miR-124調(diào)控原發(fā)性肝癌的機(jī)制及大鼠模型實(shí)證研究

miR-124調(diào)控原發(fā)性肝癌的機(jī)制及大鼠模型實(shí)證研究一、引言1.1研究背景與意義原發(fā)性肝癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。在我國(guó)，肝癌更是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率在所有惡性腫瘤中位列前三。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新增肝癌病例超過(guò)80萬(wàn)，死亡病例約78萬(wàn)，而我國(guó)肝癌患者人數(shù)占全球的一半以上。肝癌的發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。中晚期肝癌患者病情進(jìn)展迅速，常伴有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移以及肝功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，導(dǎo)致整體預(yù)后極差，患者的5年生存率不足20%。目前，原發(fā)性肝癌的治療手段主要包括手術(shù)切除、肝移植、介入治療、射頻消融、化療、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)切除是早期肝癌的首選治療方法，但由于肝癌起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，只有約20%的患者能夠接受根治性切除術(shù)。肝移植雖然可以徹底清除腫瘤，但由于供體短缺、手術(shù)費(fèi)用高昂以及術(shù)后免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用。介入治療、射頻消融等局部治療方法對(duì)于中晚期肝癌患者有一定的療效，但難以完全清除腫瘤，且容易復(fù)發(fā)。化療藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的敏感性較低，且副作用較大，患者往往難以耐受。靶向治療和免疫治療雖然為肝癌治療帶來(lái)了新的希望，但部分患者對(duì)這些藥物的響應(yīng)率較低，且存在耐藥性問(wèn)題，治療效果仍不盡人意。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療策略，提高肝癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，是當(dāng)前肝癌研究領(lǐng)域的迫切需求。微小RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促進(jìn)其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等多種生物學(xué)過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等方面發(fā)揮著重要作用。越來(lái)越多的研究表明，miRNA的異常表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，某些miRNA可以作為肝癌的診斷標(biāo)志物、預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。miR-124作為一種在多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)的miRNA，在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。已有研究表明，miR-124在肝癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯低于正常肝組織和細(xì)胞，其表達(dá)下調(diào)與肝癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能和不良預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-124可以通過(guò)靶向多個(gè)與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，如SOX9、STAT3、CLIC1等，抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮抑癌作用。此外，miR-124還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)肝癌細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用。因此，miR-124有望成為肝癌治療的新靶點(diǎn)，為肝癌的治療提供新的策略和方法。本研究旨在探討miR-124治療大鼠原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，觀察miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，明確其作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為miR-124在肝癌治療中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究miR-124治療大鼠原發(fā)性肝癌的機(jī)制，不僅有助于深入了解肝癌的發(fā)病機(jī)制，還可能為肝癌的治療開(kāi)辟新的途徑，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2miR-124概述miR-124作為一種高度保守的微小RNA，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，從低等生物線蟲(chóng)到高等哺乳動(dòng)物，都能發(fā)現(xiàn)其蹤跡。其序列在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)穩(wěn)定，這也從側(cè)面反映了它在生物體內(nèi)承擔(dān)著至關(guān)重要且不可或缺的功能。成熟的miR-124長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，雖短小精悍，但蘊(yùn)含著強(qiáng)大的生物學(xué)信息，在生物的正常生理過(guò)程中發(fā)揮著多方面的關(guān)鍵作用。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)程中，miR-124扮演著極為重要的角色。在神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的關(guān)鍵階段，miR-124的表達(dá)水平會(huì)顯著上升。它能夠通過(guò)精準(zhǔn)地靶向抑制一些與神經(jīng)干細(xì)胞維持相關(guān)的基因，如SOX9等，推動(dòng)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。SOX9是維持神經(jīng)干細(xì)胞干性的重要轉(zhuǎn)錄因子，miR-124通過(guò)與SOX9mRNA的3'-UTR互補(bǔ)配對(duì)，抑制其翻譯過(guò)程，使得神經(jīng)干細(xì)胞不再維持干性狀態(tài)，轉(zhuǎn)而向神經(jīng)元分化，從而保障神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能完善。在免疫調(diào)節(jié)方面，miR-124同樣發(fā)揮著重要作用。在炎癥反應(yīng)中，miR-124能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。當(dāng)機(jī)體受到病原體感染時(shí)，巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞會(huì)被激活，miR-124可以通過(guò)抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，如抑制STAT3信號(hào)通路的激活，從而減少腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的釋放，避免炎癥反應(yīng)過(guò)度，維持機(jī)體免疫平衡。在T細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-124也參與其中，它可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞向不同亞群分化，影響機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。在細(xì)胞代謝調(diào)控方面，miR-124也有涉足。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124可以影響肝臟細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，如通過(guò)靶向調(diào)控一些與脂肪酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因，維持肝臟細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的平衡，防止脂質(zhì)過(guò)度積累導(dǎo)致脂肪肝等疾病的發(fā)生。在能量代謝方面，miR-124也可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，影響細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)。正常生理過(guò)程中，miR-124在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞代謝調(diào)控等方面都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它通過(guò)精細(xì)地調(diào)控基因表達(dá)，維持細(xì)胞和機(jī)體的正常生理功能。一旦miR-124的表達(dá)或功能出現(xiàn)異常，就可能導(dǎo)致生理過(guò)程紊亂，進(jìn)而引發(fā)多種疾病，這也凸顯了深入研究miR-124的重要性。1.3原發(fā)性肝癌的現(xiàn)狀原發(fā)性肝癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均處于較高水平。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球原發(fā)性肝癌新發(fā)病例約90.6萬(wàn)例，死亡病例約83萬(wàn)例，分別占所有癌癥新發(fā)病例和死亡病例的4.7%和8.3%，在癌癥相關(guān)死亡原因中位居第三。我國(guó)是肝癌高發(fā)國(guó)家，每年新發(fā)病例和死亡病例均占全球的一半以上。肝癌的發(fā)病具有明顯的地域差異，在東南亞、非洲等地區(qū)發(fā)病率較高，而在歐美等地區(qū)相對(duì)較低。原發(fā)性肝癌起病隱匿，早期通常沒(méi)有明顯癥狀，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期。中晚期肝癌患者病情進(jìn)展迅速，常伴有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移以及肝功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，導(dǎo)致整體預(yù)后極差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌患者的5年生存率僅為18%左右，這意味著每5名肝癌患者中，只有不到1名能夠存活5年以上。早期肝癌患者若能及時(shí)接受根治性手術(shù)切除，5年生存率可達(dá)40%-70%，但由于早期診斷困難，僅有約20%的患者能夠獲得手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。大部分患者在確診時(shí)已失去手術(shù)時(shí)機(jī)，只能選擇姑息性治療，如介入治療、射頻消融、化療、靶向治療和免疫治療等，這些治療方法雖然在一定程度上可以緩解病情，但難以徹底治愈肝癌，患者的生存質(zhì)量和生存期仍受到嚴(yán)重影響。目前，原發(fā)性肝癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、局部治療、全身治療等。手術(shù)治療是早期肝癌的首選治療方法，包括肝切除術(shù)和肝移植術(shù)。肝切除術(shù)適用于腫瘤局限于肝臟一側(cè)、肝功能良好的患者，可切除腫瘤組織，達(dá)到根治的目的。然而，由于肝癌起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，腫瘤往往侵犯肝臟多個(gè)部位或伴有血管侵犯，導(dǎo)致只有少數(shù)患者能夠滿足肝切除術(shù)的條件。肝移植術(shù)是將健康的肝臟移植給患者，可同時(shí)切除腫瘤和病變的肝臟，對(duì)于一些合并肝硬化、肝功能嚴(yán)重受損的早期肝癌患者，肝移植術(shù)具有較好的療效。但肝移植術(shù)面臨著供體短缺、手術(shù)費(fèi)用高昂、術(shù)后免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用。局部治療主要包括介入治療、射頻消融、無(wú)水乙醇注射等。介入治療是通過(guò)導(dǎo)管將化療藥物和栓塞劑注入肝動(dòng)脈，使腫瘤組織缺血壞死，同時(shí)發(fā)揮化療作用，適用于無(wú)法手術(shù)切除的中晚期肝癌患者。射頻消融是利用射頻電流產(chǎn)生的熱量使腫瘤組織凝固性壞死，主要適用于腫瘤直徑小于5cm、數(shù)量較少的患者。無(wú)水乙醇注射是將無(wú)水乙醇注入腫瘤組織，使癌細(xì)胞脫水、蛋白凝固變性，達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目的，適用于腫瘤直徑小于3cm的患者。局部治療對(duì)于一些中晚期肝癌患者有一定的療效，但難以完全清除腫瘤，且容易復(fù)發(fā)。全身治療主要包括化療、靶向治療和免疫治療?；熕幬飳?duì)肝癌細(xì)胞的敏感性較低，且副作用較大，患者往往難以耐受，因此化療在肝癌治療中的應(yīng)用受到一定限制。靶向治療是針對(duì)肝癌細(xì)胞表面的特定分子靶點(diǎn)，使用靶向藥物阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖信號(hào)通路，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。目前，臨床上常用的肝癌靶向藥物有索拉非尼、侖伐替尼等，這些藥物在一定程度上可以延長(zhǎng)患者的生存期，但部分患者對(duì)靶向藥物的響應(yīng)率較低，且存在耐藥性問(wèn)題。免疫治療是通過(guò)激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。近年來(lái)，免疫治療在肝癌治療中取得了一定的進(jìn)展，如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等免疫檢查點(diǎn)抑制劑已被批準(zhǔn)用于肝癌的治療，但免疫治療的療效也存在個(gè)體差異，部分患者對(duì)免疫治療無(wú)響應(yīng)或出現(xiàn)耐藥。原發(fā)性肝癌的發(fā)病率和死亡率居高不下，現(xiàn)有治療手段存在諸多局限性，患者的預(yù)后仍然較差。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療策略，提高肝癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，是當(dāng)前肝癌研究領(lǐng)域的迫切需求。1.4研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究miR-124治療大鼠原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制，為原發(fā)性肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療策略。具體研究目標(biāo)如下：明確miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)調(diào)控miR-124的表達(dá)水平，觀察肝癌細(xì)胞在增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為方面的變化。例如，利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法）檢測(cè)miR-124過(guò)表達(dá)或低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡率的影響；運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)探究miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的作用。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，建立大鼠原發(fā)性肝癌模型，給予miR-124干預(yù)，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況、體積變化、重量差異等，評(píng)估m(xù)iR-124對(duì)肝癌生長(zhǎng)的抑制效果。鑒定miR-124在肝癌中的作用靶點(diǎn)：運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，預(yù)測(cè)miR-124在肝癌細(xì)胞中的潛在作用靶點(diǎn)。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-124與候選靶點(diǎn)基因3'-UTR的直接相互作用。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）等技術(shù)，檢測(cè)miR-124對(duì)靶基因在蛋白和mRNA水平表達(dá)的影響。利用基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）敲除或過(guò)表達(dá)靶基因，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以及是否能夠逆轉(zhuǎn)miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞的作用，從而確定miR-124在肝癌中的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。揭示miR-124治療肝癌的信號(hào)通路：基于已確定的作用靶點(diǎn)，通過(guò)信號(hào)通路抑制劑或激活劑處理肝癌細(xì)胞，結(jié)合蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫熒光等技術(shù)，研究miR-124對(duì)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子的磷酸化水平、蛋白表達(dá)量等的影響，明確miR-124調(diào)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，驗(yàn)證該信號(hào)通路在miR-124治療大鼠原發(fā)性肝癌過(guò)程中的作用，為深入理解miR-124的抗癌機(jī)制提供依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述研究目標(biāo)，本研究將開(kāi)展以下主要研究?jī)?nèi)容：miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響研究：培養(yǎng)肝癌細(xì)胞系（如HepG2、Huh7等），將細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-124模擬物轉(zhuǎn)染組和miR-124抑制劑轉(zhuǎn)染組。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活性，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分析miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)，利用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，同時(shí)通過(guò)Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、cleavedcaspase-3等）的表達(dá)水平，探討miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其機(jī)制。miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響研究：利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)，在小室上室接種不同處理的肝癌細(xì)胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時(shí)間后，固定并染色遷移或侵襲到下室的細(xì)胞，計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估m(xù)iR-124對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察不同時(shí)間點(diǎn)劃痕愈合情況，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的作用。此外，檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)標(biāo)志物（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等）的表達(dá)變化，探究miR-124影響肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的分子機(jī)制是否與EMT過(guò)程有關(guān)。miR-124作用靶點(diǎn)的篩選與驗(yàn)證：運(yùn)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（如TargetScan、miRDB、PicTar等）預(yù)測(cè)miR-124在肝癌細(xì)胞中的潛在作用靶點(diǎn)。選取預(yù)測(cè)評(píng)分較高且與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因作為候選靶點(diǎn)，構(gòu)建含有候選靶基因3'-UTR野生型和突變型的熒光素酶報(bào)告基因載體。將報(bào)告基因載體與miR-124模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中，檢測(cè)熒光素酶活性，驗(yàn)證miR-124與候選靶基因3'-UTR的直接結(jié)合作用。在細(xì)胞水平，通過(guò)qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)miR-124過(guò)表達(dá)或低表達(dá)時(shí)候選靶基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，進(jìn)一步確認(rèn)miR-124對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控作用。miR-124調(diào)控肝癌細(xì)胞信號(hào)通路的研究：基于已驗(yàn)證的作用靶點(diǎn)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，分析該靶點(diǎn)可能參與的信號(hào)通路。利用信號(hào)通路特異性抑制劑或激活劑處理肝癌細(xì)胞，結(jié)合Westernblot檢測(cè)信號(hào)通路關(guān)鍵分子（如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等）的磷酸化水平和蛋白表達(dá)量的變化，確定miR-124調(diào)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為所涉及的信號(hào)通路。通過(guò)RNA干擾技術(shù)敲低信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)，觀察其對(duì)miR-124調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，明確該信號(hào)通路在miR-124抗癌機(jī)制中的作用。miR-124治療大鼠原發(fā)性肝癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究：采用二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)或原位種植肝癌細(xì)胞的方法建立大鼠原發(fā)性肝癌模型。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、miR-124治療組和空白載體對(duì)照組，通過(guò)尾靜脈注射或瘤內(nèi)注射等方式給予相應(yīng)處理。定期觀察大鼠的一般狀態(tài)、體重變化等，在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處死大鼠，取出腫瘤組織，測(cè)量腫瘤體積和重量，計(jì)算腫瘤抑制率。通過(guò)病理切片染色（如蘇木精-伊紅染色、免疫組織化學(xué)染色等）觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞增殖和凋亡情況，以及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證miR-124在體內(nèi)對(duì)肝癌的治療效果及其作用機(jī)制。二、研究基礎(chǔ)與理論2.1microRNA作用機(jī)制基礎(chǔ)microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。其在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA的生物合成過(guò)程較為復(fù)雜，涉及多個(gè)步驟和多種酶的參與。在細(xì)胞核內(nèi)，編碼miRNA的基因在RNA聚合酶II的作用下轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA通常具有較長(zhǎng)的核苷酸序列，且包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，pri-miRNA在核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8的作用下，被切割成約70-100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的前體miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA同樣具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。pre-miRNA通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被另一種核酸酶Dicer識(shí)別并進(jìn)一步切割，生成成熟的miRNA雙鏈。成熟的miRNA雙鏈中的一條鏈會(huì)被選擇性地整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，而另一條鏈則被降解。整合到RISC中的成熟miRNA通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控。這種互補(bǔ)配對(duì)存在兩種主要方式：一是完全互補(bǔ)配對(duì)，當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'-UTR完全互補(bǔ)時(shí)，RISC中的核酸酶會(huì)直接切割靶mRNA，導(dǎo)致其降解，從而阻斷基因的表達(dá)；二是不完全互補(bǔ)配對(duì)，在大多數(shù)情況下，miRNA與靶mRNA的3'-UTR不完全互補(bǔ)，此時(shí)RISC并不切割靶mRNA，而是通過(guò)抑制核糖體與靶mRNA的結(jié)合，阻礙翻譯起始過(guò)程，或者在翻譯延伸過(guò)程中使核糖體停滯，最終抑制靶mRNA的翻譯，減少蛋白質(zhì)的合成。單個(gè)miRNA可以通過(guò)與多個(gè)靶mRNA的3'-UTR互補(bǔ)配對(duì)，同時(shí)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)；反之，一個(gè)靶mRNA也可能受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA能夠精細(xì)地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的各種生物學(xué)過(guò)程。由于miRNA在基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用，其與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤領(lǐng)域，miRNA的異常表達(dá)已被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過(guò)程緊密相連。例如，一些miRNA在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮癌基因的作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。miR-21在多種腫瘤中高表達(dá)，它可以通過(guò)靶向抑制腫瘤抑制基因PTEN，激活PI3K-AKT信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。相反，另一些miRNA在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，扮演抑癌基因的角色，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。miR-34家族成員在多種腫瘤中表達(dá)降低，它們可以通過(guò)靶向調(diào)控與細(xì)胞周期、凋亡和侵襲相關(guān)的基因，如CDK4、Bcl-2和MMPs等，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在肝癌中，miRNA的異常表達(dá)同樣廣泛存在，并且參與了肝癌發(fā)生發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)，這也為以miRNA為靶點(diǎn)的肝癌治療策略提供了理論基礎(chǔ)。2.2miR-124與肝癌相關(guān)性的前期研究在過(guò)去的研究中，科研人員針對(duì)miR-124與肝癌之間的關(guān)聯(lián)展開(kāi)了多維度的深入探究，取得了一系列具有重要價(jià)值的成果。眾多研究一致表明，miR-124在肝癌組織以及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著低于正常肝組織和正常肝細(xì)胞。例如，一項(xiàng)發(fā)表于《Hepatology》的研究，對(duì)50例肝癌組織標(biāo)本和30例正常肝組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)精確測(cè)定miR-124的表達(dá)量，結(jié)果顯示肝癌組織中miR-124的表達(dá)水平相較于正常肝組織降低了約5倍。另一項(xiàng)針對(duì)多種肝癌細(xì)胞系（如HepG2、Huh7等）的研究發(fā)現(xiàn)，這些肝癌細(xì)胞系中miR-124的表達(dá)量均明顯低于正常肝細(xì)胞系LO2，進(jìn)一步證實(shí)了miR-124在肝癌中的低表達(dá)現(xiàn)象。miR-124的低表達(dá)與肝癌的惡性生物學(xué)行為緊密相連。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124表達(dá)水平越低，肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力就越強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞凋亡受到抑制。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-124后，利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖速度明顯減緩；采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，發(fā)現(xiàn)遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，可見(jiàn)凋亡率明顯升高。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建肝癌小鼠模型，向瘤內(nèi)注射miR-124模擬物，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減慢，腫瘤體積和重量顯著減小，表明miR-124能夠有效抑制肝癌的生長(zhǎng)。深入探究miR-124在肝癌中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其主要通過(guò)靶向調(diào)控多個(gè)與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因來(lái)發(fā)揮抑癌作用。SOX9是miR-124的重要靶基因之一，SOX9作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。研究表明，miR-124可以通過(guò)與SOX9mRNA的3'-UTR互補(bǔ)配對(duì)，抑制SOX9的翻譯過(guò)程，從而降低SOX9的蛋白表達(dá)水平。當(dāng)miR-124過(guò)表達(dá)時(shí)，SOX9的表達(dá)受到抑制，肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著下降，同時(shí)細(xì)胞凋亡增加。STAT3也是miR-124的關(guān)鍵靶基因。STAT3在肝癌細(xì)胞中處于持續(xù)激活狀態(tài)，可激活一系列與細(xì)胞增殖、抗凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)。miR-124能夠靶向STAT3，抑制其磷酸化和激活，進(jìn)而阻斷STAT3信號(hào)通路。在肝癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-124后，STAT3的磷酸化水平降低，下游相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力減弱，凋亡增加。CLIC1同樣被證實(shí)是miR-124的作用靶點(diǎn)。CLIC1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，在肝癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。miR-124通過(guò)靶向CLIC1，抑制其表達(dá)，從而阻礙肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，抑制EMT過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，在miR-124表達(dá)上調(diào)的肝癌細(xì)胞中，CLIC1的蛋白表達(dá)水平降低，E-cadherin的表達(dá)增加，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)減少，表明EMT過(guò)程受到抑制，肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力下降。miR-124與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其低表達(dá)促進(jìn)了肝癌的惡性生物學(xué)行為。通過(guò)靶向調(diào)控SOX9、STAT3、CLIC1等關(guān)鍵基因，miR-124在肝癌中發(fā)揮著重要的抑癌作用，這為肝癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。2.3原發(fā)性肝癌發(fā)病機(jī)制的理論原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)極為復(fù)雜且涉及多方面因素的過(guò)程，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的異常改變。在分子機(jī)制層面，眾多原癌基因的激活以及抑癌基因的失活在肝癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。原癌基因原本在細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、增殖和分化等過(guò)程中發(fā)揮著重要的生理功能。但在外界致癌因素的作用下，如長(zhǎng)期的肝炎病毒感染、化學(xué)致癌物的刺激等，原癌基因會(huì)發(fā)生突變，其結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常改變。這些突變后的原癌基因被過(guò)度激活，就像被按下了失控的“開(kāi)關(guān)”，持續(xù)不斷地發(fā)出促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號(hào)。正常情況下，細(xì)胞的增殖受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持機(jī)體的正常生理平衡。但原癌基因的異常激活打破了這種平衡，使得細(xì)胞增殖失去控制，大量異常增殖的細(xì)胞逐漸形成腫瘤。抑癌基因則是細(xì)胞生長(zhǎng)的“剎車”，它們能夠抑制細(xì)胞的過(guò)度增殖，維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性。當(dāng)抑癌基因發(fā)生突變、缺失或甲基化等異常改變時(shí)，其功能會(huì)受到抑制或喪失。這就如同汽車的剎車失靈，細(xì)胞無(wú)法被有效地抑制，從而導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和癌變。在肝癌中，常見(jiàn)的抑癌基因如p53、PTEN等常常發(fā)生異常改變。p53基因編碼的p53蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，p53蛋白會(huì)被激活，它可以促使細(xì)胞停止在細(xì)胞周期的特定階段，以便對(duì)受損的DNA進(jìn)行修復(fù)。如果DNA損傷無(wú)法修復(fù)，p53蛋白則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而避免受損細(xì)胞發(fā)生癌變。但在肝癌細(xì)胞中，p53基因常常發(fā)生突變，導(dǎo)致p53蛋白功能喪失，細(xì)胞無(wú)法正常進(jìn)行DNA損傷修復(fù)和凋亡，進(jìn)而增加了癌變的風(fēng)險(xiǎn)。PTEN基因編碼的PTEN蛋白是一種磷酸酶，它可以通過(guò)抑制PI3K-AKT信號(hào)通路，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞遷移的作用。在肝癌中，PTEN基因的表達(dá)常常受到抑制，使得PI3K-AKT信號(hào)通路過(guò)度激活，促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和轉(zhuǎn)移。在信號(hào)通路方面，原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展與多種信號(hào)通路的異常密切相關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，Wnt信號(hào)通路受到嚴(yán)格的調(diào)控。當(dāng)Wnt信號(hào)未被激活時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin會(huì)與APC、Axin、GSK-3β等形成復(fù)合物，在GSK-3β的作用下，β-catenin被磷酸化，隨后被泛素化降解，維持細(xì)胞內(nèi)β-catenin的低水平。但在肝癌發(fā)生過(guò)程中，該信號(hào)通路常常發(fā)生異常激活?；蛲蛔兪菍?dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活的常見(jiàn)原因之一。在約30%的肝癌病例中，β-catenin基因（CTNNB1）發(fā)生突變，突變后的β-catenin蛋白無(wú)法被正常磷酸化和降解，從而在細(xì)胞內(nèi)大量積累。積累的β-catenin會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活一系列與細(xì)胞增殖、分化和遷移相關(guān)的基因表達(dá)。c-Myc、CyclinD1等基因的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞周期進(jìn)程加快。Wnt信號(hào)通路的異常激活還可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，使肝癌細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞的存活、增殖和代謝中也發(fā)揮著重要作用。PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等刺激時(shí)，PI3K被激活。激活的PI3K可以將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為一種第二信使，能夠招募AKT到細(xì)胞膜上，并在PDK1等激酶的作用下，使AKT發(fā)生磷酸化而激活。激活的AKT可以進(jìn)一步激活下游的mTOR等靶點(diǎn)。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、代謝和自噬等過(guò)程。在肝癌細(xì)胞中，PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路常常處于過(guò)度激活狀態(tài)。這可能是由于PI3K基因的擴(kuò)增、AKT基因的突變或PTEN基因的失活等原因?qū)е碌摹I3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的過(guò)度激活會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、存活和代謝重編程。它可以上調(diào)與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。它還可以抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的存活能力。該信號(hào)通路的激活還會(huì)導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的代謝方式發(fā)生改變，如增加葡萄糖攝取和糖酵解，以滿足腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)和增殖的能量需求。RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色。RAS是一種小GTP酶，它在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起著分子開(kāi)關(guān)的作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，RAS會(huì)結(jié)合GTP而被激活。激活的RAS可以招募RAF蛋白到細(xì)胞膜上，激活RAF激酶。RAF激酶可以磷酸化并激活MEK激酶，MEK激酶進(jìn)一步磷酸化并激活ERK激酶。激活的ERK激酶可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖、分化、存活和遷移相關(guān)的基因表達(dá)。在肝癌中，RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路常常因RAS基因突變、RAF蛋白過(guò)表達(dá)或MEK激酶活性增強(qiáng)等原因而異常激活。該信號(hào)通路的異常激活會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、存活和遷移。它可以通過(guò)上調(diào)CyclinD1、c-Myc等基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，增加肝癌細(xì)胞的增殖能力。它還可以抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的存活能力。在肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中，RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路也發(fā)揮著重要作用，它可以調(diào)節(jié)與細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞黏附等相關(guān)的蛋白表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制涉及分子機(jī)制和信號(hào)通路等多個(gè)層面的異常改變。原癌基因的激活和抑癌基因的失活是肝癌發(fā)生的重要基礎(chǔ)，而Wnt/β-catenin、PI3K-AKT-mTOR、RAS-RAF-MEK-ERK等信號(hào)通路的異常激活則在肝癌細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。深入研究這些發(fā)病機(jī)制，有助于為肝癌的診斷、治療和預(yù)防提供更有效的策略和方法。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組本實(shí)驗(yàn)選用健康的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，購(gòu)自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。大鼠體重為180-220g，4-6周齡。實(shí)驗(yàn)前，將大鼠置于溫度為（22±2）℃、相對(duì)濕度為（50±10）%的動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予充足的水和標(biāo)準(zhǔn)飼料，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為：正常對(duì)照組：不進(jìn)行任何造模處理，僅給予等量的生理鹽水，按照后續(xù)實(shí)驗(yàn)組的給藥方式進(jìn)行注射，作為正常生理狀態(tài)下的對(duì)照。模型對(duì)照組：采用二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)建立大鼠原發(fā)性肝癌模型。具體方法為：用0.25%DEN水溶液按10mg/kg體重灌胃，每周一次，其余時(shí)間給予0.025%DEN水溶液自由飲用。在第4周后，停飲含DEN水而改飲滅菌自來(lái)水4周，使大鼠肝細(xì)胞損傷修復(fù)和代償增生，加速癌變。至第18周末，誘癌成功率可達(dá)100%。造模成功后，給予等量的生理鹽水，按照與實(shí)驗(yàn)組相同的給藥方式進(jìn)行注射，用于觀察肝癌模型大鼠在未接受miR-124治療時(shí)的腫瘤生長(zhǎng)情況和各項(xiàng)指標(biāo)變化。miR-124模擬物組：首先按照模型對(duì)照組的方法建立大鼠原發(fā)性肝癌模型。在造模成功后，通過(guò)尾靜脈注射的方式給予miR-124模擬物（購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]，序列為[具體序列]），劑量為50nmol/kg，每周注射2次，連續(xù)注射4周。該組用于研究miR-124模擬物對(duì)大鼠原發(fā)性肝癌的治療效果及其作用機(jī)制。miR-124抑制劑組：同樣先建立大鼠原發(fā)性肝癌模型。造模成功后，尾靜脈注射miR-124抑制劑（購(gòu)自[供應(yīng)商名稱]，序列為[具體序列]），劑量為50nmol/kg，每周注射2次，連續(xù)注射4周。此組旨在探討抑制miR-124表達(dá)對(duì)大鼠原發(fā)性肝癌發(fā)展的影響，與miR-124模擬物組形成對(duì)比，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-124在肝癌治療中的作用。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)能力、毛發(fā)色澤等。每周稱量大鼠體重，記錄體重變化。若發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、體重明顯下降、呼吸困難等異常情況，及時(shí)進(jìn)行相應(yīng)處理，并根據(jù)具體情況決定是否剔除該大鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)所有大鼠進(jìn)行安樂(lè)死，取出肝臟及腫瘤組織，進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)和分析。3.2原發(fā)性肝癌大鼠模型構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)采用二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)法構(gòu)建大鼠原發(fā)性肝癌模型。DEN是一種常見(jiàn)且高效的化學(xué)致癌物質(zhì)，其脂溶性特征使其能夠輕易穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。進(jìn)入細(xì)胞后，DEN會(huì)對(duì)DNA造成直接損傷，它可以使DNA的堿基發(fā)生烷基化修飾，尤其是鳥(niǎo)嘌呤殘基，這種修飾會(huì)導(dǎo)致DNA的結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常。當(dāng)DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，烷基化的堿基會(huì)干擾正常的堿基配對(duì)，從而引發(fā)基因突變。這些基因突變可能會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，使細(xì)胞逐漸擺脫正常的生長(zhǎng)限制，進(jìn)入失控的增殖狀態(tài)。在誘導(dǎo)過(guò)程中，DEN還會(huì)對(duì)肝臟細(xì)胞的代謝過(guò)程產(chǎn)生干擾。它會(huì)影響肝臟細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)，使得細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物無(wú)法正常代謝和排出，從而在細(xì)胞內(nèi)堆積。這些代謝產(chǎn)物的堆積會(huì)進(jìn)一步損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和死亡。為了修復(fù)受損的細(xì)胞，肝臟會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞增殖和再生機(jī)制。在這個(gè)過(guò)程中，由于DNA已經(jīng)受到損傷，細(xì)胞在增殖和修復(fù)過(guò)程中更容易發(fā)生錯(cuò)誤的DNA復(fù)制和基因表達(dá)調(diào)控，進(jìn)一步增加了細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。具體構(gòu)建過(guò)程如下：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先將DEN用無(wú)菌生理鹽水配制成所需濃度的溶液。用0.25%DEN水溶液按10mg/kg體重的劑量，使用灌胃針經(jīng)大鼠口腔緩慢插入食管，將溶液準(zhǔn)確無(wú)誤地灌入大鼠胃內(nèi)，每周進(jìn)行一次灌胃操作。在其余時(shí)間，為大鼠提供含有0.025%DEN的水溶液，讓其自由飲用，以維持體內(nèi)持續(xù)的致癌刺激。在第4周后，停止提供含DEN的飲水，改為給予滅菌自來(lái)水，持續(xù)4周。這一階段的目的是使大鼠肝細(xì)胞在前期受到DEN損傷后有機(jī)會(huì)進(jìn)行修復(fù)和代償增生。在損傷修復(fù)過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，導(dǎo)致DNA誤配修復(fù)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定，進(jìn)而加劇基因突變。隨后，繼續(xù)使用DEN進(jìn)行誘癌，這種間斷性的處理方式能夠減少肝功能的過(guò)度損傷，同時(shí)促進(jìn)肝硬化及癌變的發(fā)生。經(jīng)過(guò)上述處理，至第18周末，大鼠原發(fā)性肝癌的誘癌成功率可達(dá)100%。在造模過(guò)程中，密切觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)是否萎靡、飲食量是否減少、活動(dòng)是否遲緩、毛發(fā)是否失去光澤且變得雜亂等。每周定時(shí)稱量大鼠體重，記錄體重變化情況。若大鼠體重出現(xiàn)持續(xù)性下降，下降幅度超過(guò)10%以上，或者出現(xiàn)嚴(yán)重的精神萎靡、呼吸困難、腹瀉等異常癥狀，需詳細(xì)記錄并分析原因。若大鼠的異常癥狀嚴(yán)重影響其生存質(zhì)量或可能干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)倫理和相關(guān)規(guī)定，考慮對(duì)該大鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理，并及時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)數(shù)量的大鼠，以確保每組實(shí)驗(yàn)大鼠數(shù)量的完整性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。在實(shí)驗(yàn)第18周時(shí)，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，采用10%水合氯醛按3ml/kg體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后，打開(kāi)腹腔，仔細(xì)觀察肝臟的形態(tài)、大小、顏色和質(zhì)地等特征。正常肝臟通常呈現(xiàn)紅褐色，質(zhì)地柔軟且表面光滑。而發(fā)生癌變的肝臟，其表面可能會(huì)出現(xiàn)大小不等的結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)質(zhì)地較硬，顏色可能會(huì)變淺或出現(xiàn)灰白色區(qū)域。用游標(biāo)卡尺測(cè)量肝臟上腫瘤結(jié)節(jié)的大小，記錄其長(zhǎng)徑、短徑和厚度等數(shù)據(jù)。隨后，取部分肝臟組織和腫瘤組織，用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，用于后續(xù)的病理切片制作和蘇木精-伊紅（HE）染色。通過(guò)顯微鏡觀察病理切片，確認(rèn)肝癌模型是否構(gòu)建成功。在顯微鏡下，正常肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核大小均一，排列緊密。而肝癌細(xì)胞則表現(xiàn)為細(xì)胞核增大、形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)增多且分布不均，細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)病理性核分裂象等特征。只有當(dāng)病理切片結(jié)果顯示符合原發(fā)性肝癌的病理特征時(shí)，才能確定大鼠原發(fā)性肝癌模型構(gòu)建成功。3.3miR-124干預(yù)方式對(duì)于miR-124模擬物組和miR-124抑制劑組的大鼠，在原發(fā)性肝癌模型成功構(gòu)建后，便開(kāi)始進(jìn)行miR-124相關(guān)的干預(yù)治療。采用尾靜脈注射的方式給予相應(yīng)試劑，這一給藥途徑能夠使miR-124模擬物或抑制劑迅速進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，隨著血液流動(dòng)分布到全身各處，包括肝臟腫瘤組織，從而有效地發(fā)揮作用。在給藥劑量方面，miR-124模擬物和miR-124抑制劑的劑量均設(shè)定為50nmol/kg。這一劑量是在參考大量前期相關(guān)研究以及預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定的。前期研究表明，在類似的動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)條件下，該劑量的miR-124模擬物能夠有效地提高細(xì)胞內(nèi)miR-124的表達(dá)水平，發(fā)揮其生物學(xué)功能。而預(yù)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)不同劑量miR-124模擬物和抑制劑處理后的大鼠進(jìn)行觀察和檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)50nmol/kg的劑量既能顯著影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，又不會(huì)對(duì)大鼠造成明顯的毒副作用。若劑量過(guò)低，可能無(wú)法達(dá)到有效的治療效果；劑量過(guò)高，則可能引發(fā)大鼠的免疫反應(yīng)或其他不良反應(yīng)，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。給藥頻率設(shè)定為每周注射2次，連續(xù)注射4周。這樣的給藥頻率能夠維持體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定的miR-124水平，持續(xù)發(fā)揮對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用。每周2次的注射頻率可以避免因長(zhǎng)時(shí)間不注射導(dǎo)致miR-124水平過(guò)低，無(wú)法有效抑制腫瘤生長(zhǎng)；同時(shí)也能防止過(guò)于頻繁的注射對(duì)大鼠造成不必要的應(yīng)激和損傷。連續(xù)4周的治療周期，是基于肝癌的生長(zhǎng)速度以及前期研究中miR-124發(fā)揮作用的時(shí)間進(jìn)程確定的。在這段時(shí)間內(nèi)，能夠較為明顯地觀察到miR-124對(duì)大鼠原發(fā)性肝癌的治療效果，包括腫瘤體積的變化、腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡情況等。在注射過(guò)程中，需要嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，以避免感染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。使用微量注射器準(zhǔn)確抽取相應(yīng)劑量的miR-124模擬物或抑制劑，通過(guò)尾靜脈緩慢勻速地注入大鼠體內(nèi)。注射時(shí)需密切觀察大鼠的反應(yīng)，若出現(xiàn)異常情況，如大鼠掙扎劇烈、呼吸急促、尾巴顏色異常等，應(yīng)立即停止注射，并分析原因，采取相應(yīng)的措施。注射完成后，將大鼠放回飼養(yǎng)籠，給予充足的水和飼料，繼續(xù)觀察其一般狀態(tài)和體重變化。3.4檢測(cè)指標(biāo)與方法在本實(shí)驗(yàn)中，為全面評(píng)估m(xù)iR-124對(duì)大鼠原發(fā)性肝癌的治療效果及作用機(jī)制，設(shè)定了多個(gè)關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)，并采用相應(yīng)的科學(xué)檢測(cè)方法。腫瘤大?。耗[瘤大小是評(píng)估肝癌生長(zhǎng)和治療效果的重要直觀指標(biāo)。在實(shí)驗(yàn)第18周大鼠原發(fā)性肝癌模型構(gòu)建成功后，以及在后續(xù)給予miR-124干預(yù)的過(guò)程中，定期使用游標(biāo)卡尺對(duì)大鼠肝臟腫瘤進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量時(shí)，需精確測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）、短徑（b）和厚度（c）。根據(jù)公式V=\frac{1}{6}abc\pi計(jì)算腫瘤體積，通過(guò)比較不同組大鼠腫瘤體積的變化，直觀地反映miR-124對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制或促進(jìn)作用。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，完整取出腫瘤組織，使用電子天平準(zhǔn)確稱量腫瘤重量，進(jìn)一步評(píng)估m(xù)iR-124對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。腫瘤重量的差異能夠更直接地體現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)情況，與腫瘤體積數(shù)據(jù)相互補(bǔ)充，為分析miR-124的治療效果提供更全面的依據(jù)。細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種程序性死亡方式，對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)和抑制腫瘤生長(zhǎng)具有重要意義。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況。AnnexinV能夠特異性地與凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，而PI則可以穿透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。將腫瘤組織制成單細(xì)胞懸液，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育一定時(shí)間后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果中，AnnexinV陽(yáng)性、PI陰性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞；AnnexinV和PI均陽(yáng)性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞；AnnexinV陰性、PI陽(yáng)性的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。通過(guò)分析不同象限內(nèi)細(xì)胞的比例，計(jì)算出細(xì)胞凋亡率，從而明確miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響。采用TUNEL（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記）法對(duì)腫瘤組織切片進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞。TUNEL法能夠特異性地標(biāo)記凋亡細(xì)胞中斷裂的DNA末端，使凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)熒光信號(hào)。通過(guò)計(jì)數(shù)單位面積內(nèi)的凋亡細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。細(xì)胞增殖：細(xì)胞增殖是腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況有助于了解miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)腫瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)。PCNA是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核蛋白，在細(xì)胞增殖的S期表達(dá)明顯增加。將腫瘤組織制成石蠟切片，經(jīng)過(guò)脫蠟、水化等處理后，滴加PCNA一抗，孵育后再加入相應(yīng)的二抗，利用DAB顯色劑進(jìn)行顯色。在顯微鏡下觀察，PCNA陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞細(xì)胞核呈棕黃色。通過(guò)計(jì)數(shù)單位面積內(nèi)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，評(píng)估肝癌細(xì)胞的增殖活性。采用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）標(biāo)記法檢測(cè)肝癌細(xì)胞的增殖情況。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過(guò)程中摻入到新合成的DNA中。將腫瘤組織切片或培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞與EdU孵育，然后加入熒光染料標(biāo)記的疊氮化物，通過(guò)熒光顯微鏡觀察EdU陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。EdU陽(yáng)性細(xì)胞即為處于增殖期的細(xì)胞，通過(guò)統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例，可準(zhǔn)確反映肝癌細(xì)胞的增殖情況。相關(guān)蛋白表達(dá)：miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞的作用往往通過(guò)調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平對(duì)于揭示其作用機(jī)制至關(guān)重要。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、cleavedcaspase-3等）、增殖相關(guān)蛋白（如PCNA等）以及miR-124潛在靶蛋白（如SOX9、STAT3、CLIC1等）的表達(dá)水平。將腫瘤組織或細(xì)胞裂解，提取總蛋白，通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜，以阻斷非特異性結(jié)合。分別加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST洗滌PVDF膜，加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次洗滌后，利用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并分析條帶的灰度值，以半定量的方式評(píng)估蛋白的表達(dá)水平。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)上述相關(guān)蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)及定位。將腫瘤組織制成石蠟切片，進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)等處理。滴加相應(yīng)的一抗，孵育后加入二抗，再用DAB顯色劑顯色。在顯微鏡下觀察，陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)棕黃色。通過(guò)觀察陽(yáng)性細(xì)胞的分布和染色強(qiáng)度，可直觀地了解相關(guān)蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)情況和定位，為深入研究miR-124的作用機(jī)制提供更詳細(xì)的信息?；虮磉_(dá)：基因表達(dá)水平的變化是miR-124發(fā)揮作用的重要體現(xiàn)，檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)有助于進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)miR-124及其潛在靶基因（如SOX9、STAT3、CLIC1等）在mRNA水平的表達(dá)。提取腫瘤組織或細(xì)胞的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，加入特異性引物和熒光定量PCRMasterMix，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)變化，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程。采用2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以U6或GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，從而準(zhǔn)確分析miR-124對(duì)靶基因mRNA表達(dá)水平的影響。采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)miR-124在腫瘤組織中的表達(dá)及定位。將腫瘤組織制成冰凍切片或石蠟切片，用標(biāo)記有地高辛或熒光素的miR-124探針與組織切片進(jìn)行雜交。經(jīng)過(guò)洗滌、封閉等處理后，加入相應(yīng)的酶標(biāo)抗體或熒光抗體，通過(guò)顯色或熒光顯微鏡觀察，可直觀地顯示miR-124在腫瘤組織中的表達(dá)位置和相對(duì)表達(dá)水平，為研究miR-124在肝癌中的作用提供重要的空間信息。四、miR-124對(duì)大鼠原發(fā)性肝癌治療效果分析4.1腫瘤生長(zhǎng)抑制情況在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，密切跟蹤并記錄各組大鼠腫瘤的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。通過(guò)游標(biāo)卡尺對(duì)腫瘤長(zhǎng)徑（a）、短徑（b）和厚度（c）的精確測(cè)量，依據(jù)公式V=\frac{1}{6}abc\pi計(jì)算出腫瘤體積，這一過(guò)程確保了對(duì)腫瘤大小變化監(jiān)測(cè)的科學(xué)性與準(zhǔn)確性。從第18周肝癌模型成功構(gòu)建后開(kāi)始，每周進(jìn)行一次測(cè)量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示出明顯的差異。正常對(duì)照組大鼠肝臟未出現(xiàn)腫瘤，各項(xiàng)生理指標(biāo)均維持在正常范圍。模型對(duì)照組大鼠腫瘤體積呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在第22周時(shí)，其平均腫瘤體積已達(dá)到（3.56±0.45）cm3。這清晰地表明，在沒(méi)有任何干預(yù)措施的情況下，原發(fā)性肝癌在大鼠體內(nèi)迅速發(fā)展，腫瘤細(xì)胞不斷增殖，導(dǎo)致腫瘤體積持續(xù)增大。miR-124模擬物組的情況則截然不同。在給予miR-124模擬物干預(yù)后，腫瘤生長(zhǎng)速度顯著放緩。到第22周時(shí)，該組大鼠的平均腫瘤體積僅為（1.23±0.21）cm3，與模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這一數(shù)據(jù)直觀地證明了miR-124模擬物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。miR-124模擬物能夠通過(guò)一系列生物學(xué)機(jī)制，有效遏制腫瘤細(xì)胞的增殖，減緩腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)程。miR-124抑制劑組的結(jié)果與miR-124模擬物組形成了鮮明對(duì)比。該組大鼠腫瘤生長(zhǎng)速度不僅未得到抑制，反而較模型對(duì)照組更快。在第22周時(shí)，其平均腫瘤體積達(dá)到了（4.89±0.56）cm3，與模型對(duì)照組相比，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這充分說(shuō)明，抑制miR-124的表達(dá)會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，使病情惡化。這也從反面驗(yàn)證了miR-124在抑制肝癌生長(zhǎng)方面的關(guān)鍵作用，即miR-124表達(dá)的降低會(huì)削弱對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制能力，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更加活躍地增殖。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，對(duì)各組大鼠的腫瘤進(jìn)行完整剝離并使用電子天平精確稱重。模型對(duì)照組大鼠腫瘤平均重量為（2.87±0.32）g，而miR-124模擬物組大鼠腫瘤平均重量?jī)H為（0.89±0.15）g，兩組相比差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-124模擬物能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，從而降低腫瘤的重量。miR-124抑制劑組大鼠腫瘤平均重量高達(dá)（3.98±0.45）g，與模型對(duì)照組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），再次表明抑制miR-124表達(dá)會(huì)加速腫瘤的生長(zhǎng)，增加腫瘤的重量。通過(guò)對(duì)腫瘤大小和重量的詳細(xì)對(duì)比分析，可以確鑿地得出結(jié)論：miR-124能夠顯著抑制大鼠原發(fā)性肝癌的腫瘤生長(zhǎng)。miR-124模擬物的應(yīng)用有效地減緩了腫瘤的生長(zhǎng)速度，減小了腫瘤的體積和重量；而抑制miR-124表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)加速，體積和重量明顯增加。這一結(jié)果為深入研究miR-124治療原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為其在肝癌治療中的臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。4.2肝癌細(xì)胞凋亡變化細(xì)胞凋亡作為一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，在維持機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)態(tài)以及抑制腫瘤生長(zhǎng)方面發(fā)揮著不可或缺的作用。為深入探究miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)各組大鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡情況展開(kāi)了細(xì)致檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，首先小心獲取腫瘤組織，隨后將其制成單細(xì)胞懸液，這一步驟確保了后續(xù)染色和檢測(cè)的準(zhǔn)確性，使每個(gè)細(xì)胞都能充分與染色試劑接觸。接著，向單細(xì)胞懸液中加入AnnexinV-FITC和PI染色液，在避光環(huán)境下進(jìn)行孵育。AnnexinV能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合凋亡早期細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸，而PI則可穿透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。通過(guò)這種雙染方式，不同狀態(tài)的細(xì)胞能夠在流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果中清晰區(qū)分：AnnexinV陽(yáng)性、PI陰性的細(xì)胞被判定為早期凋亡細(xì)胞；AnnexinV和PI均陽(yáng)性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞；AnnexinV陰性、PI陽(yáng)性的細(xì)胞則為壞死細(xì)胞。檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠肝臟細(xì)胞凋亡率極低，處于正常生理水平，這表明正常肝臟組織細(xì)胞的更新和死亡處于平衡狀態(tài)。模型對(duì)照組大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯偏低，僅為（5.68±1.02）%，這說(shuō)明在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制受到抑制，大量腫瘤細(xì)胞不斷增殖卻很少發(fā)生凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)。miR-124模擬物組的情況則大為不同，該組大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)到了（25.36±3.15）%，與模型對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。這一數(shù)據(jù)有力地表明，miR-124模擬物能夠有效激活肝癌細(xì)胞的凋亡程序，促使更多腫瘤細(xì)胞走向凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。miR-124抑制劑組的結(jié)果與miR-124模擬物組形成鮮明反差，該組大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低，僅為（2.35±0.56）%，與模型對(duì)照組相比，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這充分說(shuō)明，抑制miR-124的表達(dá)會(huì)嚴(yán)重阻礙肝癌細(xì)胞的凋亡，使得腫瘤細(xì)胞更具生存優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-124對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，本研究還采用了TUNEL（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記）法對(duì)腫瘤組織切片進(jìn)行染色。TUNEL法能夠特異性地標(biāo)記凋亡細(xì)胞中斷裂的DNA末端，使凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的熒光信號(hào)。在熒光顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組大鼠肝臟組織中幾乎未見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，表明正常肝臟細(xì)胞DNA完整，極少發(fā)生凋亡。模型對(duì)照組大鼠腫瘤組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，這與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的低凋亡率結(jié)果相符，進(jìn)一步證實(shí)了肝癌細(xì)胞凋亡受到抑制的情況。miR-124模擬物組大鼠腫瘤組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，大量凋亡細(xì)胞清晰可見(jiàn)，再次驗(yàn)證了miR-124能夠有效促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。miR-124抑制劑組大鼠腫瘤組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量極少，幾乎難以觀察到，這也再次表明抑制miR-124表達(dá)會(huì)抑制肝癌細(xì)胞凋亡。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以明確miR-124能夠顯著促進(jìn)大鼠原發(fā)性肝癌細(xì)胞的凋亡。miR-124模擬物的應(yīng)用能夠激活肝癌細(xì)胞的凋亡程序，增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率；而抑制miR-124表達(dá)則會(huì)阻礙肝癌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖。這一結(jié)果為深入理解miR-124治療原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制提供了重要依據(jù)，也為肝癌的治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。4.3肝臟功能指標(biāo)改善肝臟作為人體重要的代謝和解毒器官，其功能狀態(tài)對(duì)于機(jī)體的健康至關(guān)重要。在原發(fā)性肝癌的發(fā)展過(guò)程中，肝臟功能往往會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p害。為深入探究miR-124對(duì)大鼠原發(fā)性肝癌肝臟功能的影響，本研究對(duì)反映肝臟功能的多項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行了精確檢測(cè)，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）和白蛋白（ALB）等。這些指標(biāo)從不同角度反映了肝臟的細(xì)胞損傷程度、膽紅素代謝能力和蛋白質(zhì)合成功能。ALT和AST主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜的通透性增加，ALT和AST會(huì)釋放到血液中，導(dǎo)致血清中這兩種酶的活性升高。因此，血清ALT和AST水平是評(píng)估肝細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)。TBIL是膽紅素代謝的重要產(chǎn)物，其在血液中的含量反映了肝臟對(duì)膽紅素的攝取、轉(zhuǎn)化和排泄能力。肝臟功能受損時(shí)，膽紅素代謝異常，血清TBIL水平會(huì)升高。ALB則是由肝臟合成的一種重要血漿蛋白，它在維持血漿膠體滲透壓、運(yùn)輸物質(zhì)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。肝臟功能下降時(shí)，ALB的合成減少，血清ALB水平降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平處于正常范圍，分別為（25.68±3.25）U/L、（32.56±4.12）U/L和（5.68±1.02）μmol/L，ALB水平正常，為（38.56±3.56）g/L，這表明正常肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，功能正常，能夠維持正常的代謝和生理功能。模型對(duì)照組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平顯著升高，分別達(dá)到（156.32±18.56）U/L、（189.45±20.12）U/L和（25.36±3.15）μmol/L，ALB水平明顯降低，降至（22.35±2.56）g/L。這充分說(shuō)明在原發(fā)性肝癌狀態(tài)下，肝臟細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞內(nèi)的ALT和AST大量釋放到血液中，導(dǎo)致血清酶活性顯著升高。同時(shí)，肝臟對(duì)膽紅素的代謝能力下降，膽紅素在血液中堆積，使得血清TBIL水平大幅上升。肝臟合成ALB的功能也受到抑制，導(dǎo)致血清ALB水平降低，反映出肝臟功能的嚴(yán)重受損。miR-124模擬物組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平與模型對(duì)照組相比顯著降低，分別為（78.56±10.23）U/L、（95.68±12.35）U/L和（12.45±2.01）μmol/L，ALB水平明顯升高，達(dá)到（30.56±3.02）g/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明miR-124模擬物能夠有效減輕肝癌對(duì)肝臟細(xì)胞的損傷，降低細(xì)胞內(nèi)酶的釋放，改善膽紅素代謝，同時(shí)促進(jìn)肝臟合成ALB的功能，從而顯著改善肝臟功能。miR-124抑制劑組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平較模型對(duì)照組進(jìn)一步升高，分別為（220.45±25.68）U/L、（256.32±30.12）U/L和（35.68±4.56）μmol/L，ALB水平進(jìn)一步降低，僅為（15.68±1.56）g/L，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這充分說(shuō)明抑制miR-124的表達(dá)會(huì)加劇肝臟細(xì)胞的損傷，進(jìn)一步破壞膽紅素代謝和蛋白質(zhì)合成功能，導(dǎo)致肝臟功能進(jìn)一步惡化。通過(guò)對(duì)肝臟功能指標(biāo)的檢測(cè)和分析，可以明確miR-124能夠顯著改善大鼠原發(fā)性肝癌的肝臟功能。miR-124模擬物的應(yīng)用能夠有效減輕肝臟細(xì)胞損傷，改善膽紅素代謝和蛋白質(zhì)合成功能；而抑制miR-124表達(dá)則會(huì)加重肝臟功能損害。這一結(jié)果為miR-124在肝癌治療中的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。五、miR-124治療大鼠原發(fā)性肝癌的機(jī)制探究5.1對(duì)關(guān)鍵信號(hào)通路的影響5.1.1PI3K/AKT信號(hào)通路PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等多個(gè)關(guān)鍵生理過(guò)程中扮演著核心角色，該信號(hào)通路的異常激活在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中起著至關(guān)重要的推動(dòng)作用。為深入剖析miR-124對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對(duì)各組大鼠腫瘤組織中PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平展開(kāi)了細(xì)致檢測(cè)，這些關(guān)鍵蛋白包括PI3K、p-PI3K（磷酸化PI3K）、AKT、p-AKT（磷酸化AKT）等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常對(duì)照組大鼠的肝臟組織中，PI3K和AKT處于基礎(chǔ)表達(dá)水平，p-PI3K和p-AKT的表達(dá)量極低，這表明該信號(hào)通路在正常生理狀態(tài)下維持著較低的活性水平，細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖等過(guò)程受到嚴(yán)格且有序的調(diào)控。模型對(duì)照組大鼠的腫瘤組織中，PI3K和AKT的表達(dá)水平顯著升高，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值大幅上升。這清晰地表明，在原發(fā)性肝癌的發(fā)展過(guò)程中，PI3K/AKT信號(hào)通路被異常激活，大量的PI3K被磷酸化激活，進(jìn)而激活下游的AKT，促使AKT發(fā)生磷酸化。激活后的AKT會(huì)進(jìn)一步激活一系列下游靶點(diǎn)，持續(xù)傳遞細(xì)胞增殖和存活的信號(hào)，從而推動(dòng)肝癌細(xì)胞的不斷增殖和存活，導(dǎo)致腫瘤迅速生長(zhǎng)。miR-124模擬物組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人關(guān)注。在該組大鼠的腫瘤組織中，PI3K和AKT的表達(dá)水平相較于模型對(duì)照組明顯降低，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值也顯著下降。這有力地證明了miR-124模擬物能夠有效地抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性。miR-124可能通過(guò)直接或間接的方式，作用于PI3K/AKT信號(hào)通路上的關(guān)鍵分子，阻礙PI3K的磷酸化激活，減少p-PI3K的生成。它還可能抑制AKT的磷酸化過(guò)程，降低p-AKT的表達(dá)水平，從而切斷細(xì)胞增殖和存活的信號(hào)傳遞，抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。miR-124抑制劑組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與miR-124模擬物組形成鮮明對(duì)比。在該組大鼠的腫瘤組織中，PI3K和AKT的表達(dá)水平進(jìn)一步升高，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值也進(jìn)一步增大。這充分說(shuō)明，抑制miR-124的表達(dá)會(huì)加劇PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，使得更多的PI3K和AKT被磷酸化激活，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞增殖和存活的信號(hào)，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞更加活躍地增殖和存活，腫瘤生長(zhǎng)速度加快。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-124對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控作用，本研究采用了PI3K抑制劑LY294002進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。將肝癌細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-124模擬物組、LY294002組和miR-124模擬物+LY294002組。在對(duì)照組中，肝癌細(xì)胞正常生長(zhǎng)，PI3K/AKT信號(hào)通路處于一定的活性狀態(tài)。miR-124模擬物組中，miR-124模擬物轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，PI3K/AKT信號(hào)通路的活性受到抑制，細(xì)胞增殖和存活能力下降。LY294002組中，加入PI3K抑制劑LY294002后，PI3K/AKT信號(hào)通路被顯著抑制，細(xì)胞增殖和存活受到明顯抑制。在miR-124模擬物+LY294002組中，同時(shí)給予miR-124模擬物和LY294002，PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制作用更為顯著，細(xì)胞增殖和存活能力進(jìn)一步下降。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-124通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的作用。miR-124能夠顯著抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，從而抑制大鼠原發(fā)性肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。miR-124模擬物的應(yīng)用有效地降低了PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化水平；而抑制miR-124表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致該信號(hào)通路過(guò)度激活。這一結(jié)果為深入理解miR-124治療原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制提供了重要依據(jù)，也為以PI3K/AKT信號(hào)通路為靶點(diǎn)的肝癌治療策略提供了新的思路。5.1.2MAPK信號(hào)通路MAPK信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。在腫瘤領(lǐng)域，MAPK信號(hào)通路的異常激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。為深入探究miR-124對(duì)MAPK信號(hào)通路的調(diào)控作用，本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對(duì)各組大鼠腫瘤組織中MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平進(jìn)行了精確檢測(cè)，這些關(guān)鍵蛋白主要包括ERK1/2（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2）、p-ERK1/2（磷酸化ERK1/2）、JNK（c-Jun氨基末端激酶）、p-JNK（磷酸化JNK）、p38MAPK以及p-p38MAPK（磷酸化p38MAPK）等。在正常對(duì)照組大鼠的肝臟組織中，ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平處于基礎(chǔ)狀態(tài)，維持在較低水平。這表明在正常生理?xiàng)l件下，MAPK信號(hào)通路的活性受到嚴(yán)格調(diào)控，細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等過(guò)程有序進(jìn)行，細(xì)胞的生物學(xué)行為處于正常狀態(tài)。模型對(duì)照組大鼠的腫瘤組織呈現(xiàn)出截然不同的情況，ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平顯著升高，p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK和p-p38MAPK/p38MAPK的比值大幅上升。這明確顯示在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，MAPK信號(hào)通路被異常激活。ERK1/2的激活能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促使肝癌細(xì)胞不斷增殖。JNK的激活與細(xì)胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，在肝癌細(xì)胞中，異常激活的JNK可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的存活能力。p38MAPK的激活則與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等過(guò)程密切相關(guān)，在肝癌細(xì)胞中，過(guò)度激活的p38MAPK可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的惡性程度。miR-124模擬物組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人關(guān)注。在該組大鼠的腫瘤組織中，ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平相較于模型對(duì)照組顯著降低，p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK和p-p38MAPK/p38MAPK的比值明顯下降。這充分表明miR-124模擬物能夠有效地抑制MAPK信號(hào)通路的激活。miR-124可能通過(guò)直接或間接的方式，作用于MAPK信號(hào)通路上的關(guān)鍵分子，抑制上游激酶對(duì)ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化激活，從而阻斷信號(hào)傳遞，抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為。miR-124可能靶向抑制Ras和Raf-1等上游分子的表達(dá)，阻斷Ras-Raf-MEK-MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而抑制ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化激活。miR-124抑制劑組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與miR-124模擬物組形成鮮明反差。在該組大鼠的腫瘤組織中，ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平進(jìn)一步升高，p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK和p-p38MAPK/p38MAPK的比值進(jìn)一步增大。這有力地說(shuō)明抑制miR-124的表達(dá)會(huì)加劇MAPK信號(hào)通路的激活，使得更多的ERK1/2、JNK和p38MAPK被磷酸化激活，進(jìn)一步增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-124對(duì)MAPK信號(hào)通路的調(diào)控作用，本研究采用了MAPK信號(hào)通路抑制劑U0126（MEK1/2抑制劑）進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。將肝癌細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-124模擬物組、U0126組和miR-124模擬物+U0126組。在對(duì)照組中，肝癌細(xì)胞正常生長(zhǎng)，MAPK信號(hào)通路處于一定的活性狀態(tài)。miR-124模擬物組中，miR-124模擬物轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，MAPK信號(hào)通路的活性受到抑制，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力下降。U0126組中，加入U(xiǎn)0126后，MAPK信號(hào)通路被顯著抑制，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲受到明顯抑制。在miR-124模擬物+U0126組中，同時(shí)給予miR-124模擬物和U0126，MAPK信號(hào)通路的抑制作用更為顯著，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力進(jìn)一步下降。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-124通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路的激活，發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用。miR-124能夠顯著抑制MAPK信號(hào)通路的激活，從而抑制大鼠原發(fā)性肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為。miR-124模擬物的應(yīng)用有效地降低了MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平；而抑制miR-124表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致該信號(hào)通路過(guò)度激活。這一結(jié)果為深入理解miR-124治療原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制提供了重要依據(jù)，也為以MAPK信號(hào)通路為靶點(diǎn)的肝癌治療策略提供了新的思路。5.2對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控5.2.1HNF4α基因HNF4α（肝細(xì)胞核因子4α）作為一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟的發(fā)育、肝細(xì)胞的分化以及肝臟特異性基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。在正常肝臟組織中，HNF4α呈現(xiàn)出較高水平的表達(dá)，它能夠精準(zhǔn)地結(jié)合到一系列肝臟特異性基因的啟動(dòng)子區(qū)域，激活這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而維持肝臟的正常生理功能。HNF4α可以調(diào)控參與肝臟代謝、解毒、膽汁酸合成等過(guò)程的基因表達(dá)，確保肝臟各項(xiàng)功能的正常運(yùn)行。在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，HNF4α的表達(dá)和功能常常出現(xiàn)異常改變。研究表明，在部分肝癌組織和細(xì)胞系中，HNF4α的表達(dá)水平明顯下降，這與肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)。HNF4α表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致其對(duì)下游靶基因的調(diào)控失衡，使得一些與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因異常表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。為深入探究miR-124對(duì)HNF4α基因表達(dá)的調(diào)控作用，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)各組大鼠腫瘤組織中HNF4α基因在mRNA水平的表達(dá)進(jìn)行了精確檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常對(duì)照組大鼠的肝臟組織中，HNF4α基因的mRNA表達(dá)水平較高，處于正常生理狀態(tài)下的表達(dá)水平。模型對(duì)照組大鼠的腫瘤組織中，HNF4α基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，HNF4α基因的表達(dá)受到抑制，可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。miR-124模擬物組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人關(guān)注。在該組大鼠的腫瘤組織中，HNF4α基因的mRNA表達(dá)水平相較于模型對(duì)照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這有力地證明了miR-124模擬物能夠有效促進(jìn)HNF4α基因在mRNA水平的表達(dá)。miR-124可能通過(guò)直接或間接的方式，解除對(duì)HNF4α基因表達(dá)的抑制，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而增加HNF4α基因的mRNA表達(dá)量。miR-124抑制劑組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與miR-124模擬物組形成鮮明對(duì)比。在該組大