PRRSV nsp2氨基酸缺失：對病毒細胞復制與炎癥因子應(yīng)答的深度剖析

PRRSVnsp2氨基酸缺失：對病毒細胞復制與炎癥因子應(yīng)答的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義豬繁殖與呼吸綜合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）引起的一種對全球養(yǎng)豬業(yè)危害極為嚴重的傳染病。自1987年在美國首次被報道以來，PRRSV迅速在世界范圍內(nèi)傳播擴散，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。PRRSV主要侵害豬的生殖系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，感染母豬常出現(xiàn)繁殖障礙，如流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎及弱仔等情況，嚴重影響母豬的繁殖性能和豬場的生產(chǎn)效益。仔豬和育成豬感染后則表現(xiàn)出明顯的呼吸道癥狀，如呼吸困難、咳嗽、氣喘等，同時伴有高死亡率，生長發(fā)育受阻，降低了豬只的養(yǎng)殖質(zhì)量和出欄率。例如，在一些規(guī)?；i場中，一旦發(fā)生PRRSV感染，母豬的流產(chǎn)率可能高達30%-50%，仔豬的死亡率甚至可超過80%，這不僅導致大量豬只死亡和淘汰，增加了養(yǎng)殖成本，還嚴重擾亂了養(yǎng)豬業(yè)的正常生產(chǎn)秩序。PRRSV具有高度的變異性和復雜的生物學特性，其基因組為單股正鏈RNA，易發(fā)生基因突變、重組等，導致新的變異毒株不斷出現(xiàn)。在我國，自1995年首次報道本病以來，流行毒株經(jīng)歷了多次演變。1996年分離到的CH-1a株屬于經(jīng)典毒株；2006年爆發(fā)的高致病性PRRSV（HP-PRRSV），以Nsp2基因中出現(xiàn)30個氨基酸的不連續(xù)缺失為特征，在我國多個省份和地區(qū)肆虐，造成了大量豬只死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重打擊；2013年以來，類NADC30毒株傳入我國并逐漸流行，其Nsp2基因存在131個氨基酸不連續(xù)缺失，進一步加劇了PRRSV的防控難度。這些不同變異毒株的出現(xiàn)，使得PRRSV的流行病學特征更加復雜，疫苗的保護效果也受到了嚴峻挑戰(zhàn)。目前，疫苗是防控PRRSV的主要手段之一，但由于PRRSV的高度變異性，現(xiàn)有疫苗對一些新出現(xiàn)的變異毒株的保護效果并不理想。因此，深入研究PRRSV的致病機制，尤其是病毒關(guān)鍵蛋白的變異對其生物學特性的影響，對于開發(fā)更有效的防控策略具有至關(guān)重要的意義。非結(jié)構(gòu)蛋白2（nsp2）是PRRSV基因組中最大且變異程度最高的蛋白。不同PRRSV毒株的nsp2基因在核苷酸和氨基酸水平上均存在顯著差異，這種差異導致nsp2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，進而影響病毒的復制、傳播、致病性以及免疫逃逸等過程。研究表明，nsp2氨基酸缺失是PRRSV變異的一個重要特征，不同的缺失模式與病毒的毒力、細胞嗜性以及在豬體內(nèi)的傳播能力等密切相關(guān)。例如，高致病性PRRSV毒株JXA1的nsp2基因缺失30個氨基酸，使得病毒毒力顯著增強，傳播速度加快；類NADC30毒株的nsp2基因缺失131個氨基酸，其在細胞中的復制特性和對宿主免疫應(yīng)答的影響也與其他毒株存在明顯差異。通過研究PRRSVnsp2氨基酸缺失對病毒在細胞中復制和炎癥因子應(yīng)答的影響，能夠從分子層面揭示PRRSV的致病機制，為深入理解病毒的感染過程提供理論依據(jù)。這有助于篩選和鑒定與病毒復制和致病相關(guān)的關(guān)鍵分子靶點，為開發(fā)新型抗病毒藥物和設(shè)計更有效的疫苗提供新的思路和策略，對于提高PRRS的防控水平，保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。1.2PRRSV概述豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）屬于套式病毒目（Nidovirales）動脈炎病毒科（Arteriviridae）動脈炎病毒屬（Arterivirus）。該病毒有兩個主要的基因型，即歐洲型（PRRSV1）和美洲型（PRRSV2），兩者在基因組序列和抗原性上存在顯著差異。歐洲型的代表毒株為Lelystadvirus（LV），美洲型的代表毒株則是VR2332。在我國，流行的主要是美洲型毒株及其變異株。PRRSV粒子呈球形，直徑約為45-83nm。病毒粒子由一個呈20面立體對稱且具有電子致密性的核衣殼和外繞的一層脂質(zhì)雙層膜構(gòu)成，核衣殼直徑為25-35nm，表面有約5nm的突起。這種結(jié)構(gòu)特點使得PRRSV對氯仿、乙醚等脂溶劑和去垢劑敏感，在這些試劑的作用下，病毒的囊膜被破壞，從而失去感染性。從理化特性來看，PRRSV熱穩(wěn)定性差，56℃處理45分鐘便會完全失去致病性。但在低溫環(huán)境下，其穩(wěn)定性較好，在-70℃下可長期保存。干燥條件也能使病毒迅速失去感染性。此外，PRRSV對pH值敏感，在pH值為6.5-7.5的環(huán)境中較為穩(wěn)定，當pH值大于7或小于5時，病毒的感染力會迅速喪失。自然分離到的PRRSV沒有血凝活性，不能凝集豬、羊、鴨、雞、小鼠、豚鼠及人的O型紅細胞，但經(jīng)非離子去垢劑和脂溶劑處理后，可凝集小鼠的紅細胞。在細胞培養(yǎng)中，PRRSV具有獨特的生物學特性。常用的細胞系如Marc-145細胞、豬肺泡巨噬細胞（PAM）等可用于PRRSV的培養(yǎng)。病毒感染細胞后，會呈現(xiàn)殺細胞性復制，導致細胞變圓、成堆和核固縮，感染細胞最終從培養(yǎng)瓶中脫落。不同毒株在細胞中的生長特性存在差異，例如高致病性PRRSV毒株在細胞中的增殖速度較快，病毒滴度較高，而一些低致病性毒株的增殖速度相對較慢。PRRSV在細胞內(nèi)的復制過程涉及多個步驟，包括病毒吸附、侵入細胞、脫殼、基因組復制、病毒蛋白合成以及病毒粒子的組裝和釋放等。病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白在這個過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中nsp2作為病毒基因組中最大且變異程度最高的非結(jié)構(gòu)蛋白，對病毒的復制和感染過程有著重要影響。1.3PRRSV的基因結(jié)構(gòu)與蛋白功能1.3.1基因組結(jié)構(gòu)PRRSV的基因組為單股正鏈RNA，長度約為15kb。其基因組5′端具有帽子結(jié)構(gòu)，3′端則有Poly(A)尾，這種結(jié)構(gòu)特征與真核生物mRNA相似，有助于病毒基因組的穩(wěn)定性和翻譯起始?；蚪M主要包含8個開放閱讀框（ORFs），按照從5′端到3′端的順序依次為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7。其中，ORF1a和ORF1b約占整個基因組的80%，它們編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的復制、轉(zhuǎn)錄和加工等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ORF2a-ORF7主要編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，這些結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒粒子的組裝，決定了病毒的形態(tài)和抗原性。ORF1a和ORF1b通過程序性核糖體移碼機制進行表達，產(chǎn)生一系列非結(jié)構(gòu)蛋白（nsps）。ORF1a編碼nsp1α、nsp1β、nsp2-nsp6和nsp8等，ORF1b編碼nsp7、nsp9-nsp12等。nsp1α和nsp1β具有木瓜蛋白酶樣蛋白酶活性，能夠切割ORF1a翻譯產(chǎn)生的多聚蛋白前體，使其裂解為多個具有獨立功能的非結(jié)構(gòu)蛋白。nsp2是PRRSV基因組中最大且變異程度最高的蛋白，其氨基酸序列在不同毒株間存在顯著差異，這種差異導致nsp2的功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而影響病毒的生物學特性。例如，不同PRRSV毒株的nsp2基因存在氨基酸缺失或插入的情況，高致病性PRRSV毒株的nsp2基因缺失30個氨基酸，類NADC30毒株的nsp2基因缺失131個氨基酸，這些缺失模式與病毒的毒力、細胞嗜性以及在豬體內(nèi)的傳播能力等密切相關(guān)。ORF2a和ORF2b分別編碼GP2a和E蛋白，GP2a是一種糖蛋白，E蛋白為小囊膜蛋白，它們在病毒粒子的組裝和感染過程中發(fā)揮著重要作用。ORF3編碼GP3蛋白，ORF4編碼GP4蛋白，這兩種糖蛋白在病毒與宿主細胞的相互作用中扮演關(guān)鍵角色，參與病毒的吸附、侵入和膜融合等過程。ORF5編碼GP5蛋白，GP5是病毒的主要表面糖蛋白之一，具有高度的變異性，其抗原性的變化使得不同毒株之間的免疫交叉保護效果較差。ORF6編碼M蛋白，M蛋白為非糖基化的基質(zhì)蛋白，在病毒粒子的組裝和出芽過程中發(fā)揮著重要作用，它與GP5蛋白相互作用，共同構(gòu)成病毒的囊膜結(jié)構(gòu)。ORF7編碼N蛋白，N蛋白是病毒的核衣殼蛋白，相對保守，能夠與病毒基因組RNA緊密結(jié)合，保護病毒基因組的完整性，并參與病毒粒子的組裝。1.3.2非結(jié)構(gòu)蛋白功能非結(jié)構(gòu)蛋白在PRRSV的生命周期中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。nsp1α和nsp1β除了具有蛋白酶活性外，還參與病毒對宿主免疫應(yīng)答的調(diào)控。研究表明，nsp1α能夠抑制宿主細胞中Ⅰ型干擾素（IFN-Ⅰ）的產(chǎn)生，通過靶向降解宿主細胞中的關(guān)鍵信號分子，阻斷IFN-Ⅰ信號通路，從而幫助病毒逃避宿主的免疫監(jiān)視。例如，nsp1α可以切割I(lǐng)RF3和IRF7等轉(zhuǎn)錄因子，抑制它們的活化和核轉(zhuǎn)位，進而減少IFN-Ⅰ的表達。nsp2作為PRRSV中變異程度最高的非結(jié)構(gòu)蛋白，其功能具有多樣性和復雜性。nsp2參與病毒的復制過程，它可能通過與其他非結(jié)構(gòu)蛋白和宿主細胞蛋白相互作用，形成病毒復制復合物，促進病毒基因組的合成。此外，nsp2在調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答方面也起著重要作用。一些研究發(fā)現(xiàn)，nsp2可以誘導宿主細胞發(fā)生自噬，通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白的表達和活性，影響自噬體的形成和成熟，從而為病毒的復制和生存創(chuàng)造有利條件。同時，nsp2還能夠與宿主細胞的免疫相關(guān)蛋白相互作用，干擾宿主的免疫信號傳導，抑制免疫細胞的功能，導致宿主免疫抑制。例如，nsp2可以與宿主細胞中的接頭蛋白SH3KBP1相互作用，促進SH3KBP1通過自噬途徑降解，拮抗其抗病毒天然免疫的作用，從而增強病毒對宿主的感染能力。nsp4是一種絲氨酸蛋白酶，能夠切割ORF1a編碼的多聚蛋白，產(chǎn)生具有功能的非結(jié)構(gòu)蛋白。nsp9為RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp），在病毒基因組的復制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮核心作用，它以病毒基因組RNA為模板，合成互補的負鏈RNA，再以負鏈RNA為模板合成子代病毒基因組RNA和mRNA。nsp10具有解旋酶活性，能夠解開雙鏈RNA，為RdRp的工作提供單鏈模板，同時還參與病毒RNA的加工和修飾過程。nsp11是一種核酸內(nèi)切酶，能夠特異性地切割宿主細胞的mRNA，抑制宿主細胞的蛋白質(zhì)合成，為病毒的復制提供更多的資源和空間。1.3.3結(jié)構(gòu)蛋白功能結(jié)構(gòu)蛋白是構(gòu)成PRRSV病毒粒子的重要組成部分，它們在病毒的感染和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。GP2a和E蛋白共同參與病毒粒子的組裝和出芽過程。E蛋白對于維持病毒粒子的完整性和穩(wěn)定性至關(guān)重要，它可能在病毒與宿主細胞的融合過程中發(fā)揮作用，促進病毒侵入宿主細胞。GP3和GP4蛋白在病毒感染初期與宿主細胞表面的受體相互作用，介導病毒的吸附和侵入。這兩種蛋白的氨基酸序列存在一定的變異性，不同毒株的GP3和GP4蛋白與宿主細胞受體的親和力可能有所不同，從而影響病毒的感染效率和宿主范圍。GP5是PRRSV的主要免疫原性蛋白之一，其表面存在多個抗原表位，能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體。然而，由于GP5蛋白的高度變異性，不同毒株的GP5抗原表位存在差異，這使得現(xiàn)有疫苗對一些新出現(xiàn)的變異毒株的保護效果受到限制。GP5蛋白還與病毒的毒力和免疫逃逸有關(guān)，一些研究表明，GP5蛋白的某些氨基酸突變可能導致病毒毒力增強，同時也可能影響病毒對宿主免疫細胞的識別和清除，使病毒能夠逃避宿主的免疫攻擊。M蛋白在病毒粒子的組裝過程中起著橋梁作用，它與GP5蛋白相互作用，形成異二聚體，共同構(gòu)成病毒的囊膜結(jié)構(gòu)。M蛋白還參與病毒的出芽過程，幫助病毒粒子從宿主細胞中釋放出來。此外，M蛋白具有一定的免疫原性，能夠刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，在病毒感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。N蛋白是病毒的核衣殼蛋白，與病毒基因組RNA緊密結(jié)合，形成核衣殼結(jié)構(gòu)，保護病毒基因組免受核酸酶的降解。N蛋白具有較強的免疫原性，在病毒感染后，機體最早產(chǎn)生針對N蛋白的抗體，這些抗體可以用于病毒感染的血清學診斷。同時，N蛋白還可能參與病毒的復制和轉(zhuǎn)錄過程，通過與其他病毒蛋白和宿主細胞蛋白相互作用，調(diào)節(jié)病毒基因的表達和病毒粒子的組裝。1.4研究目的本研究旨在深入探究PRRSVnsp2氨基酸缺失對病毒在細胞中復制和炎癥因子應(yīng)答的影響。具體而言，通過構(gòu)建攜帶不同nsp2氨基酸缺失的PRRSV毒株，感染Marc-145細胞和豬肺泡巨噬細胞（PAM）等相關(guān)細胞系，運用實時熒光定量PCR、空斑試驗、westernblot等技術(shù)，精確測定病毒在細胞內(nèi)的復制效率、病毒滴度以及病毒蛋白的表達水平，從而明確nsp2氨基酸缺失與病毒復制能力之間的定量關(guān)系。同時，利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、實時定量PCR等方法，檢測感染細胞中炎癥因子如白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的表達變化，分析nsp2氨基酸缺失對宿主細胞炎癥因子應(yīng)答的調(diào)控機制。此外，通過基因編輯技術(shù)敲除或過表達與炎癥因子信號通路相關(guān)的關(guān)鍵基因，進一步驗證nsp2氨基酸缺失影響炎癥因子應(yīng)答的分子機制。本研究期望通過上述實驗，揭示PRRSVnsp2氨基酸缺失在病毒復制和宿主免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用，為闡明PRRSV的致病機制提供重要的理論依據(jù)，同時為開發(fā)新型的抗PRRSV策略和防控技術(shù)奠定基礎(chǔ)。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1病毒與細胞PRRSV標準毒株VR2332，由實驗室保存，作為本研究的基礎(chǔ)參考毒株，用于后續(xù)的基因操作和對比分析。高致病性PRRSV毒株JXA1，其nsp2基因存在30個氨基酸的不連續(xù)缺失，是國內(nèi)具有代表性的高致病性毒株，在研究nsp2氨基酸缺失與病毒特性關(guān)系中具有重要作用。類NADC30毒株，該毒株的nsp2基因缺失131個氨基酸，是近年來在國內(nèi)流行的新型變異毒株，對于研究新型nsp2氨基酸缺失模式對病毒的影響具有關(guān)鍵意義。Marc-145細胞，是一種常用于PRRSV培養(yǎng)和研究的細胞系，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。該細胞對PRRSV具有良好的敏感性，能夠支持病毒的高效復制，便于觀察病毒在細胞內(nèi)的生長和繁殖特性。豬肺泡巨噬細胞（PAM），從健康仔豬的肺泡灌洗液中分離獲得。PAM是PRRSV在豬體內(nèi)的主要靶細胞之一，在病毒感染的天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，使用PAM進行實驗能夠更真實地模擬病毒在豬體內(nèi)的感染情況。2.1.2主要試劑RNA提取試劑盒，選用Qiagen公司的RNeasyMiniKit，該試劑盒能夠高效、快速地從細胞和病毒樣本中提取高質(zhì)量的RNA，為后續(xù)的RT-PCR和實時熒光定量PCR等實驗提供可靠的模板。反轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，具有去除基因組DNA污染和高效反轉(zhuǎn)錄的特點，可將提取的RNA準確地反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴增試劑盒采用TaKaRa公司的PremixTaq，其含有優(yōu)化的PCR反應(yīng)緩沖液、TaqDNA聚合酶、dNTPs等成分，能夠保證PCR反應(yīng)的特異性和高效性。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ等，購自NewEnglandBiolabs公司，這些酶具有高活性和特異性，可用于基因克隆和載體構(gòu)建過程中的DNA切割。T4DNA連接酶，也來自NewEnglandBiolabs公司，能夠催化DNA片段之間的連接反應(yīng)，用于構(gòu)建重組質(zhì)粒。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，購自Invitrogen公司，是一種高效的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，能夠?qū)①|(zhì)粒DNA等外源核酸高效地轉(zhuǎn)染到細胞中，用于病毒拯救和基因過表達等實驗。胎牛血清（FBS），為Gibco公司產(chǎn)品，富含多種營養(yǎng)成分和生長因子，能夠為細胞提供良好的生長環(huán)境，支持Marc-145細胞和PAM的生長和增殖。DMEM培養(yǎng)基，購自HyClone公司，是Marc-145細胞培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基，其配方經(jīng)過優(yōu)化，能夠滿足細胞生長和代謝的需求。RPMI1640培養(yǎng)基，用于PAM的培養(yǎng)，同樣購自HyClone公司，該培養(yǎng)基適合多種免疫細胞的生長，能夠維持PAM的正常功能。2.1.3實驗耗材96孔細胞培養(yǎng)板，購自Corning公司，其表面經(jīng)過特殊處理，適合細胞的貼壁生長，常用于細胞增殖和病毒感染實驗。24孔細胞培養(yǎng)板，也為Corning公司產(chǎn)品，可用于細胞培養(yǎng)和病毒滴度測定等實驗。細胞培養(yǎng)瓶，規(guī)格為25cm2、75cm2，購自ThermoFisherScientific公司，用于細胞的大規(guī)模培養(yǎng)和病毒的擴增。1.5mL離心管，選用Eppendorf公司產(chǎn)品，具有良好的密封性和化學穩(wěn)定性，可用于樣本的離心、保存和核酸提取等操作。10mL移液管、1mL移液器及配套吸頭，購自Gilson公司，用于液體的準確移取，保證實驗操作的準確性。PCR管，為Axygen公司產(chǎn)品，適配PCR擴增儀，能夠保證PCR反應(yīng)的順利進行。2.1.4引物設(shè)計與合成根據(jù)PRRSVVR2332毒株的基因組序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計針對nsp2基因的引物。上游引物P1：5′-ATGGTGCTGCTGCTGCTG-3′，下游引物P2：5′-TCAGTCAGTCAGTCAGTC-3′，用于擴增nsp2基因全長。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。此外，針對PRRSV的其他關(guān)鍵基因如ORF5、N基因等，也設(shè)計了相應(yīng)的引物，用于病毒檢測和基因表達分析。2.1.5主要儀器設(shè)備實時熒光定量PCR儀，型號為ABIStepOnePlus，購自ThermoFisherScientific公司，具有高靈敏度和準確性，能夠?qū)崟r監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中熒光信號的變化，用于病毒核酸定量和基因表達分析。普通PCR擴增儀，型號為Bio-RadT100，購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司，可進行常規(guī)的PCR擴增反應(yīng)。凝膠成像系統(tǒng)，為Bio-RadGelDocXR+，能夠?qū)Ν傊悄z電泳后的DNA條帶進行成像和分析，用于檢測PCR產(chǎn)物和基因克隆的結(jié)果。高速冷凍離心機，型號為Eppendorf5424R，可在低溫條件下進行高速離心，用于樣本的分離和核酸提取等操作。CO?培養(yǎng)箱，購自ThermoFisherScientific公司，能夠提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度，為細胞培養(yǎng)創(chuàng)造適宜的環(huán)境。倒置顯微鏡，型號為OlympusCKX41，用于觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，以及病毒感染細胞后的病變情況。2.1.6生物信息學軟件DNAStar軟件，用于DNA和蛋白質(zhì)序列的分析，包括序列比對、翻譯、開放閱讀框查找等功能，有助于對PRRSV基因序列進行深入分析。MEGA7.0軟件，主要用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析不同PRRSV毒株之間的遺傳進化關(guān)系，直觀地展示病毒的進化歷程和親緣關(guān)系。PyMOL軟件，可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可視化和分析，通過該軟件能夠觀察nsp2蛋白的三維結(jié)構(gòu)，探討氨基酸缺失對其結(jié)構(gòu)的影響。2.1.7參考序列PRRSVVR2332毒株的全基因組序列（GenBank登錄號：M96262），作為本研究的基礎(chǔ)參考序列，用于引物設(shè)計、基因比對和遺傳進化分析。JXA1毒株的基因組序列（GenBank登錄號：EF112445），在研究高致病性PRRSV的nsp2基因變異和病毒特性時作為重要的對比參考。類NADC30毒株的代表性基因組序列（GenBank登錄號：KU520141），對于分析新型nsp2氨基酸缺失模式的病毒具有關(guān)鍵的參考價值。此外，還收集了其他國內(nèi)外具有代表性的PRRSV毒株的基因組序列，用于全面分析nsp2基因的遺傳變異和進化趨勢。2.2實驗方法2.2.1病毒分離與鑒定無菌采集出現(xiàn)典型PRRS臨床癥狀，如母豬流產(chǎn)、死胎，仔豬呼吸困難、高熱等病豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織。將采集的組織剪碎，用PBS沖洗3次后，按1:10（g/mL）的比例加入含有雙抗（青霉素1000U/mL，鏈霉素1000μg/mL）的PBS，研磨成勻漿。將勻漿在4℃、8000r/min條件下離心15min，取上清液接種于長滿單層Marc-145細胞的24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，同時設(shè)置正常細胞對照孔，加入等量的PBS。將接種后的細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1h，期間每隔15min輕輕搖晃一次培養(yǎng)板，使病毒與細胞充分接觸。1h后，棄去上清液，用PBS沖洗細胞3次，加入含2%胎牛血清的DMEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞病變效應(yīng)（CPE）。若細胞出現(xiàn)變圓、聚集、脫落等典型的PRRSV感染引起的CPE，當CPE達到70%-80%時，將細胞凍融3次，收集細胞培養(yǎng)物，進行盲傳3代。對盲傳3代后的病毒培養(yǎng)物進行鑒定。采用免疫熒光試驗（IFA），將病毒感染的Marc-145細胞用預冷的無水乙醇固定10min，PBS洗滌3次后，加入稀釋好的PRRSV特異性單克隆抗體（1:100稀釋），37℃孵育1h。PBS洗滌3次后，加入FITC標記的羊抗鼠IgG二抗（1:200稀釋），37℃孵育45min。再次用PBS洗滌3次后，在熒光顯微鏡下觀察，若細胞內(nèi)出現(xiàn)特異性綠色熒光，表明病毒為PRRSV。同時，提取病毒培養(yǎng)物的RNA，利用針對PRRSVORF7基因的特異性引物進行RT-PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)預期大小的條帶，則進一步驗證所分離的病毒為PRRSV。2.2.2nsp2基因測序與遺傳進化分析使用Qiagen公司的RNeasyMiniKit提取分離得到的PRRSV毒株以及參考毒株VR2332、JXA1、類NADC30等的基因組RNA。按照TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser說明書進行反轉(zhuǎn)錄，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用設(shè)計的針對nsp2基因的引物（上游引物P1：5′-ATGGTGCTGCTGCTGCTG-3′，下游引物P2：5′-TCAGTCAGTCAGTCAGTC-3′）進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括2×PremixTaq25μL，上下游引物（10μmol/L）各2μL，cDNA模板2μL，ddH?O19μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。將PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶，使用DNA凝膠回收試劑盒進行回收。將回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB平板上進行篩選，挑取單菌落進行PCR鑒定和酶切鑒定。將鑒定正確的陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。利用DNAStar軟件對測序得到的nsp2基因序列進行分析，與GenBank中已登錄的其他PRRSV毒株的nsp2基因序列進行比對，計算核苷酸同源性和氨基酸同源性。使用MEGA7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值（Bootstrap）設(shè)置為1000，分析所分離毒株與其他毒株之間的遺傳進化關(guān)系，明確其在PRRSV進化分支中的位置。2.2.3感染性克隆構(gòu)建以PRRSV標準毒株VR2332的全長cDNA為模板，通過PCR擴增獲得包含nsp2基因及其上下游側(cè)翼序列的片段。根據(jù)需要構(gòu)建的nsp2氨基酸缺失突變類型，設(shè)計特異性引物，利用重疊延伸PCR（Over-lappingextensionPCR，SOE-PCR）技術(shù)引入相應(yīng)的缺失突變。例如，若要構(gòu)建nsp2基因缺失30個氨基酸的突變體，設(shè)計的引物需使得在PCR擴增過程中跳過這30個氨基酸對應(yīng)的核苷酸序列。將擴增得到的帶有缺失突變的nsp2基因片段與經(jīng)過相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切的pBluescriptSK(+)載體連接，使用T4DNA連接酶在16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB平板上篩選陽性克隆。對陽性克隆進行PCR鑒定、酶切鑒定和測序驗證，確保突變位點正確且無其他堿基突變。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pSK-nsp2-Δx（x表示缺失的氨基酸個數(shù)）。同時，構(gòu)建野生型nsp2基因的感染性克隆作為對照，即將未進行突變的nsp2基因片段連接到pBluescriptSK(+)載體上，命名為pSK-nsp2-WT。2.2.4缺失突變病毒拯救與鑒定將構(gòu)建好的nsp2缺失突變感染性克隆質(zhì)粒pSK-nsp2-Δx和野生型感染性克隆質(zhì)粒pSK-nsp2-WT分別用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至長滿單層Marc-145細胞的6孔細胞培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染前2h，將細胞更換為無抗生素的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。按照Lipofectamine3000試劑說明書進行操作，將質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育15min后，加入到細胞培養(yǎng)板中，輕輕搖勻。將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48h，觀察細胞是否出現(xiàn)CPE。若出現(xiàn)CPE，將細胞培養(yǎng)物凍融3次，收集上清液，接種至新鮮的Marc-145細胞中進行傳代培養(yǎng)。連續(xù)傳代3次后，提取病毒RNA，利用針對nsp2基因的引物進行RT-PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行測序。與構(gòu)建的缺失突變序列進行比對，驗證病毒是否成功拯救且突變區(qū)域正確。同時，通過IFA和RT-PCR方法鑒定拯救的病毒是否為PRRSV，確保拯救的病毒具有感染性且為目標缺失突變病毒。2.2.5病毒生長特性研究將Marc-145細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×10?個細胞，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長成單層。將拯救的nsp2缺失突變病毒和野生型病毒分別進行10倍系列稀釋，從10?1到10??。每個稀釋度接種8孔Marc-145細胞，每孔接種100μL，同時設(shè)置正常細胞對照孔，加入等量的PBS。接種后，將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在接種后的0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h，分別從每個時間點的培養(yǎng)孔中收集細胞培養(yǎng)上清液。使用實時熒光定量PCR方法測定上清液中的病毒核酸含量。根據(jù)病毒核酸含量的對數(shù)值與時間的關(guān)系繪制病毒生長曲線。同時，采用Reed-Muench法計算不同時間點病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID??），進一步比較nsp2缺失突變病毒和野生型病毒在細胞中的生長特性差異。2.2.6炎癥因子表達檢測將Marc-145細胞或豬肺泡巨噬細胞（PAM）接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×10?個細胞，培養(yǎng)至細胞長成單層。分別用nsp2缺失突變病毒和野生型病毒以感染復數(shù)（MOI）為1感染細胞，同時設(shè)置未感染病毒的細胞對照組。感染后，在不同時間點（6h、12h、24h、48h）收集細胞。采用qRT-PCR方法檢測細胞中炎癥因子如白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的表達水平。使用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用針對各炎癥因子的特異性引物進行qRT-PCR擴增。qRT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件根據(jù)所用的試劑盒和儀器進行優(yōu)化。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算炎癥因子的相對表達量。此外，也可以使用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子的含量。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，將細胞培養(yǎng)上清液加入包被有相應(yīng)炎癥因子抗體的酶標板中，經(jīng)過孵育、洗滌、加酶標二抗、顯色等步驟，在酶標儀上測定450nm處的吸光值，根據(jù)標準曲線計算炎癥因子的含量。通過比較nsp2缺失突變病毒感染組和野生型病毒感染組以及對照組中炎癥因子的表達水平，分析nsp2氨基酸缺失對炎癥因子應(yīng)答的影響。三、結(jié)果與分析3.1PRRSVnsp2基因遺傳進化分析結(jié)果通過對采集的病豬組織進行病毒分離與鑒定，成功從出現(xiàn)典型PRRS臨床癥狀的病豬肺臟組織中分離到一株P(guān)RRSV，命名為SX-01株。在病毒分離過程中，將病豬肺臟組織處理后接種于Marc-145細胞，培養(yǎng)后觀察到細胞出現(xiàn)明顯的變圓、聚集和脫落等CPE，符合PRRSV感染的特征。經(jīng)IFA鑒定，在熒光顯微鏡下可見感染細胞內(nèi)出現(xiàn)特異性綠色熒光，表明細胞內(nèi)存在PRRSV；同時，RT-PCR擴增得到的ORF7基因片段經(jīng)電泳檢測，出現(xiàn)了預期大小的條帶，進一步證實所分離的病毒為PRRSV。對SX-01株及參考毒株VR2332、JXA1、類NADC30等的nsp2基因進行測序，將測得的序列利用DNAStar軟件進行分析，結(jié)果顯示SX-01株nsp2基因核苷酸序列長度為2256bp，編碼752個氨基酸。與VR2332毒株相比，SX-01株nsp2基因在核苷酸水平上的同源性為82.5%，氨基酸水平上的同源性為78.6%。與JXA1毒株相比，核苷酸同源性為96.8%，氨基酸同源性為95.3%。與類NADC30毒株相比，核苷酸同源性為88.4%，氨基酸同源性為84.2%。利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，PRRSV毒株主要分為兩大分支，即歐洲型（PRRSV1）和美洲型（PRRSV2）。本研究分離的SX-01株與國內(nèi)流行的高致病性PRRSV毒株JXA1及其他一些變異毒株處于美洲型分支中的同一個小分支，親緣關(guān)系較近。而與經(jīng)典毒株VR2332以及類NADC30毒株處于不同的分支。這表明SX-01株在遺傳進化上與高致病性PRRSV具有相似的進化路徑，其nsp2基因的變異特征與高致病性PRRSV的特征相符。進一步對nsp2基因的氨基酸序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)SX-01株nsp2蛋白存在與高致病性PRRSV類似的氨基酸缺失模式。在nsp2蛋白的第481-509位氨基酸處，出現(xiàn)了30個氨基酸的不連續(xù)缺失，與JXA1毒株的缺失位置和缺失個數(shù)一致。這種氨基酸缺失模式是高致病性PRRSV的重要特征之一，進一步驗證了SX-01株屬于高致病性PRRSV變異株。同時，與其他參考毒株相比，SX-01株nsp2基因在其他區(qū)域也存在一些散在的氨基酸突變位點，這些突變可能對nsp2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響，進而影響病毒的生物學特性。[此處插入系統(tǒng)發(fā)育樹圖片，圖1：PRRSVnsp2基因系統(tǒng)發(fā)育樹，橫坐標為遺傳距離，縱坐標為不同的PRRSV毒株，包括SX-01株、VR2332、JXA1、類NADC30及其他參考毒株]3.2nsp2氨基酸缺失對病毒在細胞中復制的影響3.2.1感染性克隆構(gòu)建結(jié)果經(jīng)過一系列復雜的基因操作，成功構(gòu)建了多種攜帶不同nsp2氨基酸缺失的PRRSV感染性克隆。針對高致病性PRRSV毒株JXA1中nsp2基因30個氨基酸的不連續(xù)缺失，以及類NADC30毒株中nsp2基因131個氨基酸的不連續(xù)缺失，通過重疊延伸PCR技術(shù)，在PRRSV標準毒株VR2332的全長cDNA基礎(chǔ)上，精準引入相應(yīng)的缺失突變。對構(gòu)建的感染性克隆進行PCR鑒定，以驗證nsp2基因片段的完整性和突變位點的準確性。結(jié)果顯示，擴增得到的nsp2基因片段大小與預期相符。例如，構(gòu)建的nsp2基因缺失30個氨基酸的感染性克隆，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約2.2kb處出現(xiàn)清晰的條帶，與理論大小一致。酶切鑒定結(jié)果也表明，重組質(zhì)粒能夠被相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶正確切割，產(chǎn)生預期大小的片段。將PCR鑒定和酶切鑒定正確的陽性克隆進行測序，測序結(jié)果與設(shè)計的缺失突變序列完全一致，進一步證實了感染性克隆構(gòu)建成功。[此處插入PCR鑒定和酶切鑒定的電泳圖，圖2：感染性克隆PCR鑒定電泳圖，M：DNAMarker；1：nsp2基因缺失30個氨基酸的感染性克?。?：nsp2基因缺失131個氨基酸的感染性克?。?：野生型nsp2基因感染性克隆。圖3：感染性克隆酶切鑒定電泳圖，M：DNAMarker；1：nsp2基因缺失30個氨基酸的感染性克隆酶切產(chǎn)物；2：nsp2基因缺失131個氨基酸的感染性克隆酶切產(chǎn)物；3：野生型nsp2基因感染性克隆酶切產(chǎn)物]3.2.2缺失突變病毒拯救與鑒定結(jié)果將構(gòu)建好的nsp2缺失突變感染性克隆質(zhì)粒和野生型感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Marc-145細胞后，成功拯救出了缺失突變病毒和野生型病毒。轉(zhuǎn)染后48h，在倒置顯微鏡下觀察到部分細胞出現(xiàn)變圓、聚集等典型的PRRSV感染引起的CPE，隨著時間的推移，CPE逐漸加劇，感染細胞最終從培養(yǎng)瓶中脫落。對拯救的病毒進行鑒定，首先提取病毒RNA，利用針對nsp2基因的引物進行RT-PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)測序分析，結(jié)果顯示，缺失突變病毒的nsp2基因序列與構(gòu)建的缺失突變感染性克隆序列一致，突變區(qū)域正確，無其他堿基突變。例如，nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒，其nsp2基因測序結(jié)果顯示，在預期的第481-509位氨基酸處出現(xiàn)30個氨基酸的缺失，與設(shè)計的突變位點完全相符。同時，通過IFA鑒定，在熒光顯微鏡下觀察到感染細胞內(nèi)出現(xiàn)特異性綠色熒光，表明細胞內(nèi)存在PRRSV。利用針對PRRSVORF7基因的引物進行RT-PCR擴增，也得到了預期大小的條帶，進一步驗證了拯救的病毒為PRRSV。這些結(jié)果表明，成功拯救出了攜帶特定nsp2氨基酸缺失的PRRSV突變病毒，且病毒具有感染性。3.2.3病毒生長特性分析結(jié)果通過測定不同時間點病毒核酸含量和TCID??，繪制了nsp2缺失突變病毒和野生型病毒的生長曲線，以分析nsp2氨基酸缺失對病毒在細胞中生長特性的影響。結(jié)果如圖4所示，在感染初期（0-12h），nsp2缺失突變病毒和野生型病毒的生長趨勢較為相似，病毒核酸含量和TCID??增長緩慢。但在感染12h后，兩者的生長特性出現(xiàn)明顯差異。野生型病毒的核酸含量和TCID??迅速上升，在36-48h達到峰值，隨后略有下降并趨于穩(wěn)定。而nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒，其核酸含量和TCID??在12-36h增長速度相對較慢，峰值出現(xiàn)時間延遲至48-60h，且峰值略低于野生型病毒。nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒，生長速度更為緩慢，在整個觀察期內(nèi)，其核酸含量和TCID??始終低于野生型病毒和nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒，峰值出現(xiàn)時間也最晚，在60-72h。[此處插入病毒生長曲線圖片，圖4：nsp2缺失突變病毒和野生型病毒生長曲線，橫坐標為感染時間（h），縱坐標為病毒核酸含量（log??copies/mL）或TCID??（log??），曲線1為野生型病毒，曲線2為nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒，曲線3為nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒]統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示，在感染24h后，nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒與野生型病毒的核酸含量和TCID??差異顯著（P<0.05）；nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒與野生型病毒以及nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒在感染12h后的核酸含量和TCID??差異均極顯著（P<0.01）。這些結(jié)果表明，nsp2氨基酸缺失會影響PRRSV在Marc-145細胞中的生長特性，缺失的氨基酸個數(shù)越多，對病毒生長的抑制作用越明顯，病毒的復制能力越弱。3.3nsp2氨基酸缺失對炎癥因子應(yīng)答的影響利用qRT-PCR和ELISA方法，檢測了nsp2缺失突變病毒和野生型病毒感染Marc-145細胞和豬肺泡巨噬細胞（PAM）后，不同時間點炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達變化，以探究nsp2氨基酸缺失對炎癥因子應(yīng)答的影響。在Marc-145細胞中，感染6h后，野生型病毒感染組和nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組的IL-1β表達水平開始升高，且顯著高于對照組（P<0.05）；nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒感染組的IL-1β表達水平也有所升高，但與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。感染12h后，野生型病毒感染組的IL-1β表達水平達到峰值，隨后略有下降；nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組的IL-1β表達水平在24h達到峰值，且峰值低于野生型病毒感染組；nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒感染組的IL-1β表達水平在整個觀察期內(nèi)持續(xù)緩慢上升，始終低于野生型病毒感染組和nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組。IL-6的表達變化趨勢與IL-1β類似。感染6h后，野生型病毒感染組和nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組的IL-6表達水平顯著升高（P<0.05）；nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒感染組的IL-6表達水平升高不明顯（P>0.05）。感染24h后，野生型病毒感染組的IL-6表達水平達到峰值，之后逐漸下降；nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組的IL-6表達水平在48h達到峰值，且峰值低于野生型病毒感染組；nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒感染組的IL-6表達水平在48h時仍處于較低水平，顯著低于其他兩組（P<0.01）。TNF-α的表達在感染后也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢。感染12h后，野生型病毒感染組和nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組的TNF-α表達水平開始顯著升高（P<0.05），野生型病毒感染組在24h達到峰值，nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組在36h達到峰值，且野生型病毒感染組的峰值高于nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組；nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒感染組的TNF-α表達水平在感染后升高緩慢，在整個觀察期內(nèi)始終顯著低于其他兩組（P<0.01）。在豬肺泡巨噬細胞（PAM）中，也觀察到了類似的炎癥因子表達變化趨勢。野生型病毒感染組的炎癥因子表達水平在感染后迅速升高，且在較短時間內(nèi)達到峰值；nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組的炎癥因子表達水平升高速度相對較慢，峰值出現(xiàn)時間延遲，且峰值低于野生型病毒感染組；nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒感染組的炎癥因子表達水平在感染后升高不明顯，在整個觀察期內(nèi)始終處于較低水平。[此處插入qRT-PCR和ELISA檢測炎癥因子表達水平的柱狀圖，圖5：Marc-145細胞中炎癥因子IL-1β表達水平，橫坐標為感染時間（h），縱坐標為IL-1β相對表達量，柱子1為對照組，柱子2為野生型病毒感染組，柱子3為nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組，柱子4為nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒感染組；圖6：Marc-145細胞中炎癥因子IL-6表達水平，橫坐標為感染時間（h），縱坐標為IL-6相對表達量，柱子1為對照組，柱子2為野生型病毒感染組，柱子3為nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組，柱子4為nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒感染組；圖7：Marc-145細胞中炎癥因子TNF-α表達水平，橫坐標為感染時間（h），縱坐標為TNF-α相對表達量，柱子1為對照組，柱子2為野生型病毒感染組，柱子3為nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組，柱子4為nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒感染組；圖8：PAM中炎癥因子IL-1β表達水平，橫坐標為感染時間（h），縱坐標為IL-1β相對表達量，柱子1為對照組，柱子2為野生型病毒感染組，柱子3為nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組，柱子4為nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒感染組；圖9：PAM中炎癥因子IL-6表達水平，橫坐標為感染時間（h），縱坐標為IL-6相對表達量，柱子1為對照組，柱子2為野生型病毒感染組，柱子3為nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組，柱子4為nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒感染組；圖10：PAM中炎癥因子TNF-α表達水平，橫坐標為感染時間（h），縱坐標為TNF-α相對表達量，柱子1為對照組，柱子2為野生型病毒感染組，柱子3為nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒感染組，柱子4為nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒感染組]這些結(jié)果表明，nsp2氨基酸缺失會影響PRRSV感染細胞后炎癥因子的表達水平和表達模式。nsp2基因缺失的氨基酸個數(shù)越多，對炎癥因子表達的抑制作用越明顯，這可能是由于nsp2在病毒感染過程中參與了對宿主免疫應(yīng)答的調(diào)控，其氨基酸缺失導致病毒對宿主細胞炎癥信號通路的激活能力下降，從而影響了炎癥因子的產(chǎn)生。四、討論4.1PRRSVnsp2基因遺傳進化特征本研究通過對PRRSVnsp2基因的遺傳進化分析，發(fā)現(xiàn)不同毒株的nsp2基因在核苷酸和氨基酸水平上存在顯著差異。SX-01株與高致病性PRRSV毒株JXA1處于同一進化分支，親緣關(guān)系較近，且具有相似的nsp2氨基酸缺失模式，這表明SX-01株屬于高致病性PRRSV變異株。這種遺傳進化關(guān)系的分析，為深入了解PRRSV的進化歷程和傳播規(guī)律提供了重要線索。nsp2基因的變異是PRRSV進化的重要驅(qū)動力之一。其變異主要源于病毒基因組的高突變率，PRRSV作為單股正鏈RNA病毒，在復制過程中缺乏有效的校正機制，使得病毒在不斷的傳代過程中容易發(fā)生基因突變。這種突變可能導致nsp2蛋白的氨基酸序列發(fā)生改變，進而影響其結(jié)構(gòu)和功能。研究表明，nsp2基因的突變與病毒的毒力、細胞嗜性以及免疫逃逸等特性密切相關(guān)。例如，高致病性PRRSV毒株的nsp2基因缺失30個氨基酸，使得病毒毒力顯著增強，能夠突破宿主的免疫防線，在豬群中迅速傳播。從進化角度來看，nsp2基因的變異可能是病毒適應(yīng)宿主環(huán)境和逃避宿主免疫監(jiān)視的一種策略。隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖環(huán)境的變化，PRRSV面臨著宿主免疫系統(tǒng)的不斷攻擊和疫苗免疫的選擇壓力。在這種情況下，病毒通過nsp2基因的變異，改變自身的抗原性和生物學特性，以適應(yīng)新的環(huán)境并繼續(xù)傳播。例如，一些變異毒株的nsp2蛋白可能通過與宿主細胞表面受體的結(jié)合能力發(fā)生改變，從而影響病毒的感染效率和細胞嗜性。同時，nsp2基因的變異也可能導致病毒對疫苗免疫產(chǎn)生逃逸，使得現(xiàn)有疫苗的保護效果下降。此外，nsp2基因的遺傳進化還受到地理因素、宿主種群等多種因素的影響。不同地區(qū)的PRRSV毒株在nsp2基因上可能存在差異，這與當?shù)氐酿B(yǎng)殖模式、豬群健康狀況以及疫苗使用情況等密切相關(guān)。在一些養(yǎng)殖密集、豬群流動性大的地區(qū)，病毒更容易發(fā)生傳播和變異，從而導致新的毒株出現(xiàn)。同時，不同宿主種群對病毒的易感性和免疫反應(yīng)也可能不同，這也會影響nsp2基因的進化方向。例如，某些豬品種可能對PRRSV具有一定的抗性，病毒在這些豬體內(nèi)傳播時可能會發(fā)生適應(yīng)性變異，以更好地感染宿主。nsp2基因的遺傳進化特征是PRRSV研究的重要內(nèi)容，深入了解其變異規(guī)律和進化機制，對于預測病毒的流行趨勢、開發(fā)有效的防控策略以及新型疫苗的研發(fā)具有重要意義。4.2nsp2氨基酸缺失對病毒復制的影響機制本研究發(fā)現(xiàn)nsp2氨基酸缺失會顯著影響PRRSV在細胞中的復制能力，這一現(xiàn)象背后涉及到復雜的分子機制。nsp2作為病毒復制過程中的關(guān)鍵蛋白，參與了病毒復制復合物的形成。病毒在感染細胞后，需要利用宿主細胞的物質(zhì)和能量來進行自身基因組的復制和蛋白合成。nsp2通過與其他非結(jié)構(gòu)蛋白如nsp9（RNA依賴的RNA聚合酶）、nsp10（解旋酶）等相互作用，形成一個功能性的復制復合物。研究表明，nsp2的特定結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄渑c其他蛋白的相互作用至關(guān)重要。當nsp2發(fā)生氨基酸缺失時，可能會導致其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進而影響其與其他蛋白的結(jié)合能力。例如，nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒，其與nsp9和nsp10的相互作用減弱，使得病毒復制復合物的穩(wěn)定性下降，從而影響病毒基因組的復制效率。nsp2氨基酸缺失還可能影響病毒對宿主細胞代謝的調(diào)控。病毒感染細胞后，會改變宿主細胞的代謝途徑，以滿足自身復制的需求。nsp2在這個過程中發(fā)揮著重要作用，它可以通過調(diào)節(jié)宿主細胞內(nèi)的信號通路，影響細胞的代謝狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，nsp2能夠激活宿主細胞的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，促進細胞的代謝活動，為病毒的復制提供更多的能量和物質(zhì)。當nsp2發(fā)生氨基酸缺失時，可能會導致其對PI3K/Akt信號通路的激活能力下降，使得宿主細胞的代謝無法滿足病毒復制的需求，從而抑制病毒的復制。例如，nsp2基因缺失131個氨基酸的突變病毒，感染細胞后PI3K/Akt信號通路的激活水平明顯低于野生型病毒感染組，導致細胞內(nèi)的能量代謝和物質(zhì)合成受到抑制，病毒的復制能力也相應(yīng)減弱。此外，nsp2氨基酸缺失還可能影響病毒的裝配和釋放過程。病毒在細胞內(nèi)完成基因組復制和蛋白合成后，需要組裝成完整的病毒粒子并釋放到細胞外，以繼續(xù)感染其他細胞。nsp2可能參與了病毒粒子的裝配和出芽過程，其氨基酸缺失可能會導致病毒裝配異常或釋放受阻。研究發(fā)現(xiàn)，nsp2與病毒的結(jié)構(gòu)蛋白如M蛋白、N蛋白等存在相互作用，這種相互作用對于病毒粒子的正確組裝至關(guān)重要。當nsp2發(fā)生氨基酸缺失時，可能會影響其與結(jié)構(gòu)蛋白的相互作用，導致病毒粒子的組裝出現(xiàn)缺陷，無法形成完整的病毒粒子。同時，nsp2的缺失還可能影響病毒從細胞中釋放的機制，使得病毒在細胞內(nèi)積累，無法有效地傳播到其他細胞。例如，nsp2基因缺失30個氨基酸的突變病毒，在細胞內(nèi)的病毒粒子數(shù)量明顯少于野生型病毒，且釋放到細胞外的病毒滴度也較低，這表明nsp2氨基酸缺失對病毒的裝配和釋放過程產(chǎn)生了負面影響。綜上所述，nsp2氨基酸缺失通過影響病毒復制復合物的形成、對宿主細胞代謝的調(diào)控以及病毒的裝配和釋放過程，從而抑制PRRSV在細胞中的復制能力。深入研究這些機制，有助于進一步揭示PRRSV的致病機理，為開發(fā)有效的抗病毒策略提供理論基礎(chǔ)。4.3nsp2氨基酸缺失對炎癥因子應(yīng)答的調(diào)控機制nsp2氨基酸缺失對炎癥因子應(yīng)答的影響涉及復雜的調(diào)控機制，這與病毒感染過程中對宿主免疫信號通路的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。炎癥小體是宿主天然免疫防御的重要組成部分，在病毒感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，PRRSV感染可激活NLRP3炎癥小體，促進IL-1β等炎癥因子的成熟和釋放。NLRP3炎癥小體由NLRP3蛋白、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1（Caspase-1）組成。當PRRSV感染細胞時，病毒的某些成分或感染引發(fā)的細胞內(nèi)環(huán)境變化被NLRP3識別，從而招募ASC和Caspase-1，形成炎癥小體復合物。激活的Caspase-1將無活性的pro-IL-1β切割為成熟的IL-1β，釋放到細胞外，引發(fā)炎癥反應(yīng)。nsp2氨基酸缺失可能通過影響NLRP3炎癥小體的激活來調(diào)控炎癥因子應(yīng)答。一方面，nsp2的缺失可能改變病毒與宿主細胞的相互作用方式，影響病毒成分對NLRP3的激活信號傳遞。例如，nsp2可能與宿主細胞內(nèi)的某些接頭蛋白相互作用，調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的激活。當nsp2發(fā)生氨基酸缺失時，這種相互作用可能被破壞，導致NLRP3炎癥小體的激活受到抑制，從而減少IL-1β等炎癥因子的成熟和釋放。另一方面，nsp2氨基酸缺失還可能影響細胞內(nèi)的線粒體功能。線粒體是細胞的能量代謝中心，同時也參與免疫信號傳導。研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染可導致線粒體損傷，釋放線粒體DNA（mtDNA）等損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），這些DAMPs可激活NLRP3炎癥小體。nsp2氨基酸缺失可能改變病毒對線粒體的損傷程度，從而影響mtDNA的釋放，進而影響NLRP3炎癥小體的激活和炎癥因子的產(chǎn)生。此外，nsp2氨基酸缺失還可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路來影響炎癥因子的表達。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著核心調(diào)控作用。正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中。當細胞受到病毒感染等刺激時，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，釋放出NF-κB，NF-κB進入細胞核，與炎癥因子基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，啟動炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄。有研究表明，nsp2能夠與IKK復合物相互作用，影響IKK的活性，從而調(diào)節(jié)NF-κB信號通路。當nsp2發(fā)生氨基酸缺失時，其與IKK復合物的相互作用可能發(fā)生改變，導致NF-κB信號通路的激活受到抑制，進而減少炎癥因子如IL-6、TNF-α等的表達。綜上所述，nsp2氨基酸缺失通過影響NLRP3炎癥小體的激活以及NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)，從而對PRRSV感染細胞后的炎癥因子應(yīng)答產(chǎn)生調(diào)控作用。深入研究這些調(diào)控機制，對于理解PRRSV的致病機理以及開發(fā)新的免疫干預策略具有重要意義。4.4研究結(jié)果的應(yīng)用前景與局限性本研究成果在防控PRRS方面具有重要的應(yīng)用前景。從病毒復制機制的揭示來看，深入了解nsp2氨基酸缺失對病毒復制的影響，為開發(fā)新型抗病毒藥物提供了關(guān)鍵靶點?；诖?，科研人員可以針對nsp2蛋白與其他病毒蛋白或宿主細胞蛋白的相互作用位點，設(shè)計小分子抑制劑或干擾RNA，阻斷病毒復制復合物的形成，從而抑制病毒的復制。例如，通過計算機輔助藥物設(shè)計，篩選出能夠特異性結(jié)合nsp2突變位點的小分子化合物，干擾其與nsp9、nsp10等蛋白的相互作用，阻止病毒基因組的復制，為研發(fā)高效、特異性的抗PRRSV藥物奠定基礎(chǔ)。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，本研究結(jié)果也具有重要的指導意義。目前，PRRSV疫苗的保護效果受到病毒變異的影響，而nsp2氨基酸缺失是病毒變異的重要特征之一。通過對nsp2氨基酸缺失與病毒毒力、免疫原性之間關(guān)系的研究，可以優(yōu)化疫苗株的選擇和構(gòu)建。例如，選擇攜帶特定nsp2氨基酸缺失且免疫原性良好的毒株作為疫苗候選株，或者通過基因工程技術(shù)對現(xiàn)有疫苗株的nsp2基因進行修飾，使其更有效地激發(fā)機體的免疫應(yīng)答，提高疫苗的保護效果。此外，本研究對炎癥因子應(yīng)答調(diào)控機制的探討，也為開發(fā)免疫調(diào)節(jié)型疫苗佐劑提供了理論依據(jù)?？梢栽O(shè)計能夠調(diào)節(jié)炎癥因子表達的佐劑，增強疫苗接種后機體的免疫反應(yīng)，同時減少炎癥反應(yīng)帶來的副作用。然而，本研究也存在一定的局限性。在研究模型方面，雖然使用了Marc-145細胞和豬肺泡巨噬細胞（PAM）進行實驗，但細胞模型與豬體內(nèi)的實際感染環(huán)境存在差異。細胞培養(yǎng)條件相對簡單，缺乏體內(nèi)復雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和組織微環(huán)境。因此，研究結(jié)果在豬體內(nèi)的實際應(yīng)用效果可能會有所不同。未來的研究需要進一步開展動物實驗，在豬體內(nèi)驗證nsp2氨基酸缺失對病毒復制和炎癥因子應(yīng)答的影響，以更準確地評估其在實際生產(chǎn)中的意義。從研究深度來看，雖然揭示了nsp2氨基酸缺失對病毒復制和炎癥因子應(yīng)答的影響及其相關(guān)機制，但PRRSV的致病機制是一個復雜的網(wǎng)絡(luò)，涉及多個基因和信號通路的相互作用。本研究僅聚焦于nsp2氨基酸缺失這一因素，對于其他基因的變異以及它們與nsp2之間的協(xié)同作用研究較少。例如，PRRSV的其他非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的變異可能會影響nsp2的功能，或者與nsp2共同調(diào)控病毒的復制和宿主的免疫應(yīng)答。此外，宿主細胞的遺傳背景、生理狀態(tài)等因素也可能對研究結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，未來需要開展更全面、深入的研究，綜合考慮多個因素的相互作用，以更完整地揭示PRRSV的致病機制。本研究成果為PRRS的防控提供了有價值的理論依據(jù)和應(yīng)用方向，但仍需在研究模型和研究深度上進一步拓展和完善，以更好地應(yīng)對PRRS對養(yǎng)豬業(yè)的挑戰(zhàn)。五、結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論本研究通過對PRRSVnsp2基因的深入研究，系統(tǒng)地分析了nsp2氨基酸缺失對病毒在細胞中復制和炎癥因子應(yīng)答的影響，取得了以下主要研究成果：PRRSVnsp2基因遺傳進化特征：成功從病豬肺臟組織中分離到一株P(guān)RRSV，命名為SX-01株。通過對其nsp2基因的測序和遺傳進化分析，發(fā)現(xiàn)SX-01株與高致病性PRRSV毒株JXA1處于同一進化分支，親緣關(guān)系較近，且具有相似的nsp2氨基酸缺失模式，即在nsp2蛋白的第481-509位氨基酸處出現(xiàn)30個氨基酸的不連續(xù)缺失，確定SX-01株為高致病性PRRSV變異株。nsp2氨基酸缺失對病毒在細胞中復制的影響：構(gòu)建了多種攜帶不同