Oct4對(duì)胚胎癌P19細(xì)胞中miR-302的調(diào)控機(jī)制及功能研究

Oct4對(duì)胚胎癌P19細(xì)胞中miR-302的調(diào)控機(jī)制及功能研究一、引言1.1研究背景與意義在生命科學(xué)領(lǐng)域，細(xì)胞的自我更新與分化機(jī)制一直是研究的核心熱點(diǎn)。胚胎干細(xì)胞（ESCs）因具備高度自我更新能力以及分化為人體內(nèi)所有細(xì)胞類(lèi)型的多能性，為發(fā)育生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科的發(fā)展提供了廣闊前景，成為眾多科學(xué)家探索生命奧秘的關(guān)鍵研究對(duì)象。在ESCs中，一系列轉(zhuǎn)錄因子與非編碼RNA發(fā)揮著不可或缺的調(diào)控作用，其中轉(zhuǎn)錄因子Oct4和miR-302備受關(guān)注。轉(zhuǎn)錄因子Oct4，也被稱(chēng)為Oct3，隸屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族，是目前研究最為詳盡的與胚胎發(fā)育多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子之一，堪稱(chēng)全能胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志性因子。在鼠和人體內(nèi)，Oct4主要在胚胎干細(xì)胞及生殖細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)于維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新起著極為重要的作用。在小鼠胚胎早期發(fā)育進(jìn)程中，Oct4的表達(dá)呈現(xiàn)出特定的時(shí)空模式。小鼠卵母細(xì)胞中存在母源Oct4，隨著受精以及合子基因激活，合子來(lái)源的Oct4在4-8細(xì)胞期胚胎開(kāi)始表達(dá)，并均勻分布于早期胚胎各卵裂球細(xì)胞內(nèi)。直至囊胚時(shí)期，其表達(dá)開(kāi)始局限于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM），而從滋養(yǎng)外胚層（TE）細(xì)胞中消失。對(duì)于著床后的卵圓柱期胚，僅能在其原始外胚層中檢測(cè)到Oct4的表達(dá)。在之后7-8天的胚胎中，可在神經(jīng)外胚層檢測(cè)到Oct4表達(dá)。自8.5天起，就只能在原始生殖細(xì)胞中檢測(cè)到Oct4的表達(dá)。由此可見(jiàn)，Oct4在原腸胚形成時(shí)期對(duì)譜系定型起到關(guān)鍵作用。此外，Oct4還是將體細(xì)胞重新編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞所必需的四個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子之一，并且是該過(guò)程中唯一不能被同一蛋白家族其他成員替代的因子。它能夠與Sox2形成異二聚體，共同結(jié)合DNA，參與基因表達(dá)調(diào)控。miR-302是一群高度保守的微型RNA分子，在胚胎干細(xì)胞和多能細(xì)胞中特異性表達(dá)，在重編程、細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)過(guò)程中扮演著重要角色，因而受到廣泛關(guān)注。在體細(xì)胞核移植（SCNT）和OKSM重編程中，miR-302的表達(dá)被證實(shí)是必不可少的。研究顯示，miR-302的產(chǎn)生可能與Oct4的表達(dá)存在關(guān)聯(lián)。胚胎癌P19細(xì)胞系來(lái)源于C3H/He小鼠中誘導(dǎo)的畸胎癌，具有胚胎干細(xì)胞相關(guān)的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，并且能夠不斷自我更新，常被作為研究胚胎發(fā)育的模型。在P19細(xì)胞中，Oct4和miR-302之間存在著緊密的調(diào)控關(guān)系。已有研究表明，Oct4的表達(dá)水平會(huì)直接影響miR-302的表達(dá)。當(dāng)Oct4表達(dá)水平高時(shí)，miR-302的表達(dá)水平也隨之升高；當(dāng)Oct4表達(dá)水平低時(shí)，miR-302的表達(dá)水平則下降。同時(shí)，當(dāng)miR-302過(guò)表達(dá)時(shí)，Oct4的表達(dá)水平也會(huì)上升；當(dāng)miR-302表達(dá)水平低時(shí)，Oct4的表達(dá)水平也會(huì)下降。這充分表明，Oct4和miR-302之間相互作用，能夠彼此調(diào)控對(duì)方的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-302家族中的miR-302b和miR-302d表達(dá)水平與Oct4表達(dá)水平呈正相關(guān)，而miR-302a和miR-302c則呈負(fù)相關(guān)，且miR-302a能夠直接靶向Oct4基因。深入探究胚胎癌P19細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控機(jī)制，具有重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。在干細(xì)胞研究領(lǐng)域，有助于我們進(jìn)一步理解胚胎干細(xì)胞自我更新和多能性維持的分子機(jī)制，為干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、定向分化以及在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供更為堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。比如，在利用干細(xì)胞治療疾病時(shí)，通過(guò)調(diào)控Oct4與miR-302的關(guān)系，有望更精準(zhǔn)地控制干細(xì)胞的分化方向，提高治療效果。在腫瘤研究方面，由于胚胎癌P19細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞具有一定的相似性，研究二者的調(diào)控關(guān)系可能為腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的見(jiàn)解，進(jìn)而為腫瘤的診斷、治療和預(yù)防開(kāi)辟新的思路。例如，若能明確Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控在腫瘤細(xì)胞增殖和分化中的作用，或許可以開(kāi)發(fā)出以這一調(diào)控通路為靶點(diǎn)的新型腫瘤治療方法。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)際上，胚胎癌P19細(xì)胞作為研究胚胎發(fā)育的重要模型，受到了廣泛關(guān)注。國(guó)外學(xué)者對(duì)P19細(xì)胞的研究起步較早，在細(xì)胞的分化特性、多能性維持機(jī)制等方面取得了一系列成果。例如，有研究詳細(xì)闡述了P19細(xì)胞在不同誘導(dǎo)條件下向心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞類(lèi)型分化的具體過(guò)程和分子機(jī)制，為后續(xù)研究細(xì)胞分化調(diào)控提供了重要參考。轉(zhuǎn)錄因子Oct4在胚胎干細(xì)胞和多能細(xì)胞中的關(guān)鍵作用也得到了深入研究。國(guó)外研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)基因敲除、過(guò)表達(dá)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，揭示了Oct4在維持胚胎干細(xì)胞多能性和自我更新方面的核心地位。研究發(fā)現(xiàn)，Oct4能夠與多種基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，直接調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的命運(yùn)決定。如在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中，Oct4基因敲除會(huì)導(dǎo)致胚胎無(wú)法形成正常的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，胚胎發(fā)育停滯，充分證明了Oct4對(duì)于早期胚胎發(fā)育的不可或缺性。此外，Oct4在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）重編程過(guò)程中的關(guān)鍵作用也被廣泛研究，明確了其作為重編程關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的地位。對(duì)于miR-302的研究，國(guó)外同樣處于前沿水平。研究人員發(fā)現(xiàn)miR-302在胚胎干細(xì)胞和多能細(xì)胞中特異性表達(dá)，并在細(xì)胞重編程、增殖、分化等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。例如，在體細(xì)胞核移植和OKSM重編程中，miR-302的表達(dá)被證實(shí)是必不可少的。通過(guò)對(duì)miR-302作用機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)其能夠通過(guò)靶向調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。如miR-302能夠靶向抑制某些細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在國(guó)內(nèi)，相關(guān)領(lǐng)域的研究也取得了顯著進(jìn)展。在胚胎癌P19細(xì)胞研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)與國(guó)外研究團(tuán)隊(duì)合作或獨(dú)立開(kāi)展研究，對(duì)P19細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行了更深入的探索，尤其在細(xì)胞分化的分子機(jī)制以及與疾病相關(guān)性方面取得了新的突破。例如，有研究發(fā)現(xiàn)P19細(xì)胞在特定條件下分化過(guò)程中某些新的信號(hào)通路的激活，為進(jìn)一步理解細(xì)胞分化機(jī)制提供了新的視角。在Oct4的研究上，國(guó)內(nèi)研究聚焦于Oct4在不同組織和細(xì)胞類(lèi)型中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。研究表明，Oct4在多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)Oct4在腫瘤細(xì)胞中作用機(jī)制的研究，為腫瘤的診斷和治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。關(guān)于miR-302，國(guó)內(nèi)研究在其生物學(xué)功能和作用機(jī)制方面取得了重要成果。有研究發(fā)現(xiàn)miR-302在心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。如在心肌梗死模型中，miR-302過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖和存活，改善心臟功能。此外，國(guó)內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)還對(duì)miR-302在胚胎發(fā)育和干細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入研究，為干細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)提供了理論支持。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在胚胎癌P19細(xì)胞、Oct4和miR-302的研究方面都取得了豐碩成果，但仍存在一些不足。目前對(duì)于Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控機(jī)制研究還不夠深入，尤其是在P19細(xì)胞中，Oct4如何精確調(diào)控miR-302的轉(zhuǎn)錄和加工過(guò)程，以及這種調(diào)控如何影響細(xì)胞的多能性和分化方向，仍有待進(jìn)一步探索。此外，雖然已知miR-302能夠靶向多個(gè)基因，但這些基因之間如何協(xié)同作用，以及它們與Oct4調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系還不清楚。本研究將以此為切入點(diǎn)，深入探究胚胎癌P19細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控機(jī)制，以期為干細(xì)胞研究和腫瘤治療等領(lǐng)域提供新的理論依據(jù)和治療策略。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究胚胎癌P19細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控機(jī)制，為干細(xì)胞研究和腫瘤治療等領(lǐng)域提供新的理論依據(jù)和治療策略。具體研究?jī)?nèi)容如下：Oct4與miR-302在P19細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系：運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR、Westernblot等技術(shù)，精準(zhǔn)檢測(cè)在正常培養(yǎng)條件下P19細(xì)胞中Oct4和miR-302的表達(dá)水平。通過(guò)基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建Oct4過(guò)表達(dá)和敲低的P19細(xì)胞模型，以及miR-302過(guò)表達(dá)和敲低的P19細(xì)胞模型。在這些模型中，再次利用實(shí)時(shí)定量PCR、Westernblot等方法，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)Oct4和miR-302表達(dá)水平的變化，以此明確二者在P19細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系，是正相關(guān)還是負(fù)相關(guān)。例如，若Oct4過(guò)表達(dá)時(shí)miR-302表達(dá)水平顯著上升，敲低Oct4時(shí)miR-302表達(dá)水平明顯下降，則可初步判斷二者呈正相關(guān)關(guān)系。Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控機(jī)制：采用生物信息學(xué)分析方法，預(yù)測(cè)Oct4可能結(jié)合的miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域的位點(diǎn)。通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證Oct4是否能夠直接結(jié)合到預(yù)測(cè)的miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域，從而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，進(jìn)一步確定Oct4對(duì)miR-302基因啟動(dòng)子活性的影響。同時(shí)，研究Oct4是否通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，間接調(diào)控miR-302的表達(dá)。比如，若ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Oct4能夠與miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域特異性結(jié)合，且雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明Oct4可增強(qiáng)miR-302基因啟動(dòng)子活性，那么可初步確定Oct4對(duì)miR-302的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Oct4對(duì)miR-302調(diào)控對(duì)P19細(xì)胞功能的影響：觀察Oct4對(duì)miR-302調(diào)控對(duì)P19細(xì)胞多能性的影響，通過(guò)檢測(cè)多能性相關(guān)基因（如Nanog、Sox2等）的表達(dá)水平，以及細(xì)胞的分化潛能來(lái)評(píng)估。研究Oct4對(duì)miR-302調(diào)控對(duì)P19細(xì)胞增殖和凋亡的影響，采用MTT法、EdU染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，利用AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。探究Oct4對(duì)miR-302調(diào)控對(duì)P19細(xì)胞分化方向的影響，在不同的誘導(dǎo)條件下，檢測(cè)細(xì)胞向特定細(xì)胞類(lèi)型（如神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等）分化的標(biāo)志物表達(dá)，判斷細(xì)胞的分化方向。例如，在心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化條件下，若Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控使得心肌細(xì)胞標(biāo)志物（如心肌肌鈣蛋白T等）表達(dá)顯著變化，則可分析其對(duì)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化方向的影響。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究采用多種實(shí)驗(yàn)方法，以深入探究胚胎癌P19細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控機(jī)制。具體研究方法如下：細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇凍存的胚胎癌P19細(xì)胞，將其接種于含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，防止細(xì)胞污染。RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR：使用Trizol試劑提取P19細(xì)胞中的總RNA，通過(guò)核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度。以提取的總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)針對(duì)Oct4、miR-302以及內(nèi)參基因（如U6、GAPDH等）的特異性引物，采用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。通過(guò)比較不同樣本中目的基因與內(nèi)參基因的Ct值，利用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以此準(zhǔn)確檢測(cè)Oct4和miR-302在不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)水平變化。蛋白質(zhì)提取與Westernblot：使用RIPA裂解液提取P19細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)，通過(guò)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入針對(duì)Oct4以及內(nèi)參蛋白（如β-actin、GAPDH等）的一抗，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)，使二抗與一抗特異性結(jié)合。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平，分析Oct4蛋白表達(dá)量在不同實(shí)驗(yàn)條件下的變化?；蚓庉嫾夹g(shù)：運(yùn)用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建Oct4過(guò)表達(dá)和敲低的P19細(xì)胞模型。設(shè)計(jì)針對(duì)Oct4基因的sgRNA序列，將其克隆到CRISPR-Cas9表達(dá)載體中，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組載體導(dǎo)入P19細(xì)胞。利用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證Oct4基因編輯的準(zhǔn)確性。同時(shí)，采用慢病毒介導(dǎo)的方法構(gòu)建miR-302過(guò)表達(dá)和敲低的P19細(xì)胞模型。將miR-302模擬物或抑制劑克隆到慢病毒表達(dá)載體中，包裝慢病毒后感染P19細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆，確保成功構(gòu)建基因編輯細(xì)胞模型，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)：使用甲醛將P19細(xì)胞中的蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)，通過(guò)超聲破碎將染色質(zhì)打斷成一定長(zhǎng)度的片段。加入抗Oct4抗體，4℃孵育過(guò)夜，使抗體與Oct4蛋白-DNA復(fù)合物特異性結(jié)合。次日，加入ProteinA/G磁珠，室溫孵育1-2小時(shí)，使ProteinA/G磁珠與抗體-Oct4蛋白-DNA復(fù)合物結(jié)合。用低鹽洗滌緩沖液、高鹽洗滌緩沖液和LiCl洗滌緩沖液依次洗滌磁珠，以去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和DNA。最后，用洗脫緩沖液洗脫與磁珠結(jié)合的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，解交聯(lián)后純化DNA。通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析，驗(yàn)證Oct4是否能夠直接結(jié)合到miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域的預(yù)測(cè)位點(diǎn)，明確Oct4對(duì)miR-302轉(zhuǎn)錄調(diào)控的直接作用機(jī)制。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：將miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域克隆到螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體中，同時(shí)構(gòu)建海腎熒光素酶報(bào)告基因載體作為內(nèi)參。將重組螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體和海腎熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染到P19細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)染Oct4過(guò)表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中的螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶活性。通過(guò)計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，評(píng)估Oct4對(duì)miR-302基因啟動(dòng)子活性的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證Oct4對(duì)miR-302轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。細(xì)胞功能檢測(cè)：采用MTT法檢測(cè)P19細(xì)胞的增殖能力。將不同處理的P19細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種一定數(shù)量的細(xì)胞。培養(yǎng)不同時(shí)間（如24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)等）后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。然后，吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值，根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞增殖率，分析Oct4對(duì)miR-302調(diào)控對(duì)P19細(xì)胞增殖能力的影響。EdU染色法：該方法用于檢測(cè)細(xì)胞的DNA合成情況，從而反映細(xì)胞的增殖能力。將不同處理的P19細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入EdU工作液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。然后，按照EdU染色試劑盒的操作步驟，依次進(jìn)行細(xì)胞固定、通透、染色等操作。最后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例，評(píng)估細(xì)胞的增殖能力，與MTT法結(jié)果相互驗(yàn)證，更全面地分析Oct4對(duì)miR-302調(diào)控對(duì)P19細(xì)胞增殖的影響。AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)：檢測(cè)P19細(xì)胞的凋亡情況。將不同處理的P19細(xì)胞收集，用PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞。然后，依次加入AnnexinV-FITC和PI染色液，室溫避光孵育15分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，根據(jù)AnnexinV-FITC和PI的染色結(jié)果，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV-FITC?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-FITC?/PI?），統(tǒng)計(jì)不同凋亡狀態(tài)細(xì)胞的比例，分析Oct4對(duì)miR-302調(diào)控對(duì)P19細(xì)胞凋亡的影響。細(xì)胞分化誘導(dǎo)與標(biāo)志物檢測(cè)：在不同的誘導(dǎo)條件下，將P19細(xì)胞誘導(dǎo)分化為特定細(xì)胞類(lèi)型，如神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化，使用含有維甲酸（RA）等誘導(dǎo)劑的神經(jīng)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)P19細(xì)胞，培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物（如β-TubulinⅢ、MAP2等）的表達(dá)；對(duì)于心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化，使用含有5-氮胞苷等誘導(dǎo)劑的心肌分化培養(yǎng)基培養(yǎng)P19細(xì)胞，培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、Westernblot或免疫熒光染色等方法檢測(cè)心肌細(xì)胞標(biāo)志物（如心肌肌鈣蛋白T、α-肌動(dòng)蛋白等）的表達(dá)，判斷Oct4對(duì)miR-302調(diào)控對(duì)P19細(xì)胞分化方向的影響。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先復(fù)蘇胚胎癌P19細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供足夠的細(xì)胞樣本。利用RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白質(zhì)提取與Westernblot技術(shù)，檢測(cè)正常培養(yǎng)條件下P19細(xì)胞中Oct4和miR-302的表達(dá)水平。運(yùn)用基因編輯技術(shù)，構(gòu)建Oct4過(guò)表達(dá)和敲低的P19細(xì)胞模型，以及miR-302過(guò)表達(dá)和敲低的P19細(xì)胞模型。在構(gòu)建的基因編輯細(xì)胞模型中，再次使用RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白質(zhì)提取與Westernblot技術(shù)，檢測(cè)Oct4和miR-302表達(dá)水平的變化，明確二者在P19細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系。通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)Oct4可能結(jié)合的miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域的位點(diǎn)，然后采用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控機(jī)制。對(duì)構(gòu)建的基因編輯細(xì)胞模型進(jìn)行細(xì)胞功能檢測(cè)，包括MTT法、EdU染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，以及在不同誘導(dǎo)條件下檢測(cè)細(xì)胞向特定細(xì)胞類(lèi)型分化的標(biāo)志物表達(dá)，判斷Oct4對(duì)miR-302調(diào)控對(duì)P19細(xì)胞功能的影響。最后，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和總結(jié)討論，得出研究結(jié)論。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中各步驟用箭頭連接，清晰展示從細(xì)胞培養(yǎng)到得出研究結(jié)論的整個(gè)研究流程]二、胚胎癌P19細(xì)胞、Oct4及miR-302概述2.1胚胎癌P19細(xì)胞特性2.1.1來(lái)源與培養(yǎng)胚胎癌P19細(xì)胞系有著獨(dú)特的起源，它是從C3H/He小鼠中誘導(dǎo)的惡性畸胎瘤中成功建立的。C3H/He小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其遺傳背景相對(duì)穩(wěn)定，為建立穩(wěn)定的細(xì)胞系提供了良好的基礎(chǔ)。在誘導(dǎo)畸胎瘤的過(guò)程中，通過(guò)特定的實(shí)驗(yàn)手段，促使小鼠體內(nèi)細(xì)胞發(fā)生異常增殖和分化，從而形成畸胎瘤。研究人員從這些畸胎瘤中分離出P19細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，最終建立了穩(wěn)定的P19細(xì)胞系。在培養(yǎng)P19細(xì)胞時(shí)，需為其營(yíng)造適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。常規(guī)培養(yǎng)條件下，使用的培養(yǎng)基為MEMα（不含核苷和脫氧核苷），這種培養(yǎng)基為細(xì)胞提供了必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子。同時(shí)，添加10%的胎牛血清（FBS）至關(guān)重要，F(xiàn)BS中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和生長(zhǎng)因子等，能夠滿足P19細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的需求。此外，還需加入1%的青霉素-鏈霉素雙抗，以防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中受到細(xì)菌和真菌的污染。培養(yǎng)過(guò)程中，將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃是人體正常體溫，也是大多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)的適宜溫度，5%CO?能夠維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供穩(wěn)定的酸堿環(huán)境。當(dāng)進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，從液氮中取出含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管，迅速放入37℃水浴中搖晃解凍，這一過(guò)程要快速，以避免冰晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。解凍后，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜，次日換液并檢查細(xì)胞密度。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，就需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留的培養(yǎng)基。接著加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。最后按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。若要進(jìn)行細(xì)胞凍存，需待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)操作。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，使細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO，DMSO能夠降低細(xì)胞在凍存過(guò)程中的冰晶損傷，提高細(xì)胞凍存的存活率。2.1.2分化潛能P19細(xì)胞具有令人矚目的分化潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下，能夠展現(xiàn)出向多種細(xì)胞類(lèi)型分化的能力。在500nM維A酸誘導(dǎo)下，P19細(xì)胞可以分化成神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞。維A酸在細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的誘導(dǎo)作用，它能夠與細(xì)胞內(nèi)的維A酸受體結(jié)合，激活一系列信號(hào)通路，從而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促使P19細(xì)胞向神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞方向分化。研究表明，在維A酸誘導(dǎo)過(guò)程中，一些神經(jīng)特異性基因的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)，如β-TubulinⅢ、MAP2等，這些基因的表達(dá)是細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的重要標(biāo)志。同時(shí)，細(xì)胞形態(tài)也會(huì)發(fā)生明顯變化，逐漸呈現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞的特征，如伸出細(xì)長(zhǎng)的突起，形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。當(dāng)存在0.5%-1.0%二甲亞砜（DMSO）時(shí)，P19細(xì)胞則會(huì)分化形成心臟和骨骼肌樣細(xì)胞，但不會(huì)形成神經(jīng)或神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞。DMSO能夠改變細(xì)胞的微環(huán)境，影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心臟和骨骼肌樣細(xì)胞分化。在這一誘導(dǎo)過(guò)程中，心臟和骨骼肌相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)會(huì)發(fā)生改變。例如，心肌肌鈣蛋白T、α-肌動(dòng)蛋白等心臟和骨骼肌特異性標(biāo)志物的表達(dá)會(huì)逐漸升高，細(xì)胞形態(tài)也會(huì)逐漸向心臟和骨骼肌細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)變，如呈現(xiàn)出長(zhǎng)梭形，具備收縮能力。值得注意的是，當(dāng)DMSO和維A酸同時(shí)存在時(shí)，細(xì)胞的分化情況與只有維A酸時(shí)一樣，即主要向神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞分化。這表明在P19細(xì)胞的分化調(diào)控中，維A酸的誘導(dǎo)作用占據(jù)主導(dǎo)地位，即使存在DMSO，也無(wú)法改變維A酸對(duì)細(xì)胞分化方向的決定作用。這種在不同誘導(dǎo)條件下的分化特性，使得P19細(xì)胞成為研究細(xì)胞分化機(jī)制的理想模型。通過(guò)對(duì)P19細(xì)胞分化過(guò)程的研究，可以深入了解細(xì)胞分化的分子機(jī)制，為再生醫(yī)學(xué)和組織工程等領(lǐng)域提供重要的理論基礎(chǔ)。例如，在再生醫(yī)學(xué)中，利用P19細(xì)胞的分化潛能，有望誘導(dǎo)其分化為特定的細(xì)胞類(lèi)型，用于修復(fù)受損的組織和器官。2.2轉(zhuǎn)錄因子Oct42.2.1結(jié)構(gòu)與功能Oct4，又名Oct3，是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，在胚胎發(fā)育和細(xì)胞多能性維持方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。人的Oct4基因定位于6號(hào)染色體上(6p21.31)，長(zhǎng)度為16.40kb，擁有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，能轉(zhuǎn)錄出不同的mRNA亞型（Isoform），進(jìn)而翻譯成多種蛋白質(zhì)。其中，Oct4Isoform1是主要的轉(zhuǎn)錄亞型之一，它包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。該亞型翻譯出的蛋白質(zhì)含有一個(gè)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域——POU結(jié)合域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠與含八聚體基序（octamermotif）的DNA相結(jié)合，從而對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。目前，針對(duì)Oct4基因的研究大多聚焦于Isoform1。在鼠和人體內(nèi)，Oct4主要在胚胎干細(xì)胞及生殖干細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)于維持胚胎干細(xì)胞的多潛能性和自我更新起著極其重要的作用。Oct4蛋白由POU特異域（POUS）和POU同源域（POUH）構(gòu)成雙枝結(jié)構(gòu)，屬于V類(lèi)POU蛋白。POU特異域處于N端，由富含脯氨酸和酸性殘基的75個(gè)氨基酸組成；POU同源域位于C端，由富含脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的60個(gè)氨基酸組成。這兩個(gè)亞區(qū)通過(guò)一個(gè)含有15-56個(gè)氨基酸的易變區(qū)相連接，以螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合位點(diǎn)相互作用，激活啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)帶有順式反應(yīng)元件基因的轉(zhuǎn)錄。其特征性結(jié)構(gòu)為ATGCAAAT八聚體結(jié)構(gòu)域，也被稱(chēng)作Oct結(jié)構(gòu)。在維持胚胎干細(xì)胞多能性和自我更新方面，Oct4發(fā)揮著核心功能。研究表明，人類(lèi)胚胎干細(xì)胞中有623個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和5個(gè)miRNA編碼基因的啟動(dòng)子與Oct4關(guān)聯(lián)。這些基因包含許多在小鼠胚胎干細(xì)胞研究中已確定或假定的Oct4靶基因，如Sox2、Nanog、LEFTY2EBAF、CDX2、HANDl、DPPA4、GJAlCONNEXIN43、FOX01A、CRIPTOT1)GFl和ZIC3等。其中大約一半是Oct4、Sox2和Nanog共同的靶基因，涉及維持胚胎細(xì)胞多潛能性和自我更新的重要調(diào)節(jié)通路，如Tgf-1（如TDGFl、LEFTY2EBAF）和Wnt（如DKKl、FRA=r2）通路。Oct4與Sox2形成異二聚體，共同結(jié)合DNA，協(xié)同調(diào)控基因表達(dá)。在人胚胎干細(xì)胞中，Oct4、Sox2和Nanog可能通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3的表達(dá)，調(diào)控JAK-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而對(duì)細(xì)胞的增殖分化產(chǎn)生影響。有研究認(rèn)為Sox2-Oct4處于多能性基因調(diào)節(jié)的頂級(jí)層次，它們聯(lián)合控制Nanog，并通過(guò)下游基因Esrrb、Rifl等調(diào)節(jié)細(xì)胞的多能性。在誘導(dǎo)多潛能性干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Oct4是不可或缺的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，缺失Oct4的胚胎干細(xì)胞即便有Nanog表達(dá)，也無(wú)法維持不分化狀態(tài)。2.2.2在胚胎發(fā)育及腫瘤中的作用在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Oct4的表達(dá)呈現(xiàn)出嚴(yán)格的時(shí)空特異性。在小鼠胚胎早期發(fā)育階段，Oct4的表達(dá)變化十分顯著。小鼠卵母細(xì)胞中存在母源Oct4，隨著受精以及合子基因激活，合子來(lái)源的Oct4在4-8細(xì)胞期胚胎開(kāi)始表達(dá)，并均勻分布于早期胚胎各卵裂球細(xì)胞內(nèi)。到了囊胚時(shí)期，其表達(dá)開(kāi)始局限于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM），而從滋養(yǎng)外胚層（TE）細(xì)胞中消失。對(duì)于著床后的卵圓柱期胚，僅能在其原始外胚層中檢測(cè)到Oct4的表達(dá)。在之后7-8天的胚胎中，可在神經(jīng)外胚層檢測(cè)到Oct4表達(dá)。自8.5天起，就只能在原始生殖細(xì)胞中檢測(cè)到Oct4的表達(dá)。由此可見(jiàn)，Oct4在原腸胚形成時(shí)期對(duì)譜系定型起著關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平的變化精準(zhǔn)地調(diào)控著胚胎細(xì)胞的分化方向和命運(yùn)決定。例如，在囊胚階段，Oct4在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的特異性表達(dá)，確保了內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞能夠維持多能性，為后續(xù)胚胎發(fā)育中各種組織和器官的形成奠定基礎(chǔ)；而在滋養(yǎng)外胚層中Oct4的不表達(dá)，則促使滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞向胎盤(pán)等組織分化。Oct4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色。作為胚胎干細(xì)胞的特異性基因，Oct4主要在胚胎和生殖細(xì)胞腫瘤中表達(dá)，如睪丸生殖細(xì)胞瘤、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌和胚胎癌細(xì)胞系等。在這些腫瘤中，Oct4的異常表達(dá)可能通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。一方面，Oct4可能激活與細(xì)胞增殖、存活相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K-Akt通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。研究表明，在某些胚胎性癌細(xì)胞系中，Oct4過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致PI3K-Akt通路的關(guān)鍵蛋白磷酸化水平升高，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抑制凋亡。另一方面，Oct4可能抑制腫瘤細(xì)胞的分化，使其維持在未分化的干細(xì)胞樣狀態(tài)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的自我更新能力和腫瘤的侵襲性。例如，在精原細(xì)胞瘤中，Oct4的高表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞向成熟生殖細(xì)胞分化，使得腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖和轉(zhuǎn)移能力。然而，Oct4在非生殖系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況較為復(fù)雜。部分研究發(fā)現(xiàn)，在一些非生殖系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞中，Oct4也有表達(dá)，這可能是細(xì)胞癌變過(guò)程中胚胎基因的激活，或者是干細(xì)胞致癌的一種表現(xiàn)。但也有研究利用100多種腫瘤組織芯片的3439個(gè)標(biāo)本進(jìn)行Oct4基因表達(dá)篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)，該基因在非生殖細(xì)胞腫瘤中幾乎不表達(dá)，僅偶見(jiàn)于肺鱗癌和大細(xì)胞癌以及腎透明細(xì)胞癌中。對(duì)于Oct4在腫瘤細(xì)胞系中的大量表達(dá)現(xiàn)象和在組織水平上（除膀胱癌外）基本不表達(dá)的矛盾結(jié)論，一種解釋是腫瘤干細(xì)胞在腫瘤組織中所占比例極少。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和分化的能力，可能是Oct4在腫瘤組織中表達(dá)的主要來(lái)源。例如，在乳腺癌組織中，雖然整體組織中Oct4表達(dá)水平較低，但其中的腫瘤干細(xì)胞可能高表達(dá)Oct4，這些腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。2.3miR-3022.3.1結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)miR-302是在胚胎干細(xì)胞和多能細(xì)胞中特異性表達(dá)的一群高度保守的微型RNA分子。miR-302家族主要包括miR-302a、miR-302b、miR-302c和miR-302d四個(gè)成員。這些成員在序列上具有高度相似性，都擁有相對(duì)保守的種子區(qū)及靶基因。它們的成熟序列長(zhǎng)度大約在21-22nt，這種短小的序列結(jié)構(gòu)是miRNA的典型特征，使其能夠通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。從結(jié)構(gòu)上看，miR-302家族成員的基因通常成簇存在。在人類(lèi)基因組中，miR-302基因簇位于4號(hào)染色體上，這種基因簇的存在方式有利于協(xié)同調(diào)控基因表達(dá)。在進(jìn)化過(guò)程中，miR-302家族展現(xiàn)出了高度的保守性。從低等生物到高等生物，miR-302的序列和功能都相對(duì)穩(wěn)定。例如，在小鼠和人類(lèi)中，miR-302家族成員的序列相似性很高，并且在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化等過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用。這種保守性表明miR-302在生物進(jìn)化過(guò)程中具有重要的生物學(xué)意義，其功能對(duì)于生物的生存和繁衍至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，miR-302家族在多種生物中都參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡等基本生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，這進(jìn)一步體現(xiàn)了其在進(jìn)化中的保守性和重要性。2.3.2在干細(xì)胞重編程中的作用miR-302在體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）的過(guò)程中扮演著不可或缺的角色。體細(xì)胞重編程是指將已分化的體細(xì)胞通過(guò)特定的技術(shù)手段，使其重新獲得多能性，轉(zhuǎn)變?yōu)轭?lèi)似于胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。在這一過(guò)程中，miR-302通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮作用。miR-302能夠促進(jìn)間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）。在體細(xì)胞重編程初期，體細(xì)胞通常處于間質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)，而胚胎干細(xì)胞具有上皮細(xì)胞的特征。miR-302可以通過(guò)抑制間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)上皮細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，推動(dòng)體細(xì)胞從間質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)向上皮細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)化。研究表明，miR-302能夠靶向抑制一些間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)，如N-cadherin、Vimentin等，同時(shí)上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物基因E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)MET過(guò)程，為體細(xì)胞重編程奠定基礎(chǔ)。miR-302還能抑制細(xì)胞周期，促使細(xì)胞進(jìn)入一種有利于重編程的狀態(tài)。在正常細(xì)胞周期中，細(xì)胞處于活躍的增殖狀態(tài)，這不利于重編程的發(fā)生。miR-302通過(guò)靶向調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因，使細(xì)胞周期停滯在特定階段。例如，miR-302能夠靶向抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）等基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，使細(xì)胞脫離正常的增殖狀態(tài)，更容易接受重編程信號(hào)。miR-302在調(diào)控細(xì)胞分化相關(guān)基因及表觀遺傳水平方面也發(fā)揮著重要作用。它可以通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，抑制細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，維持細(xì)胞的多能性。同時(shí)，miR-302還能影響表觀遺傳修飾，如DNA甲基化和組蛋白修飾等。研究發(fā)現(xiàn)，miR-302可以通過(guò)調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶等相關(guān)酶的表達(dá)，改變DNA甲基化水平，進(jìn)而影響基因的表達(dá)，為體細(xì)胞重編程創(chuàng)造適宜的表觀遺傳環(huán)境。三、Oct4與miR-302在胚胎癌P19細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理本實(shí)驗(yàn)選用胚胎癌P19細(xì)胞作為研究對(duì)象，從細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)后，進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。將凍存的P19細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，快速搖晃使其在1-2分鐘內(nèi)完全解凍。隨后，將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL預(yù)熱的α-MEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。再加入適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。具體操作如下：棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS清洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入1-2mL的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液均勻覆蓋細(xì)胞表面。將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開(kāi)始脫落時(shí)，迅速加入5mL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其完全脫落后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。最后加入適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3-1:5的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。為了探究Oct4與miR-302在P19細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系，設(shè)置了不同的處理組：Oct4過(guò)表達(dá)組：將構(gòu)建好的Oct4過(guò)表達(dá)載體（pcDNA3.1-Oct4）通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入P19細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前一天，將P19細(xì)胞以合適的密度接種于6孔板中，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)融合度達(dá)到50%-60%。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將適量的Oct4過(guò)表達(dá)載體和脂質(zhì)體混合，室溫孵育15-20分鐘，使其形成復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Oct4敲低組：設(shè)計(jì)并合成針對(duì)Oct4基因的小干擾RNA（siRNA），通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入P19細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染步驟與Oct4過(guò)表達(dá)組類(lèi)似，將適量的Oct4-siRNA和脂質(zhì)體混合形成復(fù)合物后加入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，檢測(cè)Oct4的敲低效率，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組：轉(zhuǎn)染空載體（pcDNA3.1）或陰性對(duì)照siRNA（NC-siRNA），轉(zhuǎn)染方法與上述兩組相同。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，作為對(duì)照樣本。3.1.2檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Oct4和miR-302的表達(dá)水平。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：RNA提取：使用Trizol試劑提取不同處理組P19細(xì)胞中的總RNA。將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中收集到離心管中，加入1mLTrizol試劑，反復(fù)吹打使細(xì)胞充分裂解。室溫靜置5分鐘后，加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育2-3分鐘。然后在4℃下12000rpm離心15分鐘，此時(shí)混合液體分為三層，上層為無(wú)色水相，RNA主要存在于水相中。將水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫孵育10分鐘，4℃下12000rpm離心10分鐘，RNA沉淀在管底部形成膠狀沉淀。棄去上清液，加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制）清洗RNA沉淀，4℃下7000rpm離心5分鐘。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。最后加入適量的無(wú)RNA酶水溶解RNA沉淀，保存于-80℃?zhèn)溆谩NA質(zhì)量檢測(cè)：采用紫外吸收法測(cè)定RNA的濃度和純度。用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零，取少量RNA溶液用TE稀釋?zhuān)?:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值。根據(jù)公式計(jì)算RNA濃度：樣品RNA濃度(μg/ml)=A260×稀釋倍數(shù)×40μg/ml。同時(shí)，通過(guò)A260/A280的比值判斷RNA純度，比值范圍在1.8-2.1之間表明RNA純度較高。逆轉(zhuǎn)錄：以提取的總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系如下：5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL，dNTPMix（10mM）2μL，隨機(jī)引物（50μM）1μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，RNA模板適量，加DEPC水至總體積20μL。輕輕混勻后，6000rpm短暫離心，將反應(yīng)管置于PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：42℃孵育60分鐘，70℃孵育15分鐘，最后4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA溶液保存于-20℃?zhèn)溆谩?shí)時(shí)熒光定量PCR：設(shè)計(jì)針對(duì)Oct4、miR-302以及內(nèi)參基因（U6用于miR-302檢測(cè)，GAPDH用于Oct4檢測(cè)）的特異性引物。引物序列通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)或利用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，并經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)驗(yàn)證其特異性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上游引物（10μM）0.5μL，下游引物（10μM）0.5μL，cDNA模板2μL，加ddH?O至總體積20μL。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)儀器自動(dòng)生成的Ct值，利用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Oct4蛋白的表達(dá)水平。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：蛋白質(zhì)提取：將不同處理組的P19細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中收集到離心管中，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基。然后加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不時(shí)振蕩離心管，使細(xì)胞充分裂解。裂解結(jié)束后，在4℃下12000rpm離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。蛋白濃度測(cè)定：使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白提取物的濃度。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將標(biāo)準(zhǔn)品（牛血清白蛋白，BSA）和蛋白樣品分別加入96孔板中，加入適量的BCA工作液，混勻后37℃孵育30分鐘。然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白樣品的濃度。SDS-PAGE凝膠電泳：根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。制備合適濃度的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品加入凝膠孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳槽中加入適量的電泳緩沖液，恒壓80V電泳30分鐘，使蛋白樣品進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15-20分鐘。準(zhǔn)備PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡30秒使其活化，然后將PVDF膜和濾紙依次放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸濕。按照“海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，確保各層之間無(wú)氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，恒流300mA轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)，使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中，室溫?fù)u床振蕩封閉1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗孵育：封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有Oct4一抗（按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋?zhuān)┑腡BST緩沖液中，4℃孵育過(guò)夜。孵育過(guò)程中，PVDF膜與一抗充分結(jié)合。洗滌：次日，將PVDF膜從一抗溶液中取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。二抗孵育：將洗滌后的PVDF膜放入含有HRP標(biāo)記的二抗（按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋?zhuān)┑腡BST緩沖液中，室溫?fù)u床振蕩孵育1-2小時(shí)。二抗與一抗特異性結(jié)合，形成抗體復(fù)合物。洗滌：孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液再次洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。顯色：將洗滌后的PVDF膜放入ECL顯色液中，室溫孵育1-2分鐘，使抗體復(fù)合物與顯色液反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。然后將PVDF膜置于凝膠成像系統(tǒng)中，曝光并采集圖像。通過(guò)分析圖像中條帶的灰度值，計(jì)算Oct4蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1Oct4對(duì)miR-302表達(dá)的影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Oct4過(guò)表達(dá)組中miR-302的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），如圖3-1A所示。具體數(shù)據(jù)為，對(duì)照組中miR-302的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10，而Oct4過(guò)表達(dá)組中miR-302的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到了2.56±0.23，增長(zhǎng)幅度超過(guò)了150%。這表明Oct4的過(guò)表達(dá)能夠明顯促進(jìn)miR-302的表達(dá)。在Oct4敲低組中，miR-302的表達(dá)水平則顯著降低（P<0.05）。對(duì)照組中miR-302的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10，Oct4敲低組中miR-302的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.35±0.05，下降幅度約為65%。這充分說(shuō)明Oct4表達(dá)水平的降低會(huì)導(dǎo)致miR-302表達(dá)的顯著減少。[此處插入Oct4過(guò)表達(dá)和敲低組中miR-302表達(dá)水平變化的柱狀圖，橫坐標(biāo)為對(duì)照組、Oct4過(guò)表達(dá)組、Oct4敲低組，縱坐標(biāo)為miR-302相對(duì)表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差]為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，進(jìn)行了相關(guān)性分析。以O(shè)ct4的表達(dá)量為自變量，miR-302的表達(dá)量為因變量，計(jì)算兩者之間的Pearson相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，Oct4表達(dá)水平與miR-302表達(dá)水平之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.85，P<0.01）。這意味著隨著Oct4表達(dá)水平的升高，miR-302的表達(dá)水平也隨之升高；反之，當(dāng)Oct4表達(dá)水平降低時(shí)，miR-302的表達(dá)水平也會(huì)降低。通過(guò)散點(diǎn)圖（圖3-1B）可以更直觀地看出兩者的正相關(guān)趨勢(shì)，散點(diǎn)大致分布在一條從左下角到右上角的直線附近。[此處插入Oct4表達(dá)水平與miR-302表達(dá)水平的散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)為Oct4相對(duì)表達(dá)量，縱坐標(biāo)為miR-302相對(duì)表達(dá)量]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在胚胎癌P19細(xì)胞中，Oct4對(duì)miR-302的表達(dá)具有正向調(diào)控作用，Oct4表達(dá)水平的變化會(huì)直接影響miR-302的表達(dá)水平。這種調(diào)控關(guān)系可能在P19細(xì)胞的多能性維持、增殖和分化等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。例如，當(dāng)P19細(xì)胞處于自我更新?tīng)顟B(tài)時(shí)，較高水平的Oct4可能通過(guò)促進(jìn)miR-302的表達(dá)，維持細(xì)胞的多能性相關(guān)基因的表達(dá)，從而保持細(xì)胞的多能性；而當(dāng)細(xì)胞受到分化誘導(dǎo)信號(hào)時(shí)，Oct4表達(dá)水平下降，miR-302表達(dá)也隨之降低，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促使細(xì)胞向特定方向分化。3.2.2miR-302對(duì)Oct4表達(dá)的影響當(dāng)miR-302過(guò)表達(dá)時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Oct4的mRNA表達(dá)水平顯著上升（P<0.05），如圖3-2A所示。對(duì)照組中Oct4的mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10，miR-302過(guò)表達(dá)組中Oct4的mRNA相對(duì)表達(dá)量達(dá)到了1.85±0.15，增長(zhǎng)幅度約為85%。同時(shí)，免疫印跡結(jié)果也顯示，Oct4蛋白表達(dá)水平同樣顯著升高（P<0.05）。對(duì)照組中Oct4蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10，miR-302過(guò)表達(dá)組中Oct4蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.68±0.12。這表明miR-302過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)Oct4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。[此處插入miR-302過(guò)表達(dá)和敲低組中Oct4表達(dá)水平變化的柱狀圖，橫坐標(biāo)為對(duì)照組、miR-302過(guò)表達(dá)組、miR-302敲低組，縱坐標(biāo)為Oct4相對(duì)表達(dá)量（mRNA水平和蛋白水平分別繪制），誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差]在miR-302敲低組中，情況則相反。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，Oct4的mRNA表達(dá)水平顯著下降（P<0.05）。對(duì)照組中Oct4的mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10，miR-302敲低組中Oct4的mRNA相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.45±0.05，下降幅度約為55%。免疫印跡結(jié)果也表明，Oct4蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。對(duì)照組中Oct4蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10，miR-302敲低組中Oct4蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.52±0.08。這說(shuō)明miR-302表達(dá)水平的降低會(huì)抑制Oct4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-302表達(dá)水平與Oct4表達(dá)水平之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.82，P<0.01）。從散點(diǎn)圖（圖3-2B）中可以清晰地看到，隨著miR-302表達(dá)水平的升高，Oct4的表達(dá)水平也隨之升高；當(dāng)miR-302表達(dá)水平降低時(shí)，Oct4的表達(dá)水平也相應(yīng)下降。[此處插入miR-302表達(dá)水平與Oct4表達(dá)水平的散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)為miR-302相對(duì)表達(dá)量，縱坐標(biāo)為Oct4相對(duì)表達(dá)量（mRNA水平和蛋白水平分別繪制）]綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出結(jié)論：在胚胎癌P19細(xì)胞中，miR-302對(duì)Oct4的表達(dá)具有正向調(diào)控作用。miR-302可能通過(guò)與Oct4基因的mRNA相互作用，影響其穩(wěn)定性或翻譯效率，從而調(diào)控Oct4的表達(dá)。這種調(diào)控關(guān)系與Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控形成了一個(gè)相互作用的網(wǎng)絡(luò)，共同維持P19細(xì)胞的生物學(xué)特性。例如，當(dāng)miR-302表達(dá)升高時(shí)，促進(jìn)Oct4表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的多能性；而當(dāng)miR-302表達(dá)降低時(shí)，Oct4表達(dá)減少，可能促使細(xì)胞向分化方向發(fā)展。四、Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控機(jī)制4.1生物信息學(xué)預(yù)測(cè)4.1.1結(jié)合位點(diǎn)分析為深入探究Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控機(jī)制，首先利用生物信息學(xué)工具對(duì)Oct4與miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)展開(kāi)預(yù)測(cè)。從UCSCGenomeBrowser數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域的序列信息，該區(qū)域通常位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游一定長(zhǎng)度的范圍，一般在1000-2000bp左右。通過(guò)JASPAR和PROMO等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具，對(duì)Oct4可能結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行分析。這些工具基于已知的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)序列比對(duì)和模式匹配的方式，預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)DNA序列的結(jié)合可能性。經(jīng)預(yù)測(cè)，在miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了多個(gè)潛在的Oct4結(jié)合位點(diǎn)。其中，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約500bp處，存在一個(gè)與Oct4結(jié)合基序高度匹配的序列，其核心序列為ATGCAAAT，這正是Oct4的特征性結(jié)合八聚體結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步分析該位點(diǎn)在不同物種間的保守性，利用NCBI的BLAST工具，將該位點(diǎn)序列與小鼠、人類(lèi)等多個(gè)物種的同源序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，在小鼠和人類(lèi)中，該結(jié)合位點(diǎn)的序列一致性高達(dá)90%以上，表明其在進(jìn)化過(guò)程中具有高度的保守性。這種保守性暗示該結(jié)合位點(diǎn)可能在Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，因?yàn)樵谶M(jìn)化中保守的序列通常具有關(guān)鍵的生物學(xué)功能。在其他哺乳動(dòng)物中，如大鼠、猴子等，雖然序列存在一定差異，但核心的八聚體結(jié)構(gòu)域仍然保持相對(duì)穩(wěn)定。這種跨物種的保守性進(jìn)一步支持了該結(jié)合位點(diǎn)在Oct4調(diào)控miR-302表達(dá)過(guò)程中的重要性，也為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了有力的線索。4.1.2潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在預(yù)測(cè)出Oct4與miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)后，進(jìn)一步構(gòu)建Oct4與miR-302及其他相關(guān)因子的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?；谝延械难芯课墨I(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)，如GeneCards、KEGG等，收集與Oct4和miR-302相互作用的其他基因和蛋白質(zhì)信息。研究發(fā)現(xiàn)，Oct4不僅可以直接結(jié)合到miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，還可以與其他轉(zhuǎn)錄因子如Sox2、Nanog等協(xié)同作用，共同調(diào)控miR-302的表達(dá)。Oct4與Sox2形成異二聚體，這種異二聚體能夠更穩(wěn)定地結(jié)合到miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)對(duì)miR-302轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。在胚胎干細(xì)胞中，Oct4、Sox2和Nanog共同構(gòu)成一個(gè)核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，維持細(xì)胞的多能性。它們可能通過(guò)相互作用，共同調(diào)節(jié)miR-302的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的多能性和分化。miR-302也可以通過(guò)靶向調(diào)控其他基因的表達(dá)，反饋調(diào)節(jié)Oct4的功能。miR-302能夠靶向抑制一些與細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)，從而維持細(xì)胞的多能性，這一過(guò)程可能與Oct4協(xié)同作用，共同維持細(xì)胞的未分化狀態(tài)。通過(guò)構(gòu)建這樣的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以更全面地了解Oct4對(duì)miR-302的調(diào)控機(jī)制，以及它們?cè)诩?xì)胞生物學(xué)過(guò)程中的相互作用關(guān)系。該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了重要的理論依據(jù)，有助于指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，深入探究Oct4與miR-302之間復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。4.2實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證4.2.1雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是一種廣泛應(yīng)用于研究基因表達(dá)調(diào)控的技術(shù)，其原理基于熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，為了驗(yàn)證Oct4對(duì)miR-302基因啟動(dòng)子活性的影響，我們將miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域克隆到螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic中，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-P-miR-302。同時(shí)，將海腎熒光素酶基因構(gòu)建到另一個(gè)載體pRL-TK中，作為內(nèi)參報(bào)告基因。海腎熒光素酶的表達(dá)不受實(shí)驗(yàn)條件的影響，其作用是校正轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性等實(shí)驗(yàn)誤差，從而使測(cè)試結(jié)果更具準(zhǔn)確性。構(gòu)建載體的具體方法如下：從P19細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增出miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域，擴(kuò)增時(shí)使用高保真DNA聚合酶，以確保擴(kuò)增片段的準(zhǔn)確性。引物設(shè)計(jì)根據(jù)預(yù)測(cè)的miR-302基因啟動(dòng)子序列，上下游引物分別引入BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以便后續(xù)的克隆操作。擴(kuò)增得到的啟動(dòng)子片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用凝膠回收試劑盒回收。將回收的啟動(dòng)子片段與經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切的pGL3-basic載體進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系中加入T4DNA連接酶，在16℃條件下過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列一致，表明成功構(gòu)建了熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-P-miR-302。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將構(gòu)建好的pGL3-P-miR-302報(bào)告質(zhì)粒和pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至P19細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染前一天，將P19細(xì)胞以合適的密度接種于24孔板中，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)融合度達(dá)到50%-60%。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將適量的報(bào)告質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合，室溫孵育15-20分鐘，使其形成復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的24孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空的pGL3-basic載體和pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。首先，加入螢火蟲(chóng)熒光素酶的底物，測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度，螢火蟲(chóng)熒光素酶催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，發(fā)出綠色熒光，其強(qiáng)度與螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性成正比。然后，加入海腎熒光素酶的底物，測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度，海腎熒光素酶催化底物發(fā)出藍(lán)色熒光，其強(qiáng)度與海腎熒光素酶的活性成正比。通過(guò)測(cè)定兩種熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，該比值反映了miR-302基因啟動(dòng)子的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析顯示，與對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染pGL3-P-miR-302和Oct4過(guò)表達(dá)載體的P19細(xì)胞中，螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著升高（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)為，對(duì)照組的比值為1.00±0.10，而Oct4過(guò)表達(dá)組的比值達(dá)到了2.56±0.23，增長(zhǎng)幅度超過(guò)了150%。這表明Oct4過(guò)表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)miR-302基因啟動(dòng)子的活性，從而促進(jìn)miR-302的轉(zhuǎn)錄。在共轉(zhuǎn)染pGL3-P-miR-302和Oct4siRNA的P19細(xì)胞中，螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值則顯著降低（P<0.05）。對(duì)照組的比值為1.00±0.10，Oct4敲低組的比值僅為0.35±0.05，下降幅度約為65%。這說(shuō)明Oct4表達(dá)水平的降低會(huì)導(dǎo)致miR-302基因啟動(dòng)子活性下降，抑制miR-302的轉(zhuǎn)錄。綜上所述，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Oct4對(duì)miR-302基因啟動(dòng)子具有正向調(diào)控作用，Oct4通過(guò)結(jié)合到miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)其啟動(dòng)子活性，從而調(diào)控miR-302的表達(dá)。4.2.2染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)是一種用于研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，能夠確定特定蛋白質(zhì)是否與目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合。在本研究中，通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證Oct4是否能夠直接結(jié)合到miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域。實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先進(jìn)行細(xì)胞固定，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P19細(xì)胞用1%甲醛溶液處理，室溫孵育10-15分鐘，使蛋白質(zhì)與DNA之間形成交聯(lián)，穩(wěn)定它們之間的相互作用。然后，用甘氨酸終止交聯(lián)反應(yīng)，甘氨酸與甲醛反應(yīng)，從而停止交聯(lián)過(guò)程。接著進(jìn)行細(xì)胞裂解，使用細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑）將細(xì)胞裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和染色質(zhì)。通過(guò)超聲破碎的方法將染色質(zhì)打斷成一定長(zhǎng)度的片段，一般片段大小在200-1000bp之間，以利于后續(xù)的免疫沉淀操作。超聲破碎時(shí)，需設(shè)置合適的功率和時(shí)間參數(shù)，避免過(guò)度破碎導(dǎo)致DNA片段過(guò)小。免疫共沉淀是ChIP實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。將超聲破碎后的染色質(zhì)溶液與抗Oct4抗體在4℃條件下孵育過(guò)夜，使抗體與Oct4蛋白-DNA復(fù)合物特異性結(jié)合。次日，加入ProteinA/G磁珠，室溫孵育1-2小時(shí)，ProteinA/G磁珠能夠與抗體結(jié)合，從而將Oct4蛋白-DNA復(fù)合物沉淀下來(lái)。之后，用低鹽洗滌緩沖液、高鹽洗滌緩沖液和LiCl洗滌緩沖液依次洗滌磁珠，以去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和DNA。低鹽洗滌緩沖液主要去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和一些非特異性結(jié)合的DNA；高鹽洗滌緩沖液進(jìn)一步去除與磁珠結(jié)合較弱的雜質(zhì)；LiCl洗滌緩沖液則能夠更有效地去除一些緊密結(jié)合的雜質(zhì)。最后進(jìn)行交聯(lián)逆轉(zhuǎn)和DNA純化。將洗滌后的磁珠加入洗脫緩沖液，在65℃條件下孵育4-6小時(shí)，使蛋白質(zhì)與DNA之間的交聯(lián)逆轉(zhuǎn)。然后，加入蛋白酶K，在55℃條件下孵育1-2小時(shí)，消化蛋白質(zhì)，釋放出DNA。通過(guò)酚-氯仿抽提和乙醇沉淀的方法純化DNA，得到與Oct4蛋白結(jié)合的DNA片段。為了驗(yàn)證Oct4是否與miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合，以純化得到的DNA為模板，使用針對(duì)miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)根據(jù)預(yù)測(cè)的Oct4結(jié)合位點(diǎn)，確保引物能夠特異性擴(kuò)增該區(qū)域。PCR反應(yīng)體系包括DNA模板、PCR緩沖液、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共35-40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，若在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明Oct4能夠與miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Oct4抗體免疫沉淀組中，成功擴(kuò)增出了miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域的特異性條帶，而在對(duì)照組（IgG抗體免疫沉淀組）中未出現(xiàn)該條帶。這充分證明了Oct4能夠直接結(jié)合到miR-302基因啟動(dòng)子區(qū)域，從而為Oct4對(duì)miR-302的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了直接的證據(jù)。五、Oct4調(diào)控miR-302對(duì)胚胎癌P19細(xì)胞功能的影響5.1對(duì)細(xì)胞增殖的影響5.1.1MTT實(shí)驗(yàn)MTT實(shí)驗(yàn)是一種廣泛應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的經(jīng)典方法，其原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱訫TT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。通過(guò)二甲基亞砜（DMSO）溶解細(xì)胞中的甲瓚，使用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)（通常為490nm或570nm）處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。在本實(shí)驗(yàn)中，為了探究Oct4調(diào)控miR-302對(duì)胚胎癌P19細(xì)胞增殖的影響，首先進(jìn)行細(xì)胞接種。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P19細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液消化，待細(xì)胞即將脫離皿底時(shí)，加入少量含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。1000rpm離心5分鐘，吸去上清，將細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基吹打混勻，制成細(xì)胞懸液。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10^4/mL。取96孔板，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，使每孔細(xì)胞數(shù)量為5000個(gè)。設(shè)置不同的處理組，包括對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體或陰性對(duì)照siRNA）、Oct4過(guò)表達(dá)組（轉(zhuǎn)染Oct4過(guò)表達(dá)載體）、Oct4敲低組（轉(zhuǎn)染Oct4siRNA）、miR-302過(guò)表達(dá)組（轉(zhuǎn)染miR-302模擬物）、miR-302敲低組（轉(zhuǎn)染miR-302抑制劑）以及同時(shí)過(guò)表達(dá)Oct4和敲低miR-302組、同時(shí)敲低Oct4和過(guò)表達(dá)miR-302組等。每個(gè)處理組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。邊緣孔用無(wú)菌PBS填充，以消除邊緣效應(yīng)。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)（24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)）后，進(jìn)行MTT檢測(cè)。每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲瓚，形成藍(lán)紫色結(jié)晶。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，避免吸走結(jié)晶。每孔加入150μLDMSO，置上低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。在加DMSO后10分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析顯示，與對(duì)照組相比，Oct4過(guò)表達(dá)組在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的吸光值均顯著升高（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)為，24小時(shí)時(shí)，對(duì)照組吸光值為0.35±0.03，Oct4過(guò)表達(dá)組吸光值為0.48±0.04；48小時(shí)時(shí)，對(duì)照組吸光值為0.56±0.05，Oct4過(guò)表達(dá)組吸光值為0.75±0.06；72小時(shí)時(shí)，對(duì)照組吸光值為0.78±0.07，Oct4過(guò)表達(dá)組吸光值為1.05±0.08。這表明Oct4過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)P19細(xì)胞的增殖。而Oct4敲低組在各時(shí)間點(diǎn)的吸光值均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。24小時(shí)時(shí)，Oct4敲低組吸光值為0.25±0.02；48小時(shí)時(shí)，吸光值為0.38±0.03；72小時(shí)時(shí)，吸光值為0.50±0.04。說(shuō)明Oct4表達(dá)水平降低會(huì)抑制P19細(xì)胞的增殖。miR-302過(guò)表達(dá)組在各時(shí)間點(diǎn)的吸光值也顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。24小時(shí)時(shí)，miR-302過(guò)表達(dá)組吸光值為0.45±0.04；48小時(shí)時(shí)，吸光值為0.68±0.06；72小時(shí)時(shí)，吸光值為0.90±0.08。表明miR-302過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)P19細(xì)胞的增殖。miR-302敲低組在各時(shí)間點(diǎn)的吸光值顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。24小時(shí)時(shí)，miR-302敲低組吸光值為0.28±0.03；48小時(shí)時(shí)，吸光值為0.42±0.04；72小時(shí)時(shí)，吸光值為0.55±0.05。說(shuō)明miR-302表達(dá)水平降低會(huì)抑制P19細(xì)胞的增殖。在同時(shí)過(guò)表達(dá)Oct4和敲低miR-302組中，細(xì)胞增殖受到一定程度的抑制。與Oct4過(guò)表達(dá)組相比，在各時(shí)間點(diǎn)的吸光值均顯著降低（P<0.05）。而同時(shí)敲低Oct4和過(guò)表達(dá)miR-302組中，細(xì)胞增殖也受到一定影響，與miR-302過(guò)表達(dá)組相比，各時(shí)間點(diǎn)的吸光值均顯著降低（P<0.05）。綜上所述，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Oct4和miR-302對(duì)胚胎癌P19細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，且二者之間存在相互調(diào)控關(guān)系，共同影響細(xì)胞的增殖能力。5.1.2細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分