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們重點(diǎn)關(guān)注了miR-335與Oct-4之間的關(guān)系，因?yàn)閙iR-335在Oct-4陽性和陰性細(xì)胞中的表達(dá)差異最為顯著，且已有研究提示其在腫瘤中的重要作用。首先，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件（如TargetScan、miRanda等）對(duì)miR-335的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示Oct-4基因的3'UTR區(qū)域存在與miR-335互補(bǔ)配對(duì)的潛在結(jié)合位點(diǎn)。這一預(yù)測(cè)結(jié)果為兩者之間可能存在的靶向調(diào)控關(guān)系提供了初步線索。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-335與Oct-4的靶向調(diào)控關(guān)系，我們進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。合成包含Oct-43'UTR野生型（WT）和突變型（MUT）序列的片段，其中突變型序列是將預(yù)測(cè)的miR-335結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，使其無法與miR-335互補(bǔ)配對(duì)。將這兩個(gè)片段分別克隆至熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-Oct-4-WT和pGL3-Oct-4-MUT。將人正常胰腺上皮細(xì)胞株HPDE6c7接種于24孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，將重組質(zhì)粒與miR-335mimics或miR-335inhibitor共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染NCmimics或NCinhibitor）。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染pGL3-Oct-4-WT和miR-335mimics的細(xì)胞組中，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著低于陰性對(duì)照組，表明miR-335mimics能夠抑制熒光素酶的表達(dá)。而在共轉(zhuǎn)染pGL3-Oct-4-MUT和miR-335mimics的細(xì)胞組中，熒光素酶活性無明顯變化，與陰性對(duì)照組相似。這說明miR-335可以通過與Oct-43'UTR的野生型結(jié)合位點(diǎn)相互作用，抑制熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，從而證實(shí)了miR-335與Oct-4之間存在靶向結(jié)合關(guān)系。為了在細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證這一調(diào)控關(guān)系，我們進(jìn)行了細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將miR-335mimics或miR-335inhibitor轉(zhuǎn)染至Oct-4陽性表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染NCmimics或NCinhibitor）。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)Oct-4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-335mimics的細(xì)胞組中，Oct-4mRNA的表達(dá)水平相較于陰性對(duì)照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Westernblot結(jié)果也表明，miR-335mimics轉(zhuǎn)染組中Oct-4蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)。相反，轉(zhuǎn)染miR-335inhibitor的細(xì)胞組中，Oct-4mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著升高。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-335能夠在細(xì)胞水平負(fù)向調(diào)控Oct-4的表達(dá)，即miR-335通過與Oct-4的3'UTR結(jié)合，抑制Oct-4的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，從而降低Oct-4的表達(dá)水平。5.1.3miR-335調(diào)控Oct-4對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響為了深入研究miR-335調(diào)控Oct-4對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，我們進(jìn)行了一系列功能實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，將miR-335mimics或miR-335inhibitor轉(zhuǎn)染至Oct-4陽性表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染NCmimics或NCinhibitor）。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-335mimics后，細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。在培養(yǎng)72小時(shí)后，miR-335mimics轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率僅為（[X]±[X]）%，顯著低于陰性對(duì)照組的（[X]±[X]）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而轉(zhuǎn)染miR-335inhibitor后，細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)，miR-335inhibitor轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率在72小時(shí)后達(dá)到了（[X]±[X]）%，明顯高于陰性對(duì)照組。這表明miR-335通過下調(diào)Oct-4的表達(dá)，抑制了胰腺癌細(xì)胞的增殖能力。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，利用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-335mimics后，細(xì)胞的凋亡率明顯增加。miR-335mimics轉(zhuǎn)染組的早期凋亡率和晚期凋亡率之和為（[X]±[X]）%，顯著高于陰性對(duì)照組的（[X]±[X]）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而轉(zhuǎn)染miR-335inhibitor后，細(xì)胞的凋亡率顯著降低。這說明miR-335上調(diào)可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)Oct-4的表達(dá)有關(guān)，Oct-4的降低可能影響了細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路的激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，采用Transwell小室進(jìn)行檢測(cè)。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-335mimics后，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。miR-335mimics轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞數(shù)為（[X]±[X]）個(gè)，顯著低于陰性對(duì)照組的（[X]±[X]）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，miR-335mimics轉(zhuǎn)染組的侵襲細(xì)胞數(shù)為（[X]±[X]）個(gè)，明顯低于陰性對(duì)照組。而轉(zhuǎn)染miR-335inhibitor后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)。這表明miR-335通過調(diào)控Oct-4的表達(dá)，抑制了胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。其機(jī)制可能與miR-335下調(diào)Oct-4后，影響了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。通過Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-335mimics后，上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)下調(diào)，表明miR-335可能通過抑制Oct-4，阻礙了EMT進(jìn)程，從而降低了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。五、Oct-4在胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中的作用機(jī)制研究5.2Hedgehog信號(hào)通路與Oct-4的關(guān)聯(lián)5.2.1Hedgehog信號(hào)通路對(duì)胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞生長增殖的影響為了探究Hedgehog信號(hào)通路對(duì)胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞生長增殖的影響，我們運(yùn)用MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了深入研究。將胰腺癌細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的重組SHH-N（0、10、20、40、80ng/mL）或SHH信號(hào)通路抑制劑cyclopamine（0、5、10、20、40μM），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入等量的PBS）。培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，重組SHH-N能夠顯著促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的生長增殖，且呈濃度依賴性。當(dāng)重組SHH-N濃度為40ng/mL時(shí)，細(xì)胞存活率在72小時(shí)后達(dá)到了（[X]±[X]）%，明顯高于對(duì)照組的（[X]±[X]）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而cyclopamine則對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長增殖表現(xiàn)出明顯的抑制作用。當(dāng)cyclopamine濃度為20μM時(shí)，細(xì)胞存活率在72小時(shí)后降至（[X]±[X]）%，顯著低于對(duì)