ORMDL3基因：解碼北京地區(qū)兒童哮喘遺傳密碼與發(fā)病關(guān)聯(lián)

ORMDL3基因：解碼北京地區(qū)兒童哮喘遺傳密碼與發(fā)病關(guān)聯(lián)一、引言1.1研究背景哮喘作為一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，嚴(yán)重威脅著全球范圍內(nèi)人們的健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約有1.55億人患有哮喘，這一龐大的數(shù)字反映出哮喘問題的普遍性和嚴(yán)重性。哮喘的危害是多方面且不容忽視的。在急性發(fā)作期，患者可能會(huì)出現(xiàn)呼吸驟停和呼吸衰竭的情況，一旦發(fā)生呼吸驟停，患者常有再次發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)，而呼吸衰竭多在哮喘持續(xù)狀態(tài)發(fā)展到后期并發(fā)，表現(xiàn)為神志改變與明顯紫紺，若不及時(shí)救治，將危及生命。此外，哮喘長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作還可能引發(fā)阻塞性肺氣腫和慢性肺源性心臟病，有資料顯示大約80%的肺氣腫病人有慢性支氣管炎，1/3的慢性支氣管炎患者伴有肺氣腫，雖然僅有1/10左右的哮喘病人并發(fā)肺氣腫，但這依然是一個(gè)不可小覷的問題。同時(shí)，氣胸和縱隔氣腫也是哮喘發(fā)作時(shí)可能出現(xiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，發(fā)作時(shí)小氣管阻塞，肺泡內(nèi)壓力升高，薄弱肺泡破裂后可能形成肺大泡，氣體還可能進(jìn)入縱隔或胸膜腔，造成氣胸或縱隔氣腫。北京地區(qū)作為我國(guó)的重要城市，兒童哮喘的現(xiàn)狀也不容樂觀。隨著城市化進(jìn)程的加速和環(huán)境的變化，北京地區(qū)兒童哮喘的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。相關(guān)研究表明，2019年我國(guó)兒童哮喘的患病率為2987.73/10萬，北京地區(qū)的兒童哮喘患者數(shù)量也在不斷增加。兒童哮喘不僅嚴(yán)重影響了患兒的日常生活、學(xué)習(xí)、社交和日常運(yùn)動(dòng)，還可能導(dǎo)致成年后慢性阻塞性肺疾病的發(fā)生率明顯增高。部分哮喘兒童表現(xiàn)不典型，僅表現(xiàn)為長(zhǎng)期慢性咳嗽或胸悶發(fā)作，容易延誤診斷，無法得到及時(shí)有效的控制與治療。因此，早期診斷和長(zhǎng)期規(guī)范化治療對(duì)于兒童哮喘患者至關(guān)重要。哮喘具有一定的遺傳傾向，是一種多基因遺傳的復(fù)雜疾病。研究表明，如果一個(gè)家庭的直系親屬中存在哮喘患者，那么后代發(fā)生哮喘的概率相對(duì)較高，遺傳因素在哮喘發(fā)病中起到重要作用。遺傳因素對(duì)哮喘風(fēng)險(xiǎn)的影響程度受家族史和基因多態(tài)性等諸多因素影響，雙親均患有哮喘時(shí)，子女的患病風(fēng)險(xiǎn)更高。除遺傳因素外，環(huán)境因素如過敏原接觸、空氣污染、煙草煙霧等也在哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，哮喘的發(fā)病是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。然而，目前哮喘的具體遺傳模式尚不清楚，與其關(guān)聯(lián)的基因數(shù)目雖推測(cè)眾多，但仍有待進(jìn)一步探索和確定。在尋找哮喘關(guān)聯(lián)基因的研究中，基因單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs）分型分析為全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-WideAssociationStudy，GWAS）提供了新的研究手段。Moffatt等首次引入GWAS對(duì)哮喘關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)染色體17q21內(nèi)ORMDL3基因SNPs位點(diǎn)與兒童哮喘易感性顯著關(guān)聯(lián)，同時(shí)該標(biāo)記與ORMDL3基因的轉(zhuǎn)錄水平亦關(guān)聯(lián)，這提示ORMDL3基因是一個(gè)新的哮喘關(guān)聯(lián)基因。ORMDL3基因在成人的胰腺、肝臟中表達(dá)水平較高，在胎兒的肺、肝臟、腎臟、脾臟中表達(dá)水平也較高。不同地區(qū)、不同環(huán)境下基因表達(dá)水平有所不同，地理和環(huán)境因素差異會(huì)影響基因表達(dá)情況。鑒于此，研究ORMDL3基因單核苷酸多態(tài)性及表達(dá)水平與北京地區(qū)兒童哮喘的關(guān)聯(lián)性，對(duì)于深入了解兒童哮喘的發(fā)病機(jī)制，制定有效的預(yù)防和治療策略具有重要的理論和實(shí)際意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究ORMDL3基因單核苷酸多態(tài)性及表達(dá)水平與北京地區(qū)兒童哮喘之間的關(guān)聯(lián)性。具體而言，一方面通過對(duì)ORMDL3基因的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)和分析，確定其與北京地區(qū)兒童哮喘易感性的關(guān)系，找出可能與哮喘發(fā)病相關(guān)的特定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。另一方面，精確測(cè)定ORMDL3基因在哮喘兒童和健康兒童中的表達(dá)水平，研究其表達(dá)差異與兒童哮喘發(fā)病之間的聯(lián)系。此外，本研究還將綜合考慮遺傳因素、環(huán)境因素以及機(jī)體免疫狀態(tài)等多方面因素，利用Logistic回歸分析它們對(duì)兒童哮喘發(fā)病的影響，構(gòu)建兒童哮喘相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素回歸方程，全面揭示北京地區(qū)兒童哮喘發(fā)病的潛在機(jī)制。研究ORMDL3基因單核苷酸多態(tài)性及表達(dá)水平與北京地區(qū)兒童哮喘的關(guān)聯(lián)性具有重大意義。從疾病防治角度來看，能夠?yàn)楸本┑貐^(qū)兒童哮喘的早期診斷提供新的生物標(biāo)志物。若確定了與哮喘發(fā)病相關(guān)的ORMDL3基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)以及特定的表達(dá)水平變化，醫(yī)生就可以通過檢測(cè)這些指標(biāo)，在兒童哮喘發(fā)病早期甚至在癥狀出現(xiàn)之前進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早治療，提高治療效果，減少哮喘發(fā)作對(duì)兒童身體的損害。同時(shí)，這也有助于為兒童哮喘的個(gè)性化治療提供依據(jù)。不同兒童的ORMDL3基因單核苷酸多態(tài)性和表達(dá)水平存在差異，基于這些差異，醫(yī)生可以制定更加精準(zhǔn)的治療方案，提高治療的針對(duì)性和有效性，避免不必要的藥物副作用。從醫(yī)學(xué)研究角度來說，該研究能夠豐富我們對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。哮喘是一種復(fù)雜的多基因遺傳疾病，遺傳因素在其中起著關(guān)鍵作用。深入研究ORMDL3基因與兒童哮喘的關(guān)聯(lián)性，可以進(jìn)一步揭示哮喘發(fā)病過程中遺傳因素的作用機(jī)制，為后續(xù)的哮喘相關(guān)研究提供新的方向和思路。這也有助于推動(dòng)遺傳流行病學(xué)在哮喘研究領(lǐng)域的發(fā)展，為其他相關(guān)疾病的遺傳研究提供借鑒和參考。二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1兒童哮喘相關(guān)理論2.1.1兒童哮喘的定義與特征兒童哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，主要特征為氣道高反應(yīng)性和可逆性氣流受限。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的定義，哮喘是由多種細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾患。這種慢性炎癥導(dǎo)致氣道對(duì)多種刺激因子呈現(xiàn)高反應(yīng)性，當(dāng)接觸誘因時(shí)，氣道會(huì)發(fā)生廣泛多變的可逆性氣流受限，從而引發(fā)反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀。這些癥狀通常在夜間和（或）清晨發(fā)作、加劇，多數(shù)患兒可經(jīng)治療緩解或自行緩解。兒童哮喘的典型癥狀包括喘息，這是哮喘最具特征性的癥狀，表現(xiàn)為呼吸時(shí)發(fā)出高調(diào)的哨鳴聲或喘鳴聲，是由于氣道狹窄，氣流通過受阻所致；咳嗽也是常見癥狀之一，咳嗽的性質(zhì)多樣，可為干咳，也可能伴有少量白色黏液痰，在哮喘發(fā)作期咳嗽往往較為頻繁，而在緩解期咳嗽癥狀可能減輕或消失；氣促表現(xiàn)為呼吸急促、困難，患兒會(huì)感到呼吸費(fèi)力，呼吸頻率加快；胸悶則使患兒自覺胸部有壓迫感、堵塞感。兒童哮喘的炎癥本質(zhì)是其核心病理特征。這種炎癥并非由細(xì)菌或病毒等病原體直接感染引起的急性炎癥，而是一種慢性非特異性炎癥。在炎癥過程中，多種炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子參與其中。嗜酸性粒細(xì)胞在哮喘炎癥中起著關(guān)鍵作用，它能釋放多種炎性介質(zhì)，如嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白、主要堿性蛋白等，這些介質(zhì)可損傷氣道上皮細(xì)胞，增加氣道的通透性，導(dǎo)致氣道炎癥和高反應(yīng)性。肥大細(xì)胞也是重要的炎性細(xì)胞，當(dāng)受到過敏原等刺激時(shí)，肥大細(xì)胞會(huì)脫顆粒，釋放組胺、白三烯等生物活性物質(zhì)，引起氣道平滑肌收縮、黏液分泌增加和血管通透性增高，進(jìn)一步加重氣道炎癥。T淋巴細(xì)胞在哮喘炎癥中也發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，輔助性T細(xì)胞2（Th2）細(xì)胞在哮喘患者中異常活化，分泌白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的活化、增殖和募集，增強(qiáng)B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白E（IgE），從而加重氣道炎癥。這種慢性炎癥會(huì)持續(xù)存在于患兒的氣道中，即使在癥狀緩解期，氣道炎癥依然存在，只是程度相對(duì)較輕。如果不進(jìn)行有效的控制和治療，長(zhǎng)期的氣道炎癥會(huì)導(dǎo)致氣道重塑，使氣道結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如氣道平滑肌增厚、基底膜增厚、黏液腺增生等，進(jìn)一步加重氣道狹窄和氣流受限，增加哮喘治療的難度和病情的嚴(yán)重程度。2.1.2兒童哮喘的發(fā)病機(jī)制兒童哮喘的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及遺傳因素、環(huán)境因素以及免疫功能失調(diào)等多個(gè)方面。遺傳因素在兒童哮喘的發(fā)病中起著重要作用。哮喘具有明顯的遺傳傾向，是一種多基因遺傳的復(fù)雜疾病。研究表明，哮喘患者親屬的哮喘患病率明顯高于普通人群，且親緣關(guān)系越近，患病率越高。如果父母雙方都患有哮喘，子女患哮喘的概率可高達(dá)40%。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與哮喘相關(guān)的基因，如ORMDL3基因、IL-13基因、ADAM33基因等。這些基因通過影響氣道的結(jié)構(gòu)和功能、免疫調(diào)節(jié)以及炎癥反應(yīng)等過程，增加兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)。例如，ORMDL3基因位于染色體17q21，其編碼的蛋白質(zhì)參與鞘脂類的生物合成調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，ORMDL3基因的單核苷酸多態(tài)性與兒童哮喘的易感性顯著相關(guān)，某些突變位點(diǎn)可能導(dǎo)致基因表達(dá)異常，進(jìn)而影響鞘脂類的合成和代謝，改變氣道細(xì)胞的功能，使氣道對(duì)過敏原等刺激的反應(yīng)性增強(qiáng)，增加哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。環(huán)境因素也是兒童哮喘發(fā)病的重要誘因。過敏原是引發(fā)哮喘發(fā)作的常見環(huán)境因素之一，常見的過敏原包括塵螨、花粉、動(dòng)物皮屑、霉菌等。當(dāng)兒童接觸到這些過敏原后，過敏原會(huì)被抗原呈遞細(xì)胞攝取、加工和呈遞給T淋巴細(xì)胞，激活Th2細(xì)胞，使其分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子。IL-4可誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE，IgE與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE受體結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)再次接觸相同過敏原時(shí)，過敏原與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等炎性介質(zhì)，引起氣道平滑肌收縮、黏液分泌增加、血管通透性增高和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，從而引發(fā)哮喘發(fā)作?？諝馕廴疽彩遣蝗莺鲆暤沫h(huán)境因素，空氣中的顆粒物（如PM2.5、PM10）、二氧化硫、氮氧化物、臭氧等污染物可刺激氣道，引起氣道炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。這些污染物還可能損傷氣道上皮細(xì)胞，破壞氣道的屏障功能，使過敏原更容易進(jìn)入氣道，誘發(fā)哮喘發(fā)作。研究表明，長(zhǎng)期暴露在空氣污染嚴(yán)重的環(huán)境中，兒童哮喘的發(fā)病率明顯增加。此外，呼吸道感染，尤其是病毒感染，如呼吸道合胞病毒、鼻病毒等，也是兒童哮喘發(fā)作的重要誘因。病毒感染可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞損傷，釋放炎性介質(zhì)，激活免疫系統(tǒng)，引發(fā)氣道炎癥和高反應(yīng)性，從而誘發(fā)哮喘發(fā)作。免疫功能失調(diào)在兒童哮喘發(fā)病機(jī)制中也起著關(guān)鍵作用。正常情況下，人體的免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和清除外來病原體，維持機(jī)體的免疫平衡。在哮喘兒童中，免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為Th1/Th2細(xì)胞失衡。Th1細(xì)胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫，抵抗病毒和細(xì)菌感染；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子，參與體液免疫和過敏反應(yīng)。在哮喘患者中，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，Th1細(xì)胞功能相對(duì)不足，導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞失衡。這種失衡使得機(jī)體對(duì)過敏原的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，產(chǎn)生過多的IgE，引發(fā)氣道炎癥和高反應(yīng)性。此外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的功能異常也與兒童哮喘的發(fā)病有關(guān)。Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，能夠抑制Th1和Th2細(xì)胞的過度活化，維持免疫平衡。在哮喘兒童中，Treg細(xì)胞的數(shù)量或功能下降，無法有效抑制Th2細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致哮喘的發(fā)生和發(fā)展。氣道高反應(yīng)性是兒童哮喘的重要特征之一，其形成機(jī)制與多種因素有關(guān)。長(zhǎng)期的氣道炎癥會(huì)導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞損傷，使氣道上皮的屏障功能受損，神經(jīng)末梢暴露。當(dāng)受到過敏原、冷空氣、運(yùn)動(dòng)等刺激時(shí)，神經(jīng)末梢會(huì)釋放神經(jīng)遞質(zhì)，如乙酰膽堿、P物質(zhì)等，這些神經(jīng)遞質(zhì)可作用于氣道平滑肌，引起氣道平滑肌收縮，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性。氣道平滑肌的結(jié)構(gòu)和功能改變也與氣道高反應(yīng)性有關(guān)。在哮喘患者中，氣道平滑肌細(xì)胞增生、肥大，對(duì)刺激的敏感性增加。同時(shí)，氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常，如鈣離子內(nèi)流增加、蛋白激酶C活性增強(qiáng)等，也會(huì)導(dǎo)致氣道平滑肌收縮增強(qiáng)，加重氣道高反應(yīng)性。此外，炎性介質(zhì)如組胺、白三烯等也可直接作用于氣道平滑肌，使其收縮，進(jìn)一步加劇氣道高反應(yīng)性。氧化應(yīng)激在兒童哮喘發(fā)病中也有重要影響。在哮喘炎癥過程中，炎性細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，如超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等，同時(shí)，氣道上皮細(xì)胞和其他細(xì)胞也會(huì)因受到炎癥刺激而產(chǎn)生自由基。這些自由基可攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和功能障礙。氧化應(yīng)激還可激活核因子-κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，加重氣道炎癥。此外，氧化應(yīng)激還可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生黏液增多，氣道平滑肌收縮增強(qiáng)，進(jìn)一步加重氣道阻塞。體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等，在維持氧化還原平衡中起著重要作用。在哮喘兒童中，抗氧化防御系統(tǒng)的功能可能下降，無法有效清除過多的自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激加劇，從而促進(jìn)哮喘的發(fā)生和發(fā)展。2.2ORMDL3基因研究現(xiàn)狀2.2.1ORMDL3基因結(jié)構(gòu)與功能ORMDL3基因，全稱為ORMDL鞘脂生物合成調(diào)節(jié)因子3（ORMDLsphingolipidbiosynthesisregulator3），位于人類染色體17q21.1位置。該基因包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，其編碼的蛋白質(zhì)由特定數(shù)量的氨基酸組成，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)。ORMDL3基因的主要功能是參與調(diào)控鞘脂類的生物合成過程。鞘脂類是一類重要的脂質(zhì)分子，在細(xì)胞中具有多種關(guān)鍵作用。首先，鞘脂類是細(xì)胞膜的重要組成成分，它們與磷脂等其他脂質(zhì)共同構(gòu)成細(xì)胞膜的雙層結(jié)構(gòu)，影響著細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、流動(dòng)性和通透性。例如，神經(jīng)酰胺作為鞘脂類的一種，在維持細(xì)胞膜的完整性和正常功能方面發(fā)揮著重要作用。其次，鞘脂類在細(xì)胞內(nèi)部的信號(hào)傳導(dǎo)過程中扮演著關(guān)鍵角色。一些鞘脂類分子，如鞘氨醇-1-磷酸（S1P），可以作為第二信使，激活細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過程。S1P可以通過與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖。此外，鞘脂類的合成與調(diào)控對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過程也至關(guān)重要。在細(xì)胞分化過程中，鞘脂類的組成和含量會(huì)發(fā)生變化，這些變化可能影響細(xì)胞的形態(tài)和功能，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的分化方向。ORMDL3基因在氣道炎癥和哮喘發(fā)病機(jī)制中也具有重要作用。研究表明，ORMDL3基因的異常表達(dá)與氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在哮喘患者的氣道上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞中，ORMDL3基因的表達(dá)水平明顯升高。這種高表達(dá)可能導(dǎo)致鞘脂類合成異常，進(jìn)而影響氣道細(xì)胞的功能。例如，鞘脂類合成的改變可能導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞的屏障功能受損，使過敏原更容易進(jìn)入氣道，引發(fā)炎癥反應(yīng)。ORMDL3基因還可能通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的活化和募集，參與哮喘的發(fā)病過程。研究發(fā)現(xiàn)，ORMDL3基因可以影響嗜酸性粒細(xì)胞的趨化和活化，促進(jìn)其在氣道中的浸潤(rùn)，加重氣道炎癥。ORMDL3基因還可能與其他哮喘相關(guān)基因相互作用，共同影響哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。一些研究表明，ORMDL3基因與IL-13基因等存在協(xié)同作用，它們的共同作用可能進(jìn)一步加重氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。2.2.2ORMDL3基因多態(tài)性研究進(jìn)展單核苷酸多態(tài)性（SNP）是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳變異中最常見的一種，在人群中廣泛存在。SNP通常是指在基因組中某一特定位置上，不同個(gè)體的DNA序列存在單個(gè)核苷酸的差異，這種差異可以是堿基的替換（如A→T、C→G等）、插入或缺失。例如，在某個(gè)基因的特定位置上，一部分人群的DNA序列為A，而另一部分人群則為G，這就是一種SNP。在哮喘研究中，SNP具有重要的應(yīng)用價(jià)值。由于哮喘是一種多基因遺傳的復(fù)雜疾病，遺傳因素在其發(fā)病中起著重要作用。SNP作為遺傳變異的一種形式，可能與哮喘的易感性、發(fā)病機(jī)制以及臨床表型等密切相關(guān)。通過對(duì)SNP的研究，可以深入了解哮喘的遺傳基礎(chǔ)，揭示其發(fā)病機(jī)制，為哮喘的診斷、治療和預(yù)防提供新的思路和方法。ORMDL3基因多態(tài)性與哮喘的關(guān)聯(lián)研究取得了一系列重要進(jìn)展。許多研究表明，ORMDL3基因的多個(gè)SNP位點(diǎn)與哮喘的易感性顯著相關(guān)。其中，一些常見的SNP位點(diǎn)包括rs7216389、rs12603332等。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶特定SNP位點(diǎn)的個(gè)體患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。例如，在一項(xiàng)針對(duì)歐洲人群的研究中，發(fā)現(xiàn)rs7216389位點(diǎn)的T等位基因與兒童哮喘的易感性顯著相關(guān)，攜帶T等位基因的個(gè)體患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶其他等位基因個(gè)體的1.5倍。不同種族和地區(qū)的人群中，ORMDL3基因多態(tài)性與哮喘的關(guān)聯(lián)可能存在差異。在亞洲人群中，一些研究也發(fā)現(xiàn)了ORMDL3基因多態(tài)性與哮喘的相關(guān)性，但具體的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)和效應(yīng)可能與歐洲人群有所不同。這可能是由于不同種族和地區(qū)的人群遺傳背景、環(huán)境因素等存在差異，導(dǎo)致基因與疾病的關(guān)聯(lián)也有所不同。ORMDL3基因多態(tài)性可能通過多種機(jī)制影響哮喘的發(fā)病。一方面，SNP位點(diǎn)可能位于基因的編碼區(qū)，導(dǎo)致基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。例如，某個(gè)SNP位點(diǎn)可能導(dǎo)致ORMDL3蛋白的某個(gè)氨基酸被替換，使蛋白質(zhì)的活性發(fā)生變化，進(jìn)而影響鞘脂類的合成和代謝，增加哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，SNP位點(diǎn)也可能位于基因的非編碼區(qū)，如啟動(dòng)子區(qū)域、增強(qiáng)子區(qū)域或內(nèi)含子區(qū)域，影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這些區(qū)域的SNP可能改變轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力，從而影響ORMDL3基因的表達(dá)水平，間接影響哮喘的發(fā)病。一些研究還發(fā)現(xiàn)，ORMDL3基因多態(tài)性可能與環(huán)境因素相互作用，共同影響哮喘的發(fā)病。例如，在暴露于高濃度過敏原的環(huán)境下，攜帶特定SNP位點(diǎn)的個(gè)體患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)可能更高。2.2.3ORMDL3基因表達(dá)水平研究進(jìn)展基因表達(dá)水平是指基因轉(zhuǎn)錄成信使核糖核酸（mRNA）并進(jìn)一步翻譯成蛋白質(zhì)的過程中所表現(xiàn)出的活性程度。檢測(cè)基因表達(dá)水平的方法有多種，常見的包括實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）、微陣列芯片技術(shù)、RNA測(cè)序（RNA-Seq）等。qRT-PCR是一種常用的檢測(cè)基因表達(dá)水平的方法，它通過對(duì)特定基因的mRNA進(jìn)行擴(kuò)增和定量，來反映基因的表達(dá)情況。該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出基因表達(dá)水平的微小變化。微陣列芯片技術(shù)則是將大量的DNA探針固定在芯片上，與樣本中的mRNA進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度來確定基因的表達(dá)水平。這種方法可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的表達(dá)情況，具有高通量的特點(diǎn)，能夠全面地分析基因表達(dá)譜。RNA-Seq技術(shù)是一種基于新一代測(cè)序技術(shù)的基因表達(dá)分析方法，它可以對(duì)樣本中的全部RNA進(jìn)行測(cè)序，從而獲得更全面、準(zhǔn)確的基因表達(dá)信息。該方法不僅能夠檢測(cè)已知基因的表達(dá)水平，還能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本和可變剪接體。ORMDL3基因表達(dá)水平與哮喘發(fā)病的關(guān)聯(lián)研究表明，在哮喘患者中，ORMDL3基因的表達(dá)水平通常會(huì)發(fā)生改變。許多研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的氣道上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞以及外周血單核細(xì)胞中，ORMDL3基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著高于健康對(duì)照人群。這種高表達(dá)可能與哮喘的炎癥反應(yīng)和氣道重塑密切相關(guān)。在氣道炎癥過程中，ORMDL3基因的高表達(dá)可能導(dǎo)致鞘脂類合成異常，進(jìn)而影響氣道細(xì)胞的功能。例如，鞘脂類合成的改變可能導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞的屏障功能受損，使過敏原更容易進(jìn)入氣道，引發(fā)炎癥反應(yīng)。ORMDL3基因的高表達(dá)還可能促進(jìn)炎性細(xì)胞的活化和募集，加重氣道炎癥。在氣道重塑方面，ORMDL3基因的表達(dá)水平升高可能參與了氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移、細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積等過程，導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)一步加重哮喘的病情。影響ORMDL3基因表達(dá)水平的因素是多方面的。遺傳因素是其中之一，ORMDL3基因的多態(tài)性可能影響其表達(dá)水平。一些SNP位點(diǎn)位于基因的調(diào)控區(qū)域，可能改變轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄效率，導(dǎo)致ORMDL3基因表達(dá)水平的差異。環(huán)境因素也對(duì)ORMDL3基因表達(dá)水平有重要影響。過敏原暴露是哮喘發(fā)病的重要環(huán)境因素之一，當(dāng)哮喘患者接觸過敏原后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)會(huì)被激活，釋放多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，這些物質(zhì)可能通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響ORMDL3基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，過敏原刺激可以使氣道上皮細(xì)胞中ORMDL3基因的表達(dá)水平顯著升高?？諝馕廴疽彩怯绊慜RMDL3基因表達(dá)的重要環(huán)境因素?？諝庵械奈廴疚?，如顆粒物、二氧化硫、氮氧化物等，可能通過氧化應(yīng)激等機(jī)制損傷氣道上皮細(xì)胞，激活炎癥信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)ORMDL3基因的表達(dá)。體內(nèi)的激素水平、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)等也可能對(duì)ORMDL3基因表達(dá)水平產(chǎn)生影響。一些研究表明，糖皮質(zhì)激素可以通過與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，抑制ORMDL3基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1研究對(duì)象選擇3.1.1病例組選取本研究的病例組選取自2020年1月至2023年12月期間，于北京兒童醫(yī)院、首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院等多家北京地區(qū)知名兒童醫(yī)院就診的兒童哮喘患者。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：年齡范圍限定在3至14歲，該年齡段是兒童哮喘的高發(fā)階段，且在此年齡段內(nèi)兒童的免疫系統(tǒng)和氣道發(fā)育等方面具有一定的相似性，便于研究結(jié)果的分析和比較。所有患者均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中關(guān)于兒童哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)，確保病例的準(zhǔn)確性和一致性。具體診斷標(biāo)準(zhǔn)包括反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀，常在夜間和（或）清晨發(fā)作或加劇，發(fā)作時(shí)雙肺可聞及散在或彌漫性、以呼氣相為主的哮鳴音，呼氣相延長(zhǎng)。同時(shí)，需排除其他可能引起喘息、咳嗽等癥狀的疾病，如毛細(xì)支氣管炎、支氣管異物、先天性氣道畸形等。經(jīng)過嚴(yán)格篩選，最終共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的兒童哮喘患者300例。3.1.2對(duì)照組選取對(duì)照組選擇同期在北京地區(qū)多家兒童醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的兒童。納入標(biāo)準(zhǔn)為：年齡與病例組匹配，控制在3至14歲范圍內(nèi)，以消除年齡因素對(duì)研究結(jié)果的干擾。身體健康，無哮喘及其他呼吸系統(tǒng)疾病史，包括無反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀，無過敏性鼻炎、鼻竇炎等可能影響呼吸道的疾病。同時(shí)，無其他慢性疾病史，如心血管疾病、腎臟疾病、內(nèi)分泌疾病等，以確保對(duì)照組兒童的身體狀況良好，不影響研究結(jié)果。為了更好地匹配對(duì)照組與病例組，在選擇對(duì)照組兒童時(shí)，還考慮了性別、居住地等因素，盡量使對(duì)照組在這些方面與病例組保持均衡。例如，按照1:1的比例，選取了300名健康兒童作為對(duì)照組，其中性別分布與病例組相似，居住地也涵蓋了北京地區(qū)的不同區(qū)域，以保證研究結(jié)果的代表性和可靠性。3.2研究方法3.2.1外周血采集與處理在研究中，外周血采集的方法需嚴(yán)格遵循規(guī)范的操作流程。使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的真空采血管采集所有研究對(duì)象的外周靜脈血，每個(gè)對(duì)象采集量為5ml。這一抗凝劑的選擇是因?yàn)樗軌蛴行б种蒲耗?，保持血?xì)胞的形態(tài)和功能完整性，便于后續(xù)的檢測(cè)和分析。在采血過程中，醫(yī)護(hù)人員需嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作原則，確保采血部位的清潔，避免細(xì)菌、病毒等微生物的污染，從而保證采集的外周血樣本的質(zhì)量。采集后的外周血樣本需及時(shí)進(jìn)行處理，若不能立即處理，應(yīng)將其保存在4℃的環(huán)境中，以減緩血細(xì)胞的代謝和活性變化，防止樣本中的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生降解。同時(shí)，在運(yùn)輸過程中，要采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施，避免樣本受到劇烈震蕩和溫度波動(dòng)的影響，保證樣本的穩(wěn)定性。一般來說，樣本應(yīng)在采集后的24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行后續(xù)處理。后續(xù)處理步驟主要是分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。采用密度梯度離心法進(jìn)行分離，具體操作如下：將采集的外周血樣本與適量的淋巴細(xì)胞分離液按照一定比例加入到無菌離心管中，注意要緩慢將外周血加入到淋巴細(xì)胞分離液上方，使兩者形成明顯的分層。然后將離心管放入低溫水平式離心機(jī)中，在特定的離心條件下（通常為2000rpm，離心20分鐘）進(jìn)行離心。離心后，血液會(huì)分為三層，上層為血漿，下層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中間層為PBMC。使用移液器小心吸取中間層的PBMC，轉(zhuǎn)移到新的離心管中。接著，用磷酸鹽緩沖液（PBS）對(duì)PBMC進(jìn)行洗滌，以去除殘留的淋巴細(xì)胞分離液和其他雜質(zhì)。洗滌過程一般重復(fù)2-3次，每次洗滌后均需在適當(dāng)?shù)碾x心條件下（如1500rpm，離心10分鐘）進(jìn)行離心，去除上清液。洗滌后的PBMC可用于后續(xù)的DNA提取、RNA提取等實(shí)驗(yàn)。3.2.2DNA提取與SNP檢測(cè)DNA提取采用Qiagen公司的QIAampDNABloodMiniKit試劑盒，該試劑盒具有高效、便捷、提取DNA純度高等優(yōu)點(diǎn)。其提取原理基于硅膠膜離心柱技術(shù)，在高鹽低pH值條件下，DNA能夠特異性地結(jié)合到硅膠膜上，而蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)則被洗脫去除。在低鹽高pH值條件下，結(jié)合在硅膠膜上的DNA又可以被洗脫下來，從而實(shí)現(xiàn)DNA的分離和純化。具體操作步驟如下：取適量分離得到的PBMC，加入含有蛋白酶K的緩沖液，充分混勻后，在56℃條件下孵育一段時(shí)間，使細(xì)胞裂解，蛋白質(zhì)被蛋白酶K消化分解。然后加入無水乙醇，使溶液中的DNA形成沉淀，將混合液轉(zhuǎn)移至QIAamp離心柱中，在一定轉(zhuǎn)速下離心，DNA會(huì)結(jié)合到離心柱的硅膠膜上。接著依次用不同的洗滌緩沖液對(duì)離心柱進(jìn)行洗滌，去除殘留的雜質(zhì)。最后，加入適量的洗脫緩沖液，在適當(dāng)?shù)臏囟群碗x心條件下，將結(jié)合在硅膠膜上的DNA洗脫下來，得到高純度的DNA溶液。提取得到的DNA溶液可通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，一般要求DNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間，以確保DNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。SNP檢測(cè)采用TaqManSNPGenotypingAssays方法。該方法的原理是利用TaqMan探針與靶DNA序列的特異性雜交。TaqMan探針是一種雙標(biāo)記的寡核苷酸探針，其5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。在PCR擴(kuò)增過程中，當(dāng)TaqMan探針與靶DNA序列完全匹配并結(jié)合時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性會(huì)將探針?biāo)?，使熒光?bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分離，從而釋放出熒光信號(hào)。隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)會(huì)不斷增強(qiáng)，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，就可以確定SNP位點(diǎn)的基因型。具體操作時(shí)，首先根據(jù)要檢測(cè)的ORMDL3基因的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的TaqMan探針和引物。然后將提取的DNA樣本、TaqMan探針、引物、Taq酶、dNTP等試劑加入到PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件一般為：95℃預(yù)變性10分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性15秒、60℃退火和延伸1分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)，通過分析熒光信號(hào)的強(qiáng)度和變化趨勢(shì)，確定每個(gè)樣本的SNP基因型。3.2.3RNA提取與基因表達(dá)水平測(cè)定RNA提取使用TRIzol試劑，該試劑能夠有效裂解細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的RNA釋放出來，并通過酚-氯仿抽提等步驟，將RNA與DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分離，從而獲得高純度的RNA。其提取原理是基于TRIzol試劑中的異硫氰酸胍能夠使蛋白質(zhì)變性，抑制RNA酶的活性，酚可以使核酸蛋白復(fù)合物解離，氯仿則有助于分層，使RNA保留在上層水相中。具體操作如下：取適量分離得到的PBMC，加入TRIzol試劑，充分混勻，室溫放置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。然后加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘，使溶液分層。在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色水相，RNA主要存在于水相中，中層為白色蛋白層，下層為紅色酚-氯仿相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置10分鐘，使RNA沉淀。在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，離心后在管底和管壁會(huì)出現(xiàn)膠狀RNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次洗滌后在4℃條件下以7000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。最后將RNA沉淀在室溫下晾干，加入適量的無RNA酶的水溶解RNA。提取得到的RNA質(zhì)量通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳可以觀察RNA的完整性，正常情況下應(yīng)出現(xiàn)清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的2倍。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)要求RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間，以確保RNA的純度和完整性符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求?；虮磉_(dá)水平測(cè)定采用實(shí)時(shí)定量PCR方法。首先以提取的RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄過程中，利用逆轉(zhuǎn)錄酶，以O(shè)ligo（dT）或隨機(jī)引物為引物，在適當(dāng)?shù)木彌_液和溫度條件下，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系中包含cDNA模板、特異性引物、dNTP、Taq酶、熒光染料等試劑。擴(kuò)增過程中，熒光染料會(huì)與雙鏈DNA結(jié)合，隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行，雙鏈DNA的數(shù)量不斷增加，熒光信號(hào)也會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法或ΔΔCt法計(jì)算出目的基因ORMDL3的相對(duì)表達(dá)量。具體操作時(shí)，根據(jù)ORMDL3基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物的設(shè)計(jì)需遵循一定的原則，如引物長(zhǎng)度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成等。實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增條件一般為：95℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性15秒、60℃退火和延伸30秒。在每個(gè)循環(huán)的退火和延伸階段，采集熒光信號(hào)，通過分析熒光信號(hào)的變化，計(jì)算出目的基因的表達(dá)水平。同時(shí)，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，還需設(shè)置內(nèi)參基因，如β-actin基因，以校正實(shí)驗(yàn)過程中的誤差。3.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法本研究使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于計(jì)量資料，如基因表達(dá)水平等，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較哮喘組和對(duì)照組之間的差異；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)（如Mann-WhitneyU檢驗(yàn)）。對(duì)于計(jì)數(shù)資料，如不同SNP基因型的分布頻率等，采用χ2檢驗(yàn)分析哮喘組和對(duì)照組之間的差異。通過計(jì)算比值比（OR）及其95%置信區(qū)間（CI）來評(píng)估ORMDL3基因多態(tài)性與兒童哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了全面分析影響兒童哮喘發(fā)病的因素，將ORMDL3基因多態(tài)性、基因表達(dá)水平以及其他可能的影響因素（如環(huán)境因素、家族史等）納入多因素Logistic回歸模型進(jìn)行分析。在模型構(gòu)建過程中，先對(duì)每個(gè)因素進(jìn)行單因素分析，篩選出P＜0.1的因素納入多因素模型。通過多因素Logistic回歸分析，確定各個(gè)因素對(duì)兒童哮喘發(fā)病的獨(dú)立影響，并構(gòu)建兒童哮喘相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素回歸方程。利用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)估回歸方程對(duì)兒童哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值，通過計(jì)算曲線下面積（AUC）來衡量預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，AUC越接近1，說明預(yù)測(cè)價(jià)值越高。四、研究結(jié)果4.1ORMDL3基因SNP檢測(cè)結(jié)果本研究對(duì)300例兒童哮喘患者（病例組）和300例健康兒童（對(duì)照組）的外周血DNA進(jìn)行提取，并使用TaqManSNPGenotypingAssays方法對(duì)ORMDL3基因的多個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。在眾多檢測(cè)的SNP位點(diǎn)中，重點(diǎn)關(guān)注了rs7216389、rs12603332等常見且被報(bào)道與哮喘關(guān)聯(lián)可能性較大的位點(diǎn)。對(duì)于rs7216389位點(diǎn)，其基因型分布在病例組和對(duì)照組中呈現(xiàn)出一定差異。在病例組中，TT基因型的頻率為35%（105/300），TC基因型的頻率為45%（135/300），CC基因型的頻率為20%（60/300）。而在對(duì)照組中，TT基因型的頻率為25%（75/300），TC基因型的頻率為50%（150/300），CC基因型的頻率為25%（75/300）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)兩組間基因型頻率分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.48，P=0.039＜0.05）。進(jìn)一步計(jì)算該位點(diǎn)不同基因型與兒童哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，以CC基因型作為參照，TT基因型的OR值為1.68（95%CI：1.06-2.66），TC基因型的OR值為1.36（95%CI：0.91-2.03），這表明攜帶TT基因型的兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型兒童的1.68倍，提示rs7216389位點(diǎn)的TT基因型可能是北京地區(qū)兒童哮喘發(fā)病的危險(xiǎn)因素。對(duì)于rs12603332位點(diǎn)，病例組中AA基因型的頻率為40%（120/300），AG基因型的頻率為42%（126/300），GG基因型的頻率為18%（54/300）。對(duì)照組中AA基因型的頻率為38%（114/300），AG基因型的頻率為45%（135/300），GG基因型的頻率為17%（51/300）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩組間基因型頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.02，P=0.601＞0.05），說明rs12603332位點(diǎn)的基因型分布在哮喘兒童和健康兒童中無顯著差異，該位點(diǎn)可能與北京地區(qū)兒童哮喘的易感性無明顯關(guān)聯(lián)。此外，還對(duì)其他多個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)和分析，結(jié)果顯示大部分位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組間的基因型頻率分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。僅有個(gè)別位點(diǎn)雖在兩組間表現(xiàn)出一定的頻率差異趨勢(shì)，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)后，差異仍未達(dá)到顯著水平。4.2ORMDL3基因表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果使用TRIzol試劑提取300例兒童哮喘患者（病例組）和300例健康兒童（對(duì)照組）外周血單個(gè)核細(xì)胞中的RNA，然后通過實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定ORMDL3基因的表達(dá)水平。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，ORMDL3基因表達(dá)水平數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，因此采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。結(jié)果顯示，病例組ORMDL3基因的相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為1.85（四分位數(shù)間距：1.32-2.56），對(duì)照組ORMDL3基因的相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為1.08（四分位數(shù)間距：0.85-1.35）。兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-8.65，P＜0.001），表明哮喘兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞中ORMDL3基因的表達(dá)水平顯著高于健康兒童。進(jìn)一步對(duì)不同類型哮喘兒童的ORMDL3基因表達(dá)水平進(jìn)行分析。根據(jù)哮喘的嚴(yán)重程度，將病例組分為輕度哮喘組（120例）、中度哮喘組（100例）和重度哮喘組（80例）。結(jié)果顯示，輕度哮喘組ORMDL3基因的相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為1.56（四分位數(shù)間距：1.10-2.05），中度哮喘組為1.98（四分位數(shù)間距：1.45-2.78），重度哮喘組為2.35（四分位數(shù)間距：1.86-3.02）。采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)進(jìn)行多組間比較，結(jié)果顯示三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=25.68，P＜0.001）。進(jìn)一步兩兩比較（采用Bonferroni校正，校正后P＜0.017為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），發(fā)現(xiàn)重度哮喘組的ORMDL3基因表達(dá)水平顯著高于輕度哮喘組（Z=-4.86，P＜0.001）和中度哮喘組（Z=-3.52，P=0.004＜0.017），中度哮喘組的表達(dá)水平也顯著高于輕度哮喘組（Z=-2.85，P=0.012＜0.017），這表明隨著哮喘嚴(yán)重程度的增加，ORMDL3基因的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)。4.3SNP與基因表達(dá)水平相關(guān)性分析結(jié)果為進(jìn)一步探究ORMDL3基因單核苷酸多態(tài)性與基因表達(dá)水平之間的關(guān)系，本研究將300例兒童哮喘患者和300例健康兒童根據(jù)SNP位點(diǎn)rs7216389的基因型進(jìn)行分組，分別檢測(cè)不同基因型組中ORMDL3基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在病例組中，TT基因型個(gè)體的ORMDL3基因相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為2.25（四分位數(shù)間距：1.68-3.05），TC基因型個(gè)體為1.76（四分位數(shù)間距：1.25-2.35），CC基因型個(gè)體為1.32（四分位數(shù)間距：0.95-1.78）。在對(duì)照組中，TT基因型個(gè)體的ORMDL3基因相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為1.45（四分位數(shù)間距：1.05-1.85），TC基因型個(gè)體為1.10（四分位數(shù)間距：0.80-1.40），CC基因型個(gè)體為0.98（四分位數(shù)間距：0.75-1.20）。采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)對(duì)不同基因型組間的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示病例組和對(duì)照組中不同基因型組間的ORMDL3基因表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（病例組：H=20.45，P＜0.001；對(duì)照組：H=15.68，P＜0.001）。進(jìn)一步兩兩比較（采用Bonferroni校正，校正后P＜0.017為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），在病例組中，TT基因型個(gè)體的ORMDL3基因表達(dá)水平顯著高于TC基因型（Z=-3.56，P＜0.001）和CC基因型（Z=-4.89，P＜0.001）個(gè)體，TC基因型個(gè)體的表達(dá)水平也顯著高于CC基因型個(gè)體（Z=-2.89，P=0.011＜0.017）。在對(duì)照組中，TT基因型個(gè)體的ORMDL3基因表達(dá)水平顯著高于TC基因型（Z=-3.25，P=0.002＜0.017）和CC基因型（Z=-4.12，P＜0.001）個(gè)體，TC基因型個(gè)體的表達(dá)水平也顯著高于CC基因型個(gè)體（Z=-2.56，P=0.021＜0.017）。上述結(jié)果表明，ORMDL3基因SNP位點(diǎn)rs7216389的不同基因型與基因表達(dá)水平存在顯著相關(guān)性，攜帶TT基因型的個(gè)體，其ORMDL3基因表達(dá)水平顯著高于攜帶TC和CC基因型的個(gè)體。這一相關(guān)性提示，rs7216389位點(diǎn)的多態(tài)性可能通過影響ORMDL3基因的表達(dá)水平，進(jìn)而參與兒童哮喘的發(fā)病過程。推測(cè)TT基因型可能導(dǎo)致ORMDL3基因啟動(dòng)子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力發(fā)生改變，或者影響基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程，使得ORMDL3基因表達(dá)上調(diào)，而高表達(dá)的ORMDL3基因可能通過影響鞘脂類的合成和代謝，進(jìn)一步影響氣道細(xì)胞的功能，增加氣道炎癥和高反應(yīng)性，最終導(dǎo)致兒童哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。五、結(jié)果討論5.1ORMDL3基因SNP與兒童哮喘關(guān)聯(lián)性討論本研究對(duì)北京地區(qū)兒童哮喘患者和健康兒童的ORMDL3基因SNP進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)rs7216389位點(diǎn)的基因型分布在兩組間存在顯著差異，攜帶TT基因型的兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，提示該基因型可能是北京地區(qū)兒童哮喘發(fā)病的危險(xiǎn)因素。這一結(jié)果與部分前人研究具有一致性。例如，在一項(xiàng)針對(duì)歐洲人群的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)rs7216389位點(diǎn)的T等位基因與兒童哮喘的易感性顯著相關(guān)。在亞洲人群中，一些研究也支持這一結(jié)論，如對(duì)廣東深圳地區(qū)漢族哮喘高危新生兒的研究表明，ORMDL3基因rs7216389位點(diǎn)的單核甘酸多態(tài)性與哮喘高危組相關(guān)聯(lián)。這些研究共同表明，rs7216389位點(diǎn)的多態(tài)性在不同種族人群中都與兒童哮喘的發(fā)病存在一定關(guān)聯(lián)。然而，也有研究得出不同結(jié)果。有研究在分析ORMDL3基因標(biāo)簽SNPs（rs7216389，rs7216558）與兒童哮喘的關(guān)聯(lián)性時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)其與北京地區(qū)兒童哮喘顯著關(guān)聯(lián)。這種差異可能是由多種因素導(dǎo)致的。地區(qū)及人種差異是重要因素之一，不同地區(qū)人群的遺傳背景不同，基因頻率和單核苷酸多態(tài)性分布存在差異。北京地區(qū)人群具有獨(dú)特的遺傳特征，與其他地區(qū)人群在基因多態(tài)性上可能存在不同，這可能影響了ORMDL3基因SNP與兒童哮喘的關(guān)聯(lián)結(jié)果。樣本量的大小和采樣的代表性也會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響。本研究納入了300例哮喘兒童和300例健康兒童，樣本量相對(duì)較大，但如果采樣存在偏性，未能涵蓋北京地區(qū)所有遺傳背景和環(huán)境因素的兒童，也可能導(dǎo)致結(jié)果的偏差。而未發(fā)現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)的研究可能存在樣本量較小或采樣偏性較大的問題，使得研究結(jié)果不夠準(zhǔn)確。此外，研究方法的差異，如SNP檢測(cè)技術(shù)的不同、數(shù)據(jù)分析方法的差異等，也可能導(dǎo)致研究結(jié)果的不一致。不同的SNP檢測(cè)技術(shù)在準(zhǔn)確性和靈敏度上存在差異，可能會(huì)影響對(duì)基因多態(tài)性的檢測(cè)結(jié)果。數(shù)據(jù)分析方法的選擇也會(huì)影響結(jié)果的解讀，不同的統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)數(shù)據(jù)的處理和判斷標(biāo)準(zhǔn)不同，可能得出不同的結(jié)論。關(guān)于rs7216389位點(diǎn)影響兒童哮喘發(fā)病的機(jī)制，目前尚不完全清楚。從基因調(diào)控角度推測(cè)，該位點(diǎn)可能位于ORMDL3基因的調(diào)控區(qū)域，影響基因啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力。TT基因型可能使啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合更緊密或更松散，從而影響ORMDL3基因的轉(zhuǎn)錄效率，導(dǎo)致基因表達(dá)水平發(fā)生改變。若基因表達(dá)上調(diào)，可能會(huì)使ORMDL3蛋白的合成增加。ORMDL3蛋白參與鞘脂類的生物合成調(diào)控，過多的ORMDL3蛋白可能導(dǎo)致鞘脂類合成異常。鞘脂類是細(xì)胞膜的重要組成成分，其合成異常可能改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，影響氣道上皮細(xì)胞的屏障功能，使過敏原更容易進(jìn)入氣道，引發(fā)炎癥反應(yīng)。鞘脂類在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中也起著關(guān)鍵作用，合成異?？赡芨蓴_細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，導(dǎo)致炎性細(xì)胞的活化和募集異常，進(jìn)一步加重氣道炎癥，從而增加兒童哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。5.2ORMDL3基因表達(dá)水平與兒童哮喘關(guān)聯(lián)性討論本研究發(fā)現(xiàn)哮喘兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞中ORMDL3基因的表達(dá)水平顯著高于健康兒童，且隨著哮喘嚴(yán)重程度的增加，ORMDL3基因的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)。這一結(jié)果表明ORMDL3基因表達(dá)上調(diào)可能是兒童哮喘發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素，且與哮喘的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。ORMDL3基因表達(dá)水平升高可能通過多種機(jī)制影響兒童哮喘的發(fā)病。ORMDL3基因參與鞘脂類的生物合成調(diào)控，其表達(dá)上調(diào)可能導(dǎo)致鞘脂類合成異常。鞘脂類作為細(xì)胞膜的重要組成成分，其合成異常會(huì)改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。氣道上皮細(xì)胞作為呼吸道的第一道防線，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的改變會(huì)使其屏障功能受損，使得過敏原更容易進(jìn)入氣道，引發(fā)炎癥反應(yīng)。研究表明，氣道上皮細(xì)胞屏障功能受損時(shí)，過敏原可以直接接觸到氣道內(nèi)的免疫細(xì)胞，激活免疫反應(yīng)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的釋放，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些炎性細(xì)胞因子會(huì)進(jìn)一步加重氣道炎癥。ORMDL3基因表達(dá)上調(diào)還可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路來參與哮喘的發(fā)病。ORMDL3基因的表達(dá)產(chǎn)物可能與一些信號(hào)分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)。在氣道平滑肌細(xì)胞中，ORMDL3基因表達(dá)上調(diào)可能會(huì)影響鈣離子信號(hào)通路。鈣離子是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與調(diào)節(jié)氣道平滑肌的收縮和舒張。ORMDL3基因表達(dá)產(chǎn)物可能通過調(diào)節(jié)鈣離子通道的活性或鈣離子的釋放，影響氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，從而導(dǎo)致氣道平滑肌收縮增強(qiáng)，氣道阻力增加，引發(fā)哮喘癥狀。ORMDL3基因表達(dá)上調(diào)還可能影響絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者中，MAPK信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加。ORMDL3基因表達(dá)上調(diào)可能通過激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放，加重氣道炎癥。ORMDL3基因表達(dá)水平與遺傳因素密切相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)的rs7216389位點(diǎn)的多態(tài)性與ORMDL3基因表達(dá)水平存在顯著相關(guān)性，攜帶TT基因型的個(gè)體，其ORMDL3基因表達(dá)水平顯著高于攜帶TC和CC基因型的個(gè)體。這表明遺傳因素可能通過影響ORMDL3基因的表達(dá)水平，進(jìn)而影響兒童哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。推測(cè)rs7216389位點(diǎn)的TT基因型可能改變了ORMDL3基因啟動(dòng)子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，或者影響了基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程，使得ORMDL3基因表達(dá)上調(diào)。其他與ORMDL3基因相關(guān)的遺傳變異也可能對(duì)其表達(dá)水平產(chǎn)生影響。一些研究發(fā)現(xiàn)，位于ORMDL3基因調(diào)控區(qū)域的其他SNP位點(diǎn)，雖然不直接影響基因編碼的蛋白質(zhì)序列，但可能通過改變轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合位點(diǎn)，影響基因的轉(zhuǎn)錄效率，從而調(diào)節(jié)ORMDL3基因的表達(dá)水平。環(huán)境因素對(duì)ORMDL3基因表達(dá)水平也有重要影響。過敏原暴露是哮喘發(fā)病的重要環(huán)境因素之一。當(dāng)哮喘兒童接觸過敏原后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)會(huì)被激活，釋放多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，這些物質(zhì)可能通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響ORMDL3基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，塵螨過敏原刺激可以使氣道上皮細(xì)胞中ORMDL3基因的表達(dá)水平顯著升高?？諝馕廴疽彩怯绊慜RMDL3基因表達(dá)的重要環(huán)境因素?？諝庵械念w粒物、二氧化硫、氮氧化物等污染物可通過氧化應(yīng)激等機(jī)制損傷氣道上皮細(xì)胞，激活炎癥信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)ORMDL3基因的表達(dá)。有研究表明，長(zhǎng)期暴露在高濃度PM2.5環(huán)境中的兒童，其外周血單個(gè)核細(xì)胞中ORMDL3基因的表達(dá)水平明顯高于暴露在低濃度PM2.5環(huán)境中的兒童。呼吸道感染也可能影響ORMDL3基因表達(dá)水平。病毒感染可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞損傷，釋放炎性介質(zhì)，激活免疫系統(tǒng)，引發(fā)氣道炎癥和高反應(yīng)性，從而誘發(fā)哮喘發(fā)作。在病毒感染過程中，ORMDL3基因的表達(dá)水平可能會(huì)發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道合胞病毒感染可以使氣道上皮細(xì)胞中ORMDL3基因的表達(dá)水平升高。5.3SNP與基因表達(dá)水平綜合分析討論本研究發(fā)現(xiàn)ORMDL3基因SNP位點(diǎn)rs7216389的不同基因型與基因表達(dá)水平存在顯著相關(guān)性，攜帶TT基因型的個(gè)體，其ORMDL3基因表達(dá)水平顯著高于攜帶TC和CC基因型的個(gè)體。這一相關(guān)性表明，ORMDL3基因的單核苷酸多態(tài)性可能通過影響基因表達(dá)水平，進(jìn)而在兒童哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。從基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)角度來看，rs7216389位點(diǎn)的多態(tài)性可能改變了ORMDL3基因的順式作用元件或反式作用因子的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)該位點(diǎn)為TT基因型時(shí)，可能使得轉(zhuǎn)錄因子更容易與基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而促進(jìn)ORMDL3基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因表達(dá)上調(diào)。而高表達(dá)的ORMDL3基因可能通過影響鞘脂類的合成和代謝，改變氣道細(xì)胞的生理功能，進(jìn)而增加兒童哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。例如，鞘脂類合成異常可能導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能改變，使其屏障功能受損，過敏原更容易進(jìn)入氣道，引發(fā)炎癥反應(yīng)。鞘脂類在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中也起著關(guān)鍵作用，合成異?？赡芨蓴_細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，導(dǎo)致炎性細(xì)胞的活化和募集異常，進(jìn)一步加重氣道炎癥。綜合考慮ORMDL3基因SNP與表達(dá)水平，它們可能共同影響兒童哮喘的發(fā)病機(jī)制。遺傳因素通過SNP位點(diǎn)的多態(tài)性決定了個(gè)體對(duì)哮喘的遺傳易感性，而基因表達(dá)水平則在遺傳易感性的基礎(chǔ)上，受到環(huán)境因素等的調(diào)控，進(jìn)一步影響哮喘的發(fā)病過程。當(dāng)個(gè)體攜帶與哮喘發(fā)病相關(guān)的SNP基因型，如rs7216389位點(diǎn)的TT基因型，同時(shí)環(huán)境因素（如過敏原暴露、空氣污染等）導(dǎo)致ORMDL3基因表達(dá)上調(diào)時(shí)，哮喘發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)顯著增加。本研究也存在一定的局限性。雖然發(fā)現(xiàn)了ORMDL3基因SNP與表達(dá)水平的相關(guān)性以及它們與兒童哮喘的關(guān)聯(lián)，但對(duì)于具體的分子機(jī)制研究還不夠深入。未來需要進(jìn)一步開展功能實(shí)驗(yàn)，如基因敲除、過表達(dá)等實(shí)驗(yàn)，深入探究ORMDL3基因SNP影響基因表達(dá)水平的具體分子通路，以及ORMDL3基因表達(dá)改變?nèi)绾瓮ㄟ^影響鞘脂類代謝等過程導(dǎo)致哮喘發(fā)病。本研究?jī)H納入了北京地區(qū)的兒童，研究結(jié)果可能存在地域局限性，無法推廣到其他地區(qū)人群。后續(xù)研究可以擴(kuò)大樣本范圍，納入不同地區(qū)、不同種族的兒童，進(jìn)一步驗(yàn)證和完善研究結(jié)果。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過對(duì)北京地區(qū)兒童哮喘患者和健康兒童的ORMDL3基因單核苷酸多態(tài)性及表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)和分析，得出以下結(jié)論：ORMDL3基因的單核苷酸多態(tài)性與北京地區(qū)兒童哮喘易感性存在關(guān)聯(lián)。其中，rs7216389位點(diǎn)的TT基因型在兒童哮喘患者中的頻率顯著高于健康兒童，攜帶TT基因型的兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型兒童的1.68倍，提示rs7216389位點(diǎn)的TT基因型可能是北京地區(qū)兒童哮喘發(fā)病的危險(xiǎn)因素。而rs12603332位點(diǎn)的基因型分布在哮喘兒童和健康兒童中無顯著差異，該位點(diǎn)可能與北京地區(qū)兒童哮喘的易感性無明顯關(guān)聯(lián)。ORMDL3基因表達(dá)水平在哮喘兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞中顯著高于健康兒童，且隨著哮喘嚴(yán)重程度的增加，ORMDL3基因的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)。這表明ORMDL3