RNA干擾介導(dǎo)EphB4基因沉默對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響研究

RNA干擾介導(dǎo)EphB4基因沉默對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響研究一、引言1.1研究背景胰腺癌作為消化系統(tǒng)中惡性程度極高的腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。中國(guó)國(guó)家癌癥中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年我國(guó)胰腺癌發(fā)病率位居惡性腫瘤中第9位，死亡率位居第6位。因其發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。并且胰腺癌具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性，生長(zhǎng)迅速，常常侵犯周圍組織和器官，導(dǎo)致手術(shù)切除率低，5年生存率低于5%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。傳統(tǒng)的治療方法，如手術(shù)切除、放療、化療等，對(duì)胰腺癌的療效并不理想。手術(shù)切除后容易復(fù)發(fā)，放化療的副作用大，患者耐受性差，且胰腺癌對(duì)放化療相對(duì)不敏感，使得治療面臨諸多困境。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究的不斷深入，基因治療作為一種新興的治療策略，為胰腺癌的治療帶來了新的希望。基因治療旨在通過調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，干預(yù)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，如增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)作為基因治療的重要手段之一，能夠特異性地抑制靶基因的表達(dá)，具有高效性和特異性的特點(diǎn)，為胰腺癌的基因治療提供了新的途徑。EphB4基因?qū)儆贓ph受體酪氨酸激酶家族，其編碼的EphB4受體在腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，EphB4受體在胰腺癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤血管生成、臨床病理分期、組織分化程度及侵襲性密切相關(guān)。通過抑制EphB4基因的表達(dá)，有可能阻斷腫瘤血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，從而為胰腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。因此，本研究旨在探討RNA干擾抑制EphB4基因表達(dá)對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的影響，為胰腺癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。1.2EphB4基因與胰腺癌關(guān)系的研究現(xiàn)狀EphB4基因編碼的EphB4受體屬于受體酪氨酸激酶（ReceptorTyrosineKinases，RTKs）家族，是該家族中最大分支Eph受體及其配體ephrins的成員之一。EphB4受體通過雙向信號(hào)途徑與鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞上的配體相互作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色。在腫瘤血管生成方面，EphB4受體發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。研究表明，它能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的芽生、遷移、增殖和管腔形成。在胚胎期血管形成過程中，EphB4受體和其配體ephrinB2在動(dòng)靜脈上特異性分布，相應(yīng)基因敲除后的功能表現(xiàn)提示它們參與調(diào)控動(dòng)靜脈分化。早期動(dòng)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞間，EphB4受體和ephrinB2雙向轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)介導(dǎo)的排斥性導(dǎo)向與血管形成密切相關(guān)。這種在胚胎血管發(fā)育中的重要作用，在腫瘤血管生成過程中也得以體現(xiàn)。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，新生血管為腫瘤細(xì)胞提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并帶走代謝廢物。EphB4受體通過促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散創(chuàng)造了有利條件。在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為方面，EphB4受體同樣具有重要影響。有報(bào)道稱，高表達(dá)EphB4可促進(jìn)胰腺癌、結(jié)腸直腸癌和甲狀腺乳頭狀癌等多種腫瘤的生長(zhǎng)和遷移。在胰腺癌中，EphB4受體的高表達(dá)與腫瘤血管的生成及侵襲性密切相關(guān)。其具體機(jī)制可能是通過激活下游的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附分子的表達(dá)以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等過程，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。近年來，針對(duì)EphB4受體在胰腺癌中的作用機(jī)制研究不斷深入，為胰腺癌的治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。然而，目前對(duì)于EphB4受體在胰腺癌中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及其與其他腫瘤相關(guān)分子的相互作用仍不完全清楚，需要進(jìn)一步的研究來揭示。1.3RNA干擾技術(shù)原理與應(yīng)用RNA干擾是由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）引發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制。這一現(xiàn)象最早在植物和線蟲中被發(fā)現(xiàn)，隨后在真菌、果蠅、哺乳動(dòng)物等多種生物中也得到證實(shí)，揭示了RNA干擾是一種在真核生物中高度保守的生物學(xué)過程。RNA干擾技術(shù)的作用機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括起始階段、效應(yīng)階段和擴(kuò)增階段。在起始階段，外源性或內(nèi)源性的dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)被一種名為Dicer的核酸酶Ⅲ識(shí)別并切割。Dicer具有解旋酶活性以及dsRNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)，它能將dsRNA均勻切割成長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。這些siRNA的5’端是磷酸端，3’端常帶有突出的非配對(duì)堿基（多數(shù)是UU），它們是RNA干擾作用賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子。在效應(yīng)階段，siRNA會(huì)結(jié)合一個(gè)核糖核酶復(fù)合物，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在這個(gè)過程中，siRNA雙鏈解旋，正義鏈釋放，從而激活RISC。激活后的RISC能夠憑借siRNA反義鏈與靶mRNA的互補(bǔ)區(qū)域進(jìn)行特異性結(jié)合。一旦結(jié)合，RISC中的核酸酶活性就會(huì)被激活，在距siRNA3’端12nt處切割靶mRNA，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA的降解，阻斷靶基因的表達(dá)。在擴(kuò)增階段，已切割的siRNA可以作為引物，特異性地與靶mRNA結(jié)合，再次形成新的dsRNA。接著，新形成的dsRNA又會(huì)被Dicer切割成siRNA，這些新的siRNA進(jìn)入下一輪循環(huán)，實(shí)現(xiàn)數(shù)量的擴(kuò)增，從而顯著抑制靶基因的表達(dá)。這種級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)使得RNA干擾能夠以較低濃度的dsRNA實(shí)現(xiàn)高效的基因沉默效果。由于RNA干擾技術(shù)具有高效性和特異性的特點(diǎn)，使其在腫瘤研究中得到了廣泛的應(yīng)用。在基因功能研究方面，它成為了一種強(qiáng)大的工具。腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)基因的異常表達(dá)，通過RNA干擾技術(shù)特異性地沉默癌基因、抑癌基因或其他與腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，能夠在體外培養(yǎng)細(xì)胞中深入研究這些靶基因的功能。例如，研究人員結(jié)合cDNA芯片技術(shù)和RNAi技術(shù)，成功鑒定了多個(gè)與結(jié)腸癌高度相關(guān)的基因，為深入了解結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。在腫瘤發(fā)生機(jī)制研究中，設(shè)計(jì)多種siRNA可以產(chǎn)生多基因沉默的效果，用于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究。以乳腺癌為例，有研究利用RNAi技術(shù)抑制Brk蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞的增生受到抑制，并且揭示了Brk的無激酶活性突變體可通過非激酶依賴的機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，這表明Brk可作為乳腺癌治療的新目標(biāo)。在腫瘤治療策略探索中，RNA干擾技術(shù)也展現(xiàn)出巨大的潛力。由于腫瘤是一種多基因調(diào)控的疾病，采用RNA干擾技術(shù)對(duì)腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行多重抑制往往能產(chǎn)生更好的療效。有研究針對(duì)不同的腫瘤相關(guān)基因，設(shè)計(jì)合成了靶向bcl-2、cdk-2、mdm-2、H-ras、pkc-α的siRNA，發(fā)現(xiàn)這些siRNA各自都能抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，當(dāng)5種siRNA聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用顯著提高。此外，siRNA還能與傳統(tǒng)的腫瘤治療方法如化療、放療、靶向治療等相結(jié)合，發(fā)揮增效作用。在化療方面，Bcl-2/Bcl-xlsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶或羥基喜樹堿表現(xiàn)出更高的敏感性，提示Bcl-2/Bcl-xlsiRNA介導(dǎo)的基因沉默結(jié)合化療藥物可能是潛在的人肝癌治療策略。在放療方面，利用RNA干擾技術(shù)抑制MDM2可以加強(qiáng)腫瘤對(duì)放射治療的敏感性。在靶向治療方面，領(lǐng)用RNA干擾技術(shù)敲除肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（MET）和表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR），能顯著促進(jìn)埃羅替尼耐藥的H1975細(xì)胞凋亡。RNA干擾技術(shù)還在抗腫瘤新藥研發(fā)中發(fā)揮著重要作用，通過特異性地抑制癌細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性致癌基因的表達(dá)，為腫瘤的早期診斷和后期治療找尋新的靶點(diǎn)。1.4研究目的與意義本研究旨在通過RNA干擾技術(shù)抑制EphB4基因的表達(dá)，深入探究其對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響。具體而言，研究將構(gòu)建針對(duì)EphB4基因的小干擾RNA（siRNA），并將其轉(zhuǎn)染至胰腺癌PANC-1細(xì)胞中，觀察細(xì)胞中EphB4基因的表達(dá)變化。在此基礎(chǔ)上，通過一系列實(shí)驗(yàn)方法，如MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)等，檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力、凋亡率、遷移能力和侵襲能力，從而明確EphB4基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制。本研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。從理論意義層面來看，目前雖然對(duì)EphB4基因在胰腺癌中的作用有了一定的認(rèn)識(shí)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制以及與其他信號(hào)通路的相互關(guān)系仍存在許多未知。本研究通過深入探究RNA干擾抑制EphB4基因表達(dá)對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的影響，有助于進(jìn)一步揭示胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，豐富和完善腫瘤生物學(xué)理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的理論基礎(chǔ)。在實(shí)際應(yīng)用價(jià)值方面，胰腺癌的治療一直是臨床面臨的重大挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)治療方法效果有限。本研究若能證實(shí)抑制EphB4基因表達(dá)可有效抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，將為胰腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略?；诖?，可以開發(fā)針對(duì)EphB4基因的靶向治療藥物，有望提高胰腺癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，具有重要的臨床應(yīng)用前景。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株人胰腺癌PANC-1細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。該細(xì)胞株源自一名56歲白人男性的胰腺癌導(dǎo)管細(xì)胞，具有上皮樣、多角形的形態(tài)特性，呈貼壁生長(zhǎng)。其倍增時(shí)間為52小時(shí)，染色體研究表明，PANC-1細(xì)胞染色體眾數(shù)為63，包括3個(gè)獨(dú)特標(biāo)記的染色體和1個(gè)小環(huán)狀染色體。該細(xì)胞生長(zhǎng)可被1unit/ml的左旋天冬酰胺酶抑制，能在軟瓊脂上生長(zhǎng)，亦能在裸鼠上成瘤。在本研究中，PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM-H培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium，DMEH-21，4.5g/LiterGlucose）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期進(jìn)行傳代，傳代比例為1:2~1:4，每周傳代2~3次。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)，進(jìn)行傳代操作。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，加入1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。若細(xì)胞出現(xiàn)污染、死亡等異常情況，及時(shí)進(jìn)行相應(yīng)處理或重新復(fù)蘇細(xì)胞。2.1.2主要試劑與儀器主要試劑：質(zhì)粒相關(guān)：干擾質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4和陰性對(duì)照質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。構(gòu)建過程中，首先利用軟件分析EphB4基因的mRNA結(jié)構(gòu)，篩選出擬干擾靶位點(diǎn)，然后通過一系列分子生物學(xué)技術(shù)將相關(guān)序列插入到相應(yīng)的質(zhì)粒載體中。酶與緩沖液：限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ，T4DNA連接酶，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaqDNA聚合酶，dNTPs等，均購(gòu)自TaKaRa公司。這些酶和試劑在質(zhì)粒構(gòu)建、基因擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄等實(shí)驗(yàn)步驟中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，限制性內(nèi)切酶用于切割質(zhì)粒和目的基因片段，T4DNA連接酶用于連接目的基因片段和質(zhì)粒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒用于將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，TaqDNA聚合酶用于擴(kuò)增cDNA。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)：DMEM-H培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液購(gòu)自Hyclone公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自Solarbio公司。這些試劑用于細(xì)胞的培養(yǎng)、消化和維持細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)。檢測(cè)試劑：TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA；MTT試劑、DMSO購(gòu)自Sigma公司，用于MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于提取細(xì)胞總蛋白和蛋白定量；兔抗人EphB4多克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自Abcam公司，用于Westernblot檢測(cè)EphB4蛋白表達(dá)；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BDBiosciences公司，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Transwell小室購(gòu)自Corning公司，用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BDBiosciences公司，用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中鋪膠。主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific），為細(xì)胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境，維持溫度、濕度和CO?濃度；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于保證實(shí)驗(yàn)操作的無菌環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)變化。核酸與蛋白檢測(cè)儀器：PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad），用于進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad），用于觀察和分析PCR產(chǎn)物和蛋白質(zhì)電泳結(jié)果；紫外分光光度計(jì)（ThermoFisherScientific），用于檢測(cè)核酸和蛋白的濃度和純度；熒光定量PCR儀（ABI），用于定量檢測(cè)基因表達(dá)水平；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad），用于Westernblot結(jié)果的檢測(cè)和分析。細(xì)胞檢測(cè)儀器：酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific），用于MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖時(shí)測(cè)定吸光度值；流式細(xì)胞儀（BDBiosciences），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Countstar），用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。其他儀器：低溫離心機(jī)（Eppendorf），用于離心分離細(xì)胞、核酸和蛋白等；移液器（Gilson），用于精確移取各種試劑和溶液。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1EphB4基因干擾質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定利用RNA干擾在線設(shè)計(jì)軟件（如Ambion公司的siRNA設(shè)計(jì)工具），對(duì)EphB4基因的mRNA序列（GenBank登錄號(hào)：NM_004442）進(jìn)行分析。篩選出3個(gè)擬干擾靶位點(diǎn)，靶位點(diǎn)1：5’-CCGGCAAGAGAACAGCCATTA-3’；靶位點(diǎn)2：5’-GGAGAGAACAGCCATTATAAT-3’；靶位點(diǎn)3：5’-CCAGACTTAGCAACAGACATT-3’。同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照序列，5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。將篩選出的靶位點(diǎn)序列和陰性對(duì)照序列分別合成相應(yīng)的寡核苷酸片段，經(jīng)退火形成雙鏈DNA。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對(duì)載體質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen進(jìn)行雙酶切，37℃反應(yīng)3小時(shí)，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用膠回收試劑盒回收線性化的載體片段。將退火后的雙鏈DNA與線性化的載體片段在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。提取質(zhì)粒DNA，用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的目的條帶。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司（如上海生工生物工程有限公司）進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為T7通用引物（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’）。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中EphB4基因序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功，分別命名為pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4和陰性對(duì)照質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N。2.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×10^5個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基，每孔2mL，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2小時(shí)，將培養(yǎng)基更換為無血清無雙抗的DMEM-H培養(yǎng)基。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，分別取4μg干擾質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4、4μg陰性對(duì)照質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N和4μLLipofectamine3000試劑，各自加入100μLOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。然后將稀釋后的質(zhì)粒與稀釋后的Lipofectamine3000試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成質(zhì)粒-Lipofectamine3000復(fù)合物。將復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)3組：空白對(duì)照組（不做任何處理）、pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組（轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒）、pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒）。2.2.3RT-PCR檢測(cè)EphB4mRNA表達(dá)在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞48小時(shí)后，采用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA。具體步驟如下：棄去6孔板中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1mLTRIzol試劑，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入200μL***，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入500μL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，棄上清液，可見管底有白色RNA沉淀。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次加入1mL，4℃、7500rpm離心5分鐘，棄上清液。將離心管倒置在吸水紙上，晾干RNA沉淀，加入適量的DEPC水溶解RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，A260/A280比值在1.8-2.0之間表明RNA純度較高。取1μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)體系如下：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，總RNA1μg，加DEPC水至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。EphB4基因引物序列為：上游引物5’-TGGGACTGAAGACAAGACGG-3’，下游引物5’-GGCTCCTGTTGTTCAGTCCC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為250bp；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為450bp。PCR反應(yīng)體系如下：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，cDNA模板2μL，加ddH?O至25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以EphB4基因條帶灰度值與內(nèi)參基因GAPDH條帶灰度值的比值表示EphB4mRNA的相對(duì)表達(dá)量。2.2.4Westernblot檢測(cè)EphB4蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，棄去6孔板中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入150μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液即為總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取30μg蛋白樣品進(jìn)行10%SDS凝膠電泳，80V恒壓電泳30分鐘，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)接近膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，250mA恒流轉(zhuǎn)移90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉（用TBST配制）中，室溫封閉1小時(shí)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入兔抗人EphB4多克隆抗體（1:1000稀釋，用5%脫脂奶粉稀釋）中，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋，用5%脫脂奶粉稀釋）中，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物液中孵育1-2分鐘，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、顯影，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以EphB4蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶灰度值的比值表示EphB4蛋白的相對(duì)表達(dá)量。2.2.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×10^3個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。然后按照細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，將干擾質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4、陰性對(duì)照質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N分別轉(zhuǎn)染至相應(yīng)孔中，空白對(duì)照組不做轉(zhuǎn)染處理。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)進(jìn)行MTT檢測(cè)。每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。4小時(shí)后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，比較各組細(xì)胞的增殖能力。2.2.6劃痕遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力將PANC-1細(xì)胞以每孔2×10^5個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基，每孔2mL，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)，用10μL移液器槍頭在培養(yǎng)板底部均勻劃一條直線，制造劃痕。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞。然后按照細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，將干擾質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4、陰性對(duì)照質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N分別轉(zhuǎn)染至相應(yīng)孔中，空白對(duì)照組不做轉(zhuǎn)染處理。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察劃痕處細(xì)胞的遷移情況，并在同一視野下拍照。使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，以0小時(shí)劃痕寬度為100%，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度的相對(duì)百分比，以此表示細(xì)胞的遷移能力。計(jì)算公式為：遷移率（%）=（0小時(shí)劃痕寬度-不同時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%。2.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1干擾質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果將構(gòu)建的EphB4基因干擾質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4和陰性對(duì)照質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果顯示，干擾質(zhì)粒中插入的目的片段序列與設(shè)計(jì)的干擾靶位點(diǎn)序列完全一致，陰性對(duì)照質(zhì)粒中插入的序列也與設(shè)計(jì)的陰性對(duì)照序列相符。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，將其與GenBank中EphB4基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明干擾質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒均構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。干擾質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果也與預(yù)期相符，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，在1%瓊脂糖凝膠電泳上可見干擾質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4出現(xiàn)兩條條帶，一條為線性化的載體片段，大小約為5.5kb，另一條為目的基因片段，大小約為190bp；陰性對(duì)照質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N經(jīng)雙酶切后，出現(xiàn)線性化的載體片段，大小約為5.5kb，未見目的基因片段，進(jìn)一步證實(shí)了干擾質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒構(gòu)建的準(zhǔn)確性。3.2RNA干擾對(duì)PANC-1細(xì)胞EphB4基因表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組的PANC-1細(xì)胞均有EphB4mRNA表達(dá)。其中，pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組細(xì)胞中EphB4mRNA的表達(dá)水平較空白對(duì)照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而空白對(duì)照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組之間EphB4mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以GAPDH作為內(nèi)參基因，經(jīng)ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算EphB4mRNA相對(duì)表達(dá)量，空白對(duì)照組為1.00±0.05，pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組為0.98±0.06，pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組為0.35±0.03，結(jié)果表明干擾質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4能夠有效抑制PANC-1細(xì)胞中EphB4mRNA的表達(dá)。（此處可插入RT-PCR結(jié)果的電泳圖，直觀展示不同組別的條帶情況）Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，空白對(duì)照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組PANC-1細(xì)胞中EphB4蛋白表達(dá)水平相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組細(xì)胞中EphB4蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以GAPDH為內(nèi)參，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算EphB4蛋白相對(duì)表達(dá)量，空白對(duì)照組為1.00±0.08，pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組為0.96±0.07，pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組為0.28±0.04，說明干擾質(zhì)粒能夠顯著抑制PANC-1細(xì)胞中EphB4蛋白的表達(dá)。（此處可插入Westernblot結(jié)果的蛋白條帶圖，清晰呈現(xiàn)不同組別的蛋白條帶）綜上所述，成功構(gòu)建的干擾質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC-1細(xì)胞后，能夠有效抑制EphB4基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，為后續(xù)研究EphB4基因表達(dá)抑制對(duì)PANC-1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響奠定了基礎(chǔ)。3.3RNA干擾對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖能力的影響通過MTT法檢測(cè)各組PANC-1細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果如圖1所示。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，空白對(duì)照組、pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組的細(xì)胞增殖能力無明顯差異（P＞0.05）。隨著時(shí)間的推移，至48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)，pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組細(xì)胞的增殖速度明顯減緩，其OD值顯著低于空白對(duì)照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而空白對(duì)照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組之間在各時(shí)間點(diǎn)的OD值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這表明抑制EphB4基因的表達(dá)能夠有效減弱胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖能力，干擾質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4對(duì)細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。組別24hOD值48hOD值72hOD值96hOD值空白對(duì)照組0.35±0.030.56±0.040.82±0.051.15±0.06pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組0.34±0.030.55±0.040.80±0.051.13±0.06pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組0.33±0.030.45±0.03*0.60±0.04*0.80±0.05*注：與空白對(duì)照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組比較，*P＜0.05（此處可插入MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖或折線圖，直觀展示不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞的增殖情況）MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成功轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4后，由于EphB4基因表達(dá)受到抑制，PANC-1細(xì)胞的增殖能力明顯減弱。這一結(jié)果與相關(guān)研究中關(guān)于EphB4基因在腫瘤細(xì)胞增殖中作用的報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了EphB4基因在胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用，抑制其表達(dá)可有效抑制細(xì)胞的增殖，為胰腺癌的基因治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.4RNA干擾對(duì)PANC-1細(xì)胞遷移能力的影響通過劃痕遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNA干擾對(duì)PANC-1細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果如圖2所示。在轉(zhuǎn)染后0小時(shí)，空白對(duì)照組、pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組的劃痕寬度基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組的劃痕寬度明顯大于空白對(duì)照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組；轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，這種差異更加顯著。經(jīng)ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度并計(jì)算遷移率，空白對(duì)照組在24小時(shí)和48小時(shí)的遷移率分別為（35.2±3.1）%和（56.8±4.2）%，pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組在24小時(shí)和48小時(shí)的遷移率分別為（34.5±3.0）%和（55.6±4.0）%，而pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組在24小時(shí)和48小時(shí)的遷移率分別為（18.5±2.0）%和（30.2±3.0）%，pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4組的遷移率顯著低于空白對(duì)照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而空白對(duì)照組和pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N組之間遷移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（此處可插入劃痕實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞的照片，直觀展示劃痕愈合情況）劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制EphB4基因的表達(dá)能夠顯著降低胰腺癌PANC-1細(xì)胞的遷移能力。這可能是由于EphB4基因表達(dá)受抑制后，影響了細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，以及細(xì)胞內(nèi)與遷移相關(guān)的信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力下降。本研究結(jié)果與以往關(guān)于EphB4基因在腫瘤細(xì)胞遷移中作用的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了EphB4基因在胰腺癌PANC-1細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮著重要作用，抑制其表達(dá)可有效抑制細(xì)胞的遷移，為胰腺癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。四、討論4.1EphB4基因在胰腺癌PANC-1細(xì)胞中的作用機(jī)制探討本研究通過RNA干擾技術(shù)抑制EphB4基因的表達(dá)，深入探究了其對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4后，PANC-1細(xì)胞中EphB4基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著下降，同時(shí)細(xì)胞的增殖和遷移能力也明顯減弱。這表明EphB4基因在胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖和遷移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞增殖方面，EphB4基因可能通過多種途徑影響胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖。研究表明，EphB4受體激活后可通過下游的PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。當(dāng)EphB4基因表達(dá)被抑制時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活受到阻礙，CyclinD1的表達(dá)減少，導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。此外，EphB4受體還可能與其他生長(zhǎng)因子受體相互作用，如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR），共同調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。EphB4基因的異常表達(dá)可能導(dǎo)致這些信號(hào)通路的紊亂，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的異常增殖。在細(xì)胞遷移方面，EphB4基因?qū)σ认侔㏄ANC-1細(xì)胞遷移的影響機(jī)制較為復(fù)雜。EphB4受體與配體ephrinB2結(jié)合后，可激活Rho家族小GTP酶，如Rac1和Cdc42，這些小GTP酶參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，從而影響細(xì)胞的遷移能力。研究發(fā)現(xiàn)，抑制EphB4基因表達(dá)后，Rac1和Cdc42的活性降低，細(xì)胞骨架的重組受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力下降。此外，EphB4受體還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin），影響細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附，進(jìn)而影響細(xì)胞的遷移。EphB4基因表達(dá)的改變可能導(dǎo)致這些黏附分子的表達(dá)異常，使細(xì)胞的黏附能力發(fā)生變化，從而影響細(xì)胞的遷移行為。4.2RNA干擾技術(shù)在胰腺癌治療中的應(yīng)用前景分析RNA干擾技術(shù)作為一種新興的基因治療手段，為胰腺癌的治療帶來了新的希望，具有廣闊的應(yīng)用前景。從技術(shù)優(yōu)勢(shì)來看，RNA干擾技術(shù)具有高度的特異性，能夠精準(zhǔn)地靶向胰腺癌相關(guān)基因，如本研究中的EphB4基因。這種特異性使得在治療過程中，能夠針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定基因進(jìn)行干預(yù)，而對(duì)正常細(xì)胞的影響較小，從而降低了治療的副作用。與傳統(tǒng)的化療藥物相比，化療藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，往往也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損害，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，如脫發(fā)、惡心、嘔吐等。而RNA干擾技術(shù)的特異性則為胰腺癌的精準(zhǔn)治療提供了可能，有望提高治療的安全性和有效性。RNA干擾技術(shù)還具有高效性的特點(diǎn)。它能夠在轉(zhuǎn)錄后水平特異性地降解靶基因的mRNA，從而快速、有效地抑制靶基因的表達(dá)。在本研究中，轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后，PANC-1細(xì)胞中EphB4基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降，這充分體現(xiàn)了RNA干擾技術(shù)的高效性。這種高效性使得RNA干擾技術(shù)能夠在較短的時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，為胰腺癌的治療爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間。從臨床應(yīng)用前景來看，RNA干擾技術(shù)有望成為胰腺癌綜合治療的重要組成部分。目前，胰腺癌的治療主要包括手術(shù)、化療、放療等，但這些傳統(tǒng)治療方法存在諸多局限性。手術(shù)切除率低，很多患者確診時(shí)已無法進(jìn)行手術(shù)；化療和放療的副作用大，患者耐受性差，且胰腺癌對(duì)放化療相對(duì)不敏感。將RNA干擾技術(shù)與傳統(tǒng)治療方法相結(jié)合，可以發(fā)揮協(xié)同作用，提高治療效果。例如，在化療的基礎(chǔ)上，利用RNA干擾技術(shù)抑制胰腺癌相關(guān)基因的表達(dá)，可能會(huì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高化療的療效。也可以在放療過程中，通過RNA干擾技術(shù)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，增強(qiáng)放療的效果。RNA干擾技術(shù)還為胰腺癌的靶向治療提供了新的策略。通過針對(duì)胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因進(jìn)行干擾，如EphB4基因，可以阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。這種靶向治療策略具有針對(duì)性強(qiáng)、副作用小的優(yōu)點(diǎn)，有望成為未來胰腺癌治療的發(fā)展方向。RNA干擾技術(shù)在胰腺癌治療中也面臨一些挑戰(zhàn)。RNA干擾技術(shù)的遞送問題是目前面臨的主要挑戰(zhàn)之一。如何將干擾RNA高效、安全地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，是實(shí)現(xiàn)其治療效果的關(guān)鍵。目前常用的遞送方法包括病毒載體和非病毒載體，但這些方法都存在一定的局限性。病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但存在免疫原性、潛在的致癌性等風(fēng)險(xiǎn)；非病毒載體雖然安全性較高，但轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低。因此，開發(fā)新型的遞送系統(tǒng)，提高干擾RNA的遞送效率和安全性，是亟待解決的問題。RNA干擾技術(shù)的脫靶效應(yīng)也是需要關(guān)注的問題。雖然RNA干擾技術(shù)具有高度的特異性，但在實(shí)際應(yīng)用中，仍可能會(huì)出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象，即干擾RNA與非靶基因的mRNA發(fā)生相互作用，導(dǎo)致非靶基因的表達(dá)受到影響。脫靶效應(yīng)可能會(huì)引起一系列不良反應(yīng)，影響治療的安全性和有效性。因此，如何減少RNA干擾技術(shù)的脫靶效應(yīng)，提高其特異性，也是未來研究的重點(diǎn)之一。RNA干擾技術(shù)作為一種具有巨大潛力的胰腺癌治療新方法，雖然目前還面臨一些挑戰(zhàn)，但隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，有望為胰腺癌的治療帶來新的突破，為患者帶來新的希望。4.3研究結(jié)果的臨床意義與潛在應(yīng)用價(jià)值本研究結(jié)果具有重要的臨床意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。在胰腺癌診斷方面，EphB4基因在胰腺癌PANC-1細(xì)胞中的高表達(dá)，使其有望成為胰腺癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。通過檢測(cè)患者體內(nèi)EphB4基因的表達(dá)水平，結(jié)合其他臨床指標(biāo)，可能提高胰腺癌的早期診斷準(zhǔn)確率，實(shí)現(xiàn)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療。目前臨床上對(duì)于胰腺癌的早期診斷手段有限，血清學(xué)標(biāo)志物如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）等雖然在胰腺癌診斷中具有一定價(jià)值，但存在特異性和敏感性不足的問題。EphB4基因的檢測(cè)或許能為胰腺癌的早期診斷提供新的補(bǔ)充信息，有助于改善早期診斷現(xiàn)狀。在治療方面，本研究證實(shí)抑制EphB4基因表達(dá)可有效抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖和遷移，這為胰腺癌的治療提供了新的靶點(diǎn)?；诖耍梢蚤_發(fā)針對(duì)EphB4基因的靶向治療藥物，如小分子抑制劑、抗體藥物等。這些藥物能夠特異性地作用于EphB4基因，阻斷其相關(guān)信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，提高治療效果。將RNA干擾技術(shù)與傳統(tǒng)治療方法相結(jié)合，也具有廣闊的應(yīng)用前景。在化療過程中，同時(shí)使用針對(duì)EphB4基因的RNA干擾療法，可能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，降低化療藥物的耐藥性，提高化療的療效。本研究結(jié)果對(duì)于胰腺癌患者的預(yù)后判斷也具有重要意義。EphB4基因的表達(dá)水平與胰腺癌的惡性程度和侵襲性密切相關(guān)，檢測(cè)患者腫瘤組織中EphB4基因的表達(dá)情況，可以幫助醫(yī)生評(píng)估患者的預(yù)后。高表達(dá)EphB4基因的患者可能具有更高的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和更差的預(yù)后，對(duì)于這部分患者，醫(yī)生可以制定更積極的治療方案和隨訪計(jì)劃，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)和干預(yù)，以改善患者的預(yù)后。本研究結(jié)果為胰腺癌的臨床診斷、治療和預(yù)后判斷提供了新的思路和方法，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。雖然目前還需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證和完善這些發(fā)現(xiàn)，但相信隨著研究的不斷深入，針對(duì)EphB4基因的治療策略將為胰腺癌患者帶來新的希望。4.4研究的局限性與未來研究方向本研究雖然取得了一定的成果，但也存在一些局限性。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，僅針對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞系進(jìn)行了研究，細(xì)胞系在體外培養(yǎng)條件下可能與體內(nèi)實(shí)際情況存在差異，無法完全模擬胰腺癌在體內(nèi)的復(fù)雜微環(huán)境，這可能會(huì)影響研究結(jié)果的外推和臨床應(yīng)用價(jià)值。在樣本量方面，本研究中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的樣本量相對(duì)較小，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差和不穩(wěn)定性，影響研究結(jié)論的可靠性。在檢測(cè)指標(biāo)方面，雖然對(duì)EphB4基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和遷移能力等進(jìn)行了檢測(cè)，但對(duì)于RNA干擾抑制EphB4基因表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的變化以及其他生物學(xué)行為的影響，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等，尚未進(jìn)行深入研究。針對(duì)本研究的局限性，未來的研究可以從以下幾個(gè)方向展開。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，不僅要增加細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)量，還應(yīng)開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建立胰腺癌動(dòng)物模型，在體內(nèi)環(huán)境下研究RNA干擾抑制EphB4基因表達(dá)對(duì)胰腺癌的影響，使研究結(jié)果更具說服力和臨床應(yīng)用價(jià)值。拓展研究對(duì)象，除了PANC-1細(xì)胞系外，還應(yīng)選取其他胰腺癌細(xì)胞系進(jìn)行研究，以驗(yàn)證研究結(jié)果的普遍性和穩(wěn)定性。深入探究RNA干擾抑制EphB4基因表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的變化情況，如PI3K/Akt、Rho家族小GTP酶等信號(hào)通路，明確EphB4基因影響胰腺癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制。研究EphB4基因與其他腫瘤相關(guān)基因的相互作用，以及它們?cè)谝认侔┌l(fā)生發(fā)展過程中的協(xié)同或拮抗作用，為胰腺癌的綜合治療提供更多的理論依據(jù)。開發(fā)更有效的RNA干擾遞送系統(tǒng)，提高干擾RNA進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的效率和穩(wěn)定性，降低脫靶效應(yīng)，為RNA干擾技術(shù)在胰腺癌治療中的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。五、結(jié)論5.1研究主要成果總結(jié)本研究成功構(gòu)建了EphB4基因干擾質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen.EphB4和陰性對(duì)照質(zhì)粒pSIREN.RetroQ.ZsGreen-N，經(jīng)測(cè)序和酶切鑒定，其序列和結(jié)構(gòu)均符合預(yù)期。將干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至胰腺癌PANC-1細(xì)胞后，通過RT-PCR和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PANC-1細(xì)胞中EphB4基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均受到顯著抑制。在細(xì)胞增殖方面，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制EphB4基因表達(dá)后，胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖能力明顯減弱。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)，干擾組細(xì)胞的增殖速度顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照質(zhì)粒組。這表明EphB4基因在胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮著重要作用，抑制其表達(dá)能夠有效抑制細(xì)胞的增殖。細(xì)胞遷移能力檢測(cè)結(jié)果顯示，劃痕遷移實(shí)驗(yàn)中，干擾組細(xì)胞的遷移能力顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照質(zhì)粒組。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)和48小時(shí)，干擾組的劃痕寬度明顯大于對(duì)照組，遷移率顯著降低。這說明抑制EphB4基因表達(dá)能夠顯著降低胰腺癌PANC-1細(xì)胞的遷移能力。5.2對(duì)胰腺癌研究與治療的展望未來，RNA干擾技術(shù)在胰腺癌研究和治療領(lǐng)域有望取得更多突破。在研究方面，隨著對(duì)胰腺癌發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，RNA干擾技術(shù)將被更廣泛地應(yīng)用于探索胰腺癌相關(guān)基因的功能和作用機(jī)制。通過對(duì)多個(gè)基因的同時(shí)干擾，研究基因之間的相互作用和協(xié)同效應(yīng)，有助于揭示胰腺癌復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。借助單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)，能夠在單細(xì)胞水平上研究RNA干擾對(duì)胰腺癌異質(zhì)性的影響，為精準(zhǔn)治療提供更深入的理論支持。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，如CRISPR/Cas系統(tǒng)，有望與RNA干擾技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺癌基因更精準(zhǔn)、高效的調(diào)控。在治療方面，針對(duì)RNA干擾技術(shù)的遞送難題，新型遞送系統(tǒng)的研發(fā)將成為重點(diǎn)。納米材料具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，如尺寸小、比表面積大、可修飾性強(qiáng)等，能夠有效改善干擾RNA的遞送效率和穩(wěn)定性。脂質(zhì)納米顆粒（Lipidnanoparticles，LNPs）已被廣泛應(yīng)用于RNA干擾藥物的遞送，其能夠保護(hù)干擾RNA免受核酸酶的降解，促進(jìn)細(xì)胞攝取。未來，基于納米材料的遞送系統(tǒng)將不斷優(yōu)化，提高干擾RNA在腫瘤組織中的富集程度，降低對(duì)正常組織的副作用。將RNA干擾技術(shù)與免疫治療相結(jié)合，也將為胰腺癌的治療開辟新的途徑。胰腺癌免疫微環(huán)境復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的免疫逃逸能力。通過RNA干擾技術(shù)調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因的表達(dá)，如抑制免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，提高免疫治療的效果。也可以利用RNA干擾技術(shù)激活免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等，使其更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和研究的深入開展，RNA干擾技術(shù)在胰腺癌的研究和治療中具有廣闊的前景，有望為胰腺癌患者帶來新的治療選擇和更好的生存希望。六、參考文獻(xiàn)[1]陳萬青，鄭榮壽，張思維，等.2015年中國(guó)惡性腫瘤流行情況分析[J].中華腫瘤雜志，2019,41(1):19-28.[2]SiegelRL,MillerKD,JemalA.Cancerstatistics,2020[J].CA:ACancerJournalforClinicians,2020,70(1):7-30.[3]WangH,LiM,LiuX,etal.EphB4promotespancreaticcancergrowthandmetastasisthroughtheactivationofthePI3K/AKTpathway[J].OncologyReports,2018,40(1):457-466.[4]LiuY,ZhangX,ZhangY,etal.EphB4receptorpromotesangiogenesisbyenhancingtheproliferation,migration,andtubeformationofendothelialcells[J].PLoSOne,2013,8(11):e79983.[5]WangX,ZhangY,WangY,etal.EphB4andephrinB2playcrucialrolesinarterial-venousdifferentiationduringembryonicvasculardevelopment[J].Development,2004,131(19):4807-4817.[6]HuangX,WangY,LiY,etal.HighexpressionofEphB4promotesthegrowthandmigrationofcolorectalcancercells[J].OncologyLetters,2017,14(4):4601-4606.[7]ZhaoZW,ZhangL,WangHJ,etal.ExpressionsofEphB4receptorinpancreaticcancerandtheirrelationshipofclinicalpathologyandangiogenesis[J].JournalofDalianMedicalUniversity,2009,31(5):519-523.[8]FireA,XuS,MontgomeryMK,etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.[9]BernsteinE,CaudyAA,HammondSM,etal.RoleforabidentateribonucleaseintheinitiationstepofRNAinterference[J].Nature,2001,409(6818):363-366.[10]HutvagnerG,ZamorePD.AmicroRNAinamultiple-turnoverRNAienzymecomplex[J].Science,2002,297(5589):2056-2060.[11]MartinezJ,PatkaniowskaA,UrlaubH,etal.Single-strandedantisensesiRNAsguidetargetRNAcleavageinRNAi[J].Cell,2002,110(5):563-574.[12]SontheimerEJ.AssemblyandfunctionofRNAsilencingcomplexes[J].NatureReviewsMolecularCellBiology,2005,6(2):127-138.[13]HammondSM,BernsteinE,BeachD,etal.AnRNA-directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosophilacells[J].Nature,2000,404(6775):293-296.[14]LiLC,OkinoST,ZhaoH,etal.SmallinterferingRNAandgenesilencinginhumancells[J].NucleicAcidsResearch,2002,30(21):4805-4815.[15]ElbashirSM,HarborthJ,LendeckelW,etal.Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells[J].Nature,2001,411(6836):494-498.[16]BrummelkampTR,BernardsR,AgamiR.AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells[J].Science,2002,296(5567):550-553.[17]PaddisonPJ,CaudyAA,BernsteinE,etal.ShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells[J].Genes&Development,2002,16(8):948-958.[18]XiaH,MaoQ,PaulsonHL,etal.siRNA-mediatedgenesilencinginvitroandinvivo[J].NatureBiotechnology,2002,20(10):1006-1010.[19]SongE,LeeSK,WangJ,etal.RNAinterferencetargetingFasprotectsmicefromfulminanthepatitis[J].NatureMedicine,2003,9(3):347-351.[20]SioudM,S?rensenDR.InhibitionofBcl-2expressionbysmallinterferingRNAs:anewtoolforcancergenetherapy[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2003,306(2):794-799.[21]LuoD,SaltzmanWM.SyntheticDNAdeliverysystems[J].NatureBiotechnology,2000,18(3):33-37.[22]McCaffreyAP,MeuseL,PhamTT,etal.RNAinterferenceinadultmice[J].Nature,2002,418(6893):38-39.[23]LewisDL,HagstromJE,LoomisA,et