幾種不同類型顯微鏡的使用及其對(duì)胞質(zhì)環(huán)流的觀察VIP

幾種不同類型顯微鏡的使用及其對(duì)胞質(zhì)環(huán)流的觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)會(huì)使用相差顯微鏡，掌握暗視野技術(shù)，以及熒光顯微鏡等技術(shù)

二、實(shí)驗(yàn)原理

在活細(xì)胞中，原生質(zhì)流動(dòng)是細(xì)胞活力強(qiáng)弱的重要標(biāo)志，它的產(chǎn)生與

細(xì)胞中微絲的作用是密不可分的。微絲的纖維較細(xì)，直徑為5—6nm,

主要成分是肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白，并像肌肉一樣有收縮

功能。微管是由一種叫做微管蛋白的蛋白質(zhì)組成的，位于原生質(zhì)（靜止

的）外質(zhì)，緊靠在質(zhì)膜之下，離運(yùn)動(dòng)的內(nèi)質(zhì)至少有Wm的距離，與胞質(zhì)

川流運(yùn)動(dòng)無(wú)關(guān)，主要起保持細(xì)胞形狀、承擔(dān)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸

的作用。

另外，用秋水仙素與細(xì)胞松弛素B處理也可產(chǎn)生不同的結(jié)果。經(jīng)

秋水仙素處理后，細(xì)胞的纖維被擾亂，但不影響川流運(yùn)動(dòng)，這是與秋水

仙素影響邊緣微管作用有關(guān)。相反，用細(xì)胞松弛素B處理，就可抑制細(xì)

胞的川流運(yùn)動(dòng)，很明顯，微絲擔(dān)負(fù)著川流運(yùn)動(dòng)的功能。胞質(zhì)環(huán)流需要消

耗能量，也受溫度、滲透壓以及離子濃度的影響。

三、實(shí)驗(yàn)材料

新鮮洋蔥鱗莖，剛毛藻等。

四、實(shí)驗(yàn)器材

相差顯微鏡，普通光學(xué)顯微鏡，黑卜紙，載玻璃片，蓋玻片，鍛了，吸水

紙，剪刀，滴管，擦鏡紙。

五、實(shí)驗(yàn)藥品

100%/ml秋水仙素溶液，20Ng/ml細(xì)胞松弛素B（cytochalasinB）,蒸儲(chǔ)水,

香玻油，二甲苯。

六、實(shí)驗(yàn)步驟

1.取新鮮洋蔥鱗莖內(nèi)表皮約len?或更小，放在干凈的載玻片上，

加一小滴水，將蓋玻片傾斜蓋上，井注意不出現(xiàn)氣泡，即制成水封片。

2.取一塊黑紙，把它剪成暗視野顯微鏡用的遮光板，并放入普通

光學(xué)顯微鏡的聚光器下的光闌上，制成暗視野顯微鏡。（須反復(fù)調(diào)整遮

光板的尺寸以得到最佳效果）。

3.把制成的水封片放在暗視野顯微鏡下用10倍物鏡觀察，可以

看到在明亮的細(xì)胞壁與半透明的細(xì)胞核之間有很多極小而明亮的“質(zhì)

點(diǎn)”或顆粒，仔細(xì)觀察，可以看出這些正作有向的運(yùn)動(dòng)（速度很慢），

水封片中多加些水會(huì)促進(jìn)這種運(yùn)動(dòng)。

4.學(xué)習(xí)相差顯微鏡，熒光顯微鏡和倒置顯微鏡的使用方法和有

關(guān)操作技術(shù)。

植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握細(xì)胞染色的基本過(guò)程及非切片法制片技術(shù)，了解細(xì)胞骨架的

結(jié)構(gòu)，學(xué)會(huì)制作永久封片。

二、實(shí)驗(yàn)原理

當(dāng)用適當(dāng)濃度的TritonX-100處理細(xì)胞時(shí)，因其非離子型表面活

性劑的特性，可以除去可溶性蛋白質(zhì)和脂類，而微絲束屬不可溶性蛋

白，就不會(huì)被TritonX-100破壞而保留在細(xì)胞中。當(dāng)用考馬斯亮藍(lán)

R250染色時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下通常能觀察到以核為中心的纖維狀骨

架，在質(zhì)膜下還能見(jiàn)到絲狀骨架，骨架上常附著一些與膜運(yùn)動(dòng)、整合有

關(guān)的蛋白質(zhì)。

考馬斯亮藍(lán)R250并不是特異地顯示微絲，但由于有些細(xì)胞骨

架纖維如微管等在該實(shí)驗(yàn)條件下不夠穩(wěn)定，又因有些類型的纖維太細(xì)

而在光學(xué)顯微鏡下無(wú)法分辨，因此看到的是由微絲組成的纖維束，直徑

約在40nm左右。

三、實(shí)驗(yàn)材料

新鮮洋蔥鱗狀葉。

四、實(shí)驗(yàn)器材

普通光學(xué)顯微鏡，5()ml燒杯，滴管，試劑瓶，載玻片，蓋玻片，鐐子,

染色板，吸水紙，擦鏡紙。

五、實(shí)驗(yàn)藥品

I.M—緩沖液：所含各成分終濃度為50mmol/L瞇P坐，50mmol/L

KCL,0.5mmol/LMgCh,Immol/LEGTA(乙二醉雙(a一氨基乙基》醒

四乙酸)，0.1mmol/LEDTA,Immol/L銃基乙醇或二硫蘇糖醇

<DTT)oImol/LHC1調(diào)pH到6.8

2O.Olmol/L磷酸緩沖液(pH6.8)

用0.2mol/L磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉緩沖液稀釋配制

其中磷酸鹽緩沖液配法：0.2mol/LNa2HPO449ml

().2mol/LNaH2PCh51ml

3.1%TrlionX—100,HJM—緩沖液配制。

4.0.2%考馬斯亮藍(lán)R250。配制用的溶劑為：甲醇：冰醋酸:水

（46.5：7：46.5）o,

5.3%戊二醛溶液，用9.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）配制

6.50%,70%,95%乙醇。

7.叔丁醇

8.正丁醇

9.二甲苯。

10.中性樹(shù)膠。

六、實(shí)驗(yàn)步驟

I.撕取洋蔥鱗狀葉內(nèi)表皮約1cm大小，取若干片，置于裝有pH

6.8磷酸鹽緩沖液的50ml燒杯中，用鎰子輕按入使其浸沒(méi)5mino

2.吸去磷酸鹽緩沖液，用l%TritonX—100處理20—30min。

3.吸去TrironX—i00液，用M-緩沖液洗3次，每次lOmin左右。

4.用3%戊二醛固定0.5h。

5.再用磷酸鹽緩沖液洗3次，每次l（）min。

6.0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色20—30min（在染色板上）。

7.用蒸儲(chǔ)水洗1一2次，將樣品置于載玻片上，在普通光學(xué)顯微鏡

下觀察，先低倍，再高倍，最后用油鏡。

8.如觀察結(jié)具較佳，可制作永久封片：在有樣品的50ml燒杯中，

依次用如下試劑處理：5（）%乙醇，70%乙醇，95%乙醇，（1/2）V95%乙醇

十（1/2）V叔丁醇，叔丁醇（以上每個(gè)步驟反應(yīng)5—lOmin）或正丁醇，正丁

醇，二甲苯，二甲苯（每個(gè)步驟5—10min）。然后，將樣品置于載玻片上

展開(kāi)，鏡檢后滴一滴中性樹(shù)脂，蓋上蓋玻片。

葉綠體的分離與熒光觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握手工制作密度梯度技術(shù)，了解蔗糖密度梯度離心的原理及優(yōu)

缺點(diǎn)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

用兩種濃度的蔗糖溶液制成的梯度，在離心條件下，葉綠體和比它

沉降系數(shù)小的細(xì)胞組分聚集到梯度交界處，而沉降系數(shù)較大的細(xì)胞組

分沉到離心管底部，這樣，可粗略地分離葉綠體。

三、實(shí)驗(yàn)材料

新鮮菠菜葉

四、實(shí)驗(yàn)器材

組織搗碎器，高速冷凍離心機(jī)，普通離心機(jī)，離心管，Corex離心

管，燒杯，漏斗，紗布，載玻片，蓋玻片，普通光學(xué)顯微鏡，剪刀，滴

管，熒光顯微鏡。

五、實(shí)驗(yàn)藥品

勻漿介質(zhì)（0.25mol/L蔗糖、0.05mol/LTris-HCi緩沖液，

pH7.4）：稱取85.55g蔗糖,6.05gTris,溶解在近800ml蒸儲(chǔ)水中,加

入約42.5ml0.1mol/LHCL最后蒸儲(chǔ)水定容至1000ml。

50%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液。0.35M氯化鈉,（）.01%口丫噬橙

六、實(shí)驗(yàn)步驟（一）葉綠體的密度離心

1.洗凈菠菜葉，盡可能使它干燥，去除葉柄、主脈后，稱取5g,剪

碎。

2.加入預(yù)冷到近0C的勻漿介質(zhì)10ml,在研缽內(nèi)低溫?fù)v碎o。

3.搗碎液用雙層紗布過(guò)濾到燒杯中。

4.濾液移入普通玻璃離心管，在普通離心機(jī)上lOOOi/niiu離心

Imino

5.在2ml離心管內(nèi)依次加入50%蔗糖溶液和15%蔗糖溶液，

注意要用滴管吸取15%蔗糖液沿離心管壁緩緩注入，不能攪動(dòng)50%蔗

糖液面，5（）%蔗糖溶液加0.9ml,15%蔗糖溶液加加液完后，

可見(jiàn)兩種溶液界面處折光稍有不同，這樣密度梯度就制好了。

6.在制好的密度梯度上小心地沿離心管壁加入0.3ml上清液。

7.離心8000r/min,20min0

8.取出離心管，可見(jiàn)葉綠體在密度梯度液中間形成帶；用滴管輕

輕吸出滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察。還可在暗室內(nèi)用熒

光顯微鏡觀察。

（二）菠菜葉手切片觀察

用剃須刀將新鮮的嫩菠菜葉切削一斜面置于載片上，滴加1?2

滴0.35mol/LNaCl溶液，加蓋片后輕壓，置顯微鏡下觀察，

(1)在普通光鏡下觀察-(2)在熒光顯微鏡下觀察

(3)用同樣方法制片，但滴加1?2滴().01%可喔橙染液染色

Imin,洗去余液，加蓋片后即可在熒光顯微鏡下觀察。

七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(一)葉綠體的分離和觀察

I.普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形在高倍鏡下可看

到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。

2.以O(shè)lympus熒光顯微鏡為例，在選用B《blue》激發(fā)濾片、B

雙向色鏡和P530阻斷濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒

光。

3.加入口丫咤橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，而其中混

有的細(xì)胞核則發(fā)綠色熒光。

(二)菠菜葉手切片觀察

I.在普通光鏡下可以看到三種細(xì)胞，

(1)表皮細(xì)胞：為邊緣呈鋸齒形的鱗片狀細(xì)胞。

(2)保衛(wèi)細(xì)胞：為構(gòu)成氣孔的成對(duì)存在的腎形細(xì)胞。

(3)葉肉細(xì)胞：為排成柵狀的長(zhǎng)形和橢園形細(xì)胞。

葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下帶可以看到綠色的基粒。

2.在熒光顯微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光，但其熒光強(qiáng)度

要比游離葉綠體弱。氣孔發(fā)綠色熒光，兩保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的火紅色葉綠

體側(cè)環(huán)繞氣孔排列成一圈。表皮細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量要比葉肉細(xì)胞

少。

3.用口丫咤橙染色后，葉綠體則發(fā)出桔紅色熒光，細(xì)胞核可發(fā)

綠色熒光，氣孔仍為綠色。

細(xì)胞組分的分離

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握分級(jí)分離方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

利用細(xì)胞內(nèi)各組分在一定介質(zhì)中的沉降速度的差異，可采取分級(jí)

差速離心的方法，將各組分逐級(jí)分離出來(lái)。

三、實(shí)驗(yàn)材料

小鼠(30克)取肝臟

四、實(shí)驗(yàn)器材

同實(shí)驗(yàn)七外加eppendorf管、微量迸樣器、tip頭、臺(tái)式高速

冷凍離心機(jī)。

五、實(shí)驗(yàn)藥品

勻漿介質(zhì)(025mol/L蔗糖+O.CHmol/LTri*-鹽酸緩沖液

PH7.4),乙醇：冰乙酸(3：1),生理鹽水，姬姆薩染液，中性紅一

詹納斯綠染液(稱取0.04g中性紅、0.02g詹姆斯綠溶于100ml,

0.25mol/L蔗糖溶液中)。

其中O.Olmo/LTris一鹽酸緩沖液配法：O.lmol/L三羥甲基氨

基甲烷(Tris)10mL0.1mol/L鹽酸8.4ml加蒸儲(chǔ)水至100ml。

六、實(shí)驗(yàn)步驟

I.低速離心分離細(xì)胞核

⑴將饑餓24小時(shí)的小白鼠放入容器中麻醉致死，立即剪開(kāi)腹部，迅

速取出肝組織浸入預(yù)冷的生理鹽水中洗去血污，用濾紙吸干。，

(2)稱取0.5g肝組織，放在小燒杯中剪碎，用少量預(yù)冷的勻漿介質(zhì)

洗滌數(shù)次。

(3)將燒杯內(nèi)懸浮組織倒入玻璃勻漿器中進(jìn)行冰浴勻漿。用4層

紗布(先用少量勻漿介質(zhì)濕潤(rùn))過(guò)濾勻漿液至Corex離心管中，同時(shí)制

備1張濾液涂片，做好標(biāo)記，自然干燥。

(4漓心機(jī)上500r/min離心5min(4℃),將上層溶液吸入2支

cppcndof管中，蓋緊蓋子放在有冰塊的器皿內(nèi)，待分離線粒體時(shí)用。

沉淀物作進(jìn)一步處理。

(5)用5ml勻漿介質(zhì)懸浮離心下的沉淀物，用吸管混勻，以

1000r/min離心10min(4℃),吸去上清液，用吸管吸出少量沉淀

物上層涂片。剩余的沉淀物加入0.3-0.5mI勻漿介質(zhì)，

用吸管吹打成懸液，再制備一張涂片做好標(biāo)記，自然干燥。

2.高速離心分離線粒體

(1)將步驟1(4)中的eppendof管在臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)上以

10000r/min離心5min,緩緩吸出上清液至另2eppendorf管,留

取沉淀物冰浴保存，待涂片鑒定。

(2)另2支上清液在臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)上以1300()r/min離心

5min0

(3)吸去上清液，沉淀物置冰浴中，待制片鑒定時(shí)用。

3.分離物的鑒定

(1)細(xì)胞核。將步驟1中得到的涂片浸入乙醇一冰醋酸中固定

15min,吹干，滴姬姆薩染液(原液用1/15moi磷酸緩沖液

稀釋10—2()倍)染色l()min,自來(lái)水沖洗，吹干，在高倍鏡

下比較觀察涂片。

(2)線粒體。在2張干凈載玻片中央各滴2—3滴中性紅一詹納斯

綠染液，取步躲2高速離心得到兩份沉淀物分別均勻地涂布在玻片

上，染色30min后分別蓋上蓋玻片，在高倍鏡下觀察。附：更精致的分離方

將4.5ml0.34mol/L蔗糖溶液放入離心管，然后沿壁小心地加入

4.5ml鼠肝勻漿使覆蓋于上層。用高速冷凍離心機(jī)以700Xg離心

lOmin,得上清液I和沉淀物。沉淀物用10ml0.25moi/L蔗糖溶液洗2

次，每次lOOOXg離心lOmin,得到的沉淀物可進(jìn)行以下處理。(1)收集

質(zhì)膜：吸出沉淀中較疏松的上層，混懸于比重為1.16的蔗糖溶液中，沿

管壁小心加入已放在離心管中的比重1.18的蔗糖溶液的上層，經(jīng)700

Xg離心lOmin,質(zhì)膜最終集中在兩溶液界面上，吸出質(zhì)膜層。(2)細(xì)胞

核純化：將沉淀用5倍體積的0.34mol/L蔗糖0.5mol/LMg(Ac)2溶

液混懸，鋪在4倍于核懸液體積的0.88m01'/L蔗糖一0.5mol/L

Mg(Ac)2溶液之上，150()Xg離心2()min,沉淀物即為純化的細(xì)胞核。

(3)分離核仁：純化的細(xì)胞核混懸在2倍體積的0.34iiiol/L蔗糖一

0.5mol/LMg(Ac)2溶液中，超聲波破核膜，釋放出核仁，注意蔗糖介質(zhì)

pH中性或弱堿性時(shí)核膜才易破碎，超聲后的懸液鋪于4倍體積的

0.88mol/L蔗糖一0.5mol/LMg(Ac)2溶液之上，1700Xg離心

沉淀物即為核仁，溶液為上清液I。

將上清液IlOOOOXg離心lOmin得上清液II和沉淀物，沉淀物以

10ml預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗2次，每次lOOOOXg離心lOmin,

得沉淀物即為純化的線粒體。

上清液H經(jīng)16300Xg離心20min得上清液IH和沉淀物，沉淀物

以lOml預(yù)冷的().25m()l/L蔗糖溶液洗；16300Xg離心20min,得沉淀

物即為純化的溶酶體。

上清液in經(jīng)得沉淀物(為微粒體)和上清

液IV,后者再經(jīng)離心15()()()OXg3h左右可獲得核糖體、病毒、生物大分

子等。

四膜蟲纖毛的再生

一、背景和原理

纖毛和鞭毛是細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)，具有運(yùn)動(dòng)功能。纖毛和鞭毛的結(jié)構(gòu)基本相同。纖毛

軸心含有一束“9+2”排列的平行微管，中央微管均為完全微管，外圍二聯(lián)體微管由A,B

亞纖維組成，A亞纖維為完全微管，由13個(gè)球形亞基環(huán)繞而成，B亞纖維僅由10個(gè)亞基構(gòu)

成，另3個(gè)亞基與A亞纖維共用（圖9-16）。

微管是由微管蛋白組成的管狀結(jié)構(gòu)，對(duì)低溫、高壓和秋水仙素敏感。

大多數(shù)微管纖維處于動(dòng)態(tài)的組裝和去組裝狀態(tài)，這是實(shí)現(xiàn)其功能所必需的過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)以Rosenbaum和Carlson（1969）的實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，在降低pH和鈣離子存在的條件

下通過(guò)機(jī)械修剪的方法，在膜水平脫去四膜蟲的纖毛，剩下腫脹的，不能運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞。在不

同的生長(zhǎng)溫度（25℃和1700卜觀察纖毛的再生率，并且在不同的抑制物的作用卜研究微

管亞單位的合成和組裝。

二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

I.使用相差顯微鏡和血球計(jì)數(shù)器；

2.了解微管組裝的基本原理

三、教學(xué)安排

學(xué)時(shí)數(shù)：3—4小時(shí)。

四、實(shí)驗(yàn)儀器、器材與試劑

1.材料：梨形四膜蟲。

2.儀器：錐形瓶，相差顯微鏡，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，臺(tái)式離心機(jī)，滴管，注射器，parafilm

膜，載玻片，蓋玻片，定時(shí)器。

3.試劑：蛋白豚，亞胺環(huán)己酮，新霉素，秋水仙堿，EDTA,醋酸鈉，氯化鈣。

五、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1、分別將250亳升含1%蛋白陳四膜蟲培養(yǎng)物置于500亳升錐形瓶中于25c和17℃培

養(yǎng)。（時(shí)間）

2、兩瓶培養(yǎng)物分別80（）g離心10分鐘，重新懸浮于15亳升1%蛋白腺溶液，置于50

亳升錐形瓶，做好標(biāo)記。

3、準(zhǔn)備2個(gè)50亳升雛形瓶，各加入15亳升1%蛋白陳溶液；3個(gè)100亳升錐形瓶，含

20毫升1%蛋白腺溶液，分別加入10微克/升亞胺環(huán)己酮；50微克/升亞新霉素；加入2亳

克/升秋水仙堿。

4、以下操作在冰浴上進(jìn)行：

1）在零時(shí)間，用一個(gè)大試管在冰浴上將2.5亳升濃縮的四膜蟲懸液（生長(zhǎng)于25℃）加

至5亳升介質(zhì)A（lOmMEDTA-2Na;50mM醋酸鈉;pII6.0）中，攪拌混勻。

2）30秒后加入2.5亳升預(yù)冷的蒸儲(chǔ)水。

3）1分鐘后加入0.25亳升預(yù)冷的（）.2McaCL,parafilm膜封口，倒轉(zhuǎn)試管使之混合。

4）2分鐘后用裝有19號(hào)針頭的注射器吸取懸液并注入預(yù)冷的試管中（修剪掉四膜蟲的

纖毛）。迅速用滴灌取少量懸液，滴加在載玻片上鏡檢，觀察其是否失去運(yùn)動(dòng)性。

5）去纖毛后,立即把1亳升去纖毛的細(xì)胞加至20亳升1%蛋白陳溶液,25℃預(yù)熱的100

亳升錐形瓶中，于25c培養(yǎng)并開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

5、每隔10分鐘取出定量的樣品，對(duì)其隨時(shí)間變化的能動(dòng)性（motility）%進(jìn)行分析。由

于脫纖毛的細(xì)胞不能運(yùn)動(dòng)，切記在取樣前振蕩錐形瓶。右血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上觀察，估計(jì)運(yùn)動(dòng)細(xì)

胞和非運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的數(shù)目。制備快速標(biāo)本，在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞是否腫脹，有無(wú)新生纖毛

等情況。

6、同時(shí)對(duì)生長(zhǎng)于17'C的四膜蟲進(jìn)行脫纖毛，并同在25℃的四膜蟲的纖毛再生時(shí)間比

較。

7、從生長(zhǎng)于25c的四膜蟲懸液制備新鮮脫纖毛的細(xì)胞，在分別加入亞胺環(huán)己酮，新霉

素,秋水仙堿和空白對(duì)照的含20毫升的1%蛋白腺溶液100亳升錐形瓶中各加入1室升脫

纖毛細(xì)胞。每隔10分鐘分別從瓶中取樣，觀察其反應(yīng)是否發(fā)生改變。

8、從生長(zhǎng)于17℃的四膜蟲懸液制備新鮮脫纖毛的細(xì)胞，在分別加入亞胺環(huán)己酮，新霉

素，秋水仙堿和空白對(duì)照的含20亳升的1%蛋白陳溶液100亳升錐形瓶中各加入1亳升脫

纖毛細(xì)胞。每隔10分鐘分別從瓶中取樣，觀察其反應(yīng)是否發(fā)生改變。

9、從生長(zhǎng)于25℃的濃縮四膜蟲懸液制備一些新鮮的脫纖毛細(xì)胞。對(duì)?下列各個(gè)瓶中分別

加入1ml脫纖毛細(xì)胞：

(i)蛋白陳+10Rg/ml亞胺環(huán)己酮

(ii)蛋白陳+50pg/ml新霉素

(iii)蛋白陳+2mg/ml秋水仙堿

(iv)只含蛋白陳作為對(duì)照

每隔10分鐘從瓶中取欄。計(jì)實(shí)驗(yàn)講行盡可能長(zhǎng)的時(shí)間，以便觀察其反應(yīng)是否發(fā)牛改變。

記錄結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以能動(dòng)性(％)對(duì)時(shí)間(min)作圖表示：

(1)生長(zhǎng)于25℃和17℃的四膜蟲；

(2)抑制物對(duì)纖毛再生的效應(yīng)。

討論

作為這一實(shí)驗(yàn)的引伸，還可以應(yīng)用更多的抑制物來(lái)表明，是否需要生成新的信息性分

子，細(xì)胞周期中的不同時(shí)相是否起重要作用？對(duì)抑制物的觀察可以時(shí)可逆的，因?yàn)榻?jīng)過(guò)一個(gè)

時(shí)間階段后，細(xì)胞可以克服由于秋水仙堿引起的組裝阻斷。這些實(shí)驗(yàn)著眼于纖毛的再生系統(tǒng),

在這些系統(tǒng)中很容易辨認(rèn)出重點(diǎn)。這些實(shí)驗(yàn)還為諸如纖毛和鞭毛等微管結(jié)構(gòu)的合成和組裝提

供資料。

六、實(shí)驗(yàn)提示與注意事項(xiàng)

1.梨形四膜蟲的純培養(yǎng)可培養(yǎng)于1%蛋白陳(1%蛋白陳；0.25%酵母浸膏)，培養(yǎng)液用

15磅/時(shí)2高壓滅菌15分鐘。在接種培養(yǎng)物和整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中需用無(wú)菌技術(shù)，但在課堂實(shí)驗(yàn)

時(shí)無(wú)需應(yīng)用無(wú)菌采樣技術(shù)，為了獲得實(shí)驗(yàn)所需數(shù)品的培養(yǎng)物，含250ml蛋白陳的500間錐

形瓶在25c可培養(yǎng)1一2天，而在17c需2—3天。這一體積的培養(yǎng)物可用來(lái)接種25瓶新的

250ml培養(yǎng)物。

2.生長(zhǎng)的溫度很重要；如果四膜蟲沒(méi)有在25℃生長(zhǎng)至少6天的話，則再生速率顯著延

緩。因此，對(duì)兩種不同生長(zhǎng)溫度的比較，形成了本實(shí)驗(yàn)中一部分的基礎(chǔ)。

3.四膜蟲的離心必須小心，因?yàn)樵跍p速時(shí)細(xì)胞容易被漩渦卷起。如果參加實(shí)驗(yàn)的學(xué)

生較多，或沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)，最好在實(shí)驗(yàn)時(shí)由?位技術(shù)員來(lái)離心細(xì)胞。通常800g即可，但也可用

1000g。

七、思考題

纖毛再生所需的時(shí)間，是包括微管蛋白的合成和組裝在內(nèi)的許多過(guò)程決定的。培養(yǎng)物原

先生長(zhǎng)的溫度為什么能影響纖毛再生率？通過(guò)抑制物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們能否確定在實(shí)驗(yàn)過(guò)程

中，纖毛再生取決于現(xiàn)存前體庫(kù)的大小和新蛋白質(zhì)合成的程度？在較低級(jí)的真核細(xì)胞中我們

能學(xué)到什么有關(guān)蛋白質(zhì)合成的知識(shí)？

八、推薦閱讀

Rosenbaum,J.L.andCarlson,K.1968CiliaRegenerationinTetrahymenaandits

InhibitionbyColchicine,J.cellBiol.,40,415

Rosenbaum,J.L.andChild,F.M1967FlagellarRegenerationinProtozoan

Flagellates,J.CellBiol.,34,345

Rosenbaum,J.L.,Moulder,J.E.andRingo,D.L.1969FlagellarElongationand

ShorteninginChlamydomonas,J.CellBiol,41,600

植物愈傷組織誘發(fā)培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握無(wú)菌操作進(jìn)行愈傷組織誘發(fā)培養(yǎng)的方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)是進(jìn)行植物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)工作。一?般

認(rèn)為，分化了的植物根、莖、葉細(xì)胞具有全能性，在一定條件下進(jìn)行離體

培養(yǎng)，給予合適的營(yíng)養(yǎng)條件和激素水平，可以脫分化為愈傷組織。利用

愈傷組織可以進(jìn)行一些生物化學(xué)、發(fā)育學(xué)、遺傳學(xué)等方面的研究工作，

例如愈傷組織能進(jìn)一步誘導(dǎo)分化成完整的植株，還可以將愈傷組織進(jìn)

行單細(xì)胞分離，做懸浮培養(yǎng)，篩選各種生化突變型。

三、實(shí)驗(yàn)材料

煙草或迎春花莖段

四、實(shí)驗(yàn)器材

培養(yǎng)皿，燒杯，鏡子，剪刀，小三角燒瓶，大三角燒瓶，酒精燈，酒精

棉花，滴管，試劑瓶，濾紙，錫箔紙，超凈工作臺(tái)，植物細(xì)胞培養(yǎng)室。

五：實(shí)驗(yàn)藥品

MS固體培養(yǎng)基（見(jiàn)附錄，加0.8%瓊脂）：①培養(yǎng)基中加生

長(zhǎng)素2.4—D,為脫分化培養(yǎng)基，②培養(yǎng)基中加細(xì)胞分裂素6—BA

和生長(zhǎng)素NAA,為分化培養(yǎng)基，①和②其它成分相同。70%乙醇，

漂白粉溶液（1片漂白粉片/加300ml水），無(wú)菌水。

六：實(shí)驗(yàn)步驟

1.培養(yǎng)基的配制：MS固體培養(yǎng)基滅菌后稍冷，倒入無(wú)菌

培養(yǎng)皿分裝，或者直接配在三角瓶中，瓶口用二層牛皮

紙蓋上用繩扎緊，滅菌后待用。

2.迎春花枝條，去葉，用水洗莖。洗干凈后剪取5cm長(zhǎng)的

枝條3段，投入70%乙醇中浸泡30秒。再轉(zhuǎn)入漂白粉

溶液，消毒Imin。

3.移入超凈臺(tái)，按無(wú)菌操作要求將莖段取出置于無(wú)菌培養(yǎng)

皿內(nèi)，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗。再用無(wú)菌鐐子移入另一培養(yǎng)

皿內(nèi)，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗。

4.將莖段剪小，每段約LnK,放入脫分化培養(yǎng)基，每皿

6—7段，均勻分散在培養(yǎng)皿中，26℃暗培養(yǎng)3—4天，觀

察有無(wú)染菌。

5.挑取無(wú)污染莖段，轉(zhuǎn)接入新的脫分化培養(yǎng)基，繼續(xù)暗培

養(yǎng)7天，可觀察到愈傷組織開(kāi)始生長(zhǎng)。

6.如果以無(wú)菌煙草為材料?，可跳過(guò)2、3兩步，省去消毒、

漂洗過(guò)程。直接進(jìn)入第5步。取煙草葉片進(jìn)培養(yǎng)。

培養(yǎng)7天檢查有無(wú)染菌，如有污染荏轉(zhuǎn)接一次，繼續(xù)

暗培養(yǎng)7天，在這階段可以看到葉片細(xì)胞脫分化產(chǎn)生愈

傷組織。

7.將煙草愈傷組織轉(zhuǎn)接到細(xì)胞分化培養(yǎng)基，照光培養(yǎng)2—

3周，可以觀察到細(xì)胞分化產(chǎn)生新的苗。

鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解細(xì)胞原代培養(yǎng)的原理和方法，學(xué)習(xí)細(xì)胞消化、細(xì)胞計(jì)

數(shù)、營(yíng)養(yǎng)液的配制等操作技術(shù)，觀察原代細(xì)胞的形態(tài)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動(dòng)物體內(nèi)獲取的器官組織，經(jīng)消

化，培養(yǎng)成為單個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。用胰蛋白酶對(duì)組織進(jìn)行消化獲得單

細(xì)胞懸液，由細(xì)胞懸液定量接種后獲得原代細(xì)胞培養(yǎng)物。胰蛋白酶

的作用是消化除去細(xì)胞間質(zhì)，蛋白隨液中可添加膠原酶以增加消化

能力。

細(xì)胞培養(yǎng)是探索細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律一種基本的、十分有效的

實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)可以進(jìn)行細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育等

等各項(xiàng)研究，目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

三、實(shí)驗(yàn)材料

出生后一周左右的乳鼠。

四、實(shí)驗(yàn)器材

細(xì)胞培養(yǎng)箱，離心機(jī)，超凈工作臺(tái)。細(xì)胞培養(yǎng)皿，滴管，

血球計(jì)數(shù)板，吸液器，眼科剪刀，鏡子，小離心管。

五、實(shí)驗(yàn)藥品

RPM1640培養(yǎng)液，小牛血清，青霉素，鏈霉素，0.25%胰

蛋白酶和().1%膠原酶，，75%乙醇，碘酒，乙酸，PBS,EDTAo

六，實(shí)驗(yàn)步驟：

1.按無(wú)菌操作技術(shù)，消毒超凈工作臺(tái)及雙手。

2.用乙醛麻醉法處死小鼠：將乙醛棉球放進(jìn)燒杯中，然后放入小

鼠，蓋住杯口片刻等小鼠死亡。

3.碘酒消毒腹部皮膚。

4.75%酒精脫碘2次，然后進(jìn)入超凈工作臺(tái)操作。

5.用酒精消毒雙手及臺(tái)面。

6.用第一副眼科鍛及眼科剪“工”字型剪開(kāi)皮膚。

7.用第二副眼科剪，剪開(kāi)拉開(kāi)腹膜。

8.推開(kāi)腸管，在腹后壁找到腎臟，并剪取全腎。將剪刀放入75%

酒精中浸泡，待用。

9.置腎臟于滅菌的盛有PBS滅菌液的培養(yǎng)皿。(直徑60mm)中洗

兩次。夾取腎組織，移至滅菌1.5ml離心管內(nèi)，將剪刀在無(wú)菌PBS

中洗一下，剪碎腎組織，越碎效果越好。

10.加入0.25%胰蛋白酶+1%膠原酶1mL混合均勻。

11.37c作用15分鐘，每五分鐘輕輕彈擊。

12.無(wú)菌滴管輕輕吹打已消化組織2（）次，注意避免液體外溢。

13.1000RPM,離心1分鐘，沉淀未消化的組織塊和殘?jiān)?/p>

14.吸取含有離散細(xì)胞的上清液至另一個(gè)管內(nèi)。

15.3000RPM離心2分鐘,收集離散細(xì)胞。

16.棄去上清液，加入完全培養(yǎng)液1ml,吹打均勻。

17.吸取1（川1,加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。要求數(shù)四個(gè)角

的16個(gè)小格中細(xì)胞數(shù)的總和。然后按照以下公式計(jì)算細(xì)胞密

度。

總計(jì)數(shù)結(jié)果*1000*稀釋倍數(shù)=細(xì)胞個(gè)數(shù)/mL

4

18.按1。5細(xì)胞/ml,吸取1ml細(xì)胞加1ml培養(yǎng)液,接種到35mm

細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

19.輕輕混勻細(xì)胞，置培養(yǎng)皿于37C,5%的C02培養(yǎng)箱中，第二天.

觀察，換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，第四天觀察結(jié)果。

哺乳動(dòng)物貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解哺乳類動(dòng)物離體貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)條件；掌握貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的

傳代技術(shù)；觀察芍代細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)變化和形成

單層：棠握細(xì)胞培養(yǎng)中一些常用培養(yǎng)基、緩沖液、消化液、抗生素、完全

培養(yǎng)液的配制方法及各種無(wú)菌消毒方法；掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

要使細(xì)胞能在離體條件下存活并代代相傳，必須在體外人工模擬

一個(gè)類似于體內(nèi)的環(huán)境。所要求的這個(gè)環(huán)境呈液態(tài)，它包含有細(xì)胞賴以

生存的基本培養(yǎng)基、一定的滲透壓和氫離子濃度（即pH）,要有足夠的

空間，能在恒溫恒壓和無(wú)菌的條件下以滿足細(xì)胞群體增殖和代謝的需

要。離體貼壁培養(yǎng)細(xì)胞當(dāng)群休增殖匯合形成單層細(xì)胞群體達(dá)到飽和密

度時(shí)，必須進(jìn)行芍代。傳代過(guò)程是通過(guò)胰蛋白酶消化將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶

（ini）上脫落并分散成單細(xì)胞，經(jīng)過(guò)稀釋（或不經(jīng)稀釋）從一個(gè)容器上轉(zhuǎn)

移到另一個(gè)容器并給予新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行再培養(yǎng)。這種傳代過(guò)程稱為傳

代培養(yǎng)。

三、實(shí)驗(yàn)材料

貼壁培養(yǎng)細(xì)胞株（系）、CHO、Hela>L929、或其他細(xì)胞1-2瓶。

四、實(shí)驗(yàn)器材

設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱，電熱恒溫干燥箱，高壓消毒鍋，水浴鍋，離心機(jī),

冰箱，無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)。

器具：培養(yǎng)瓶（皿）3—6只，離心管2只，試管2只，滴管，5mK10ml,

移液管各若干支，血球計(jì)數(shù)板1塊，污物缸，橡皮塞，吸液器，pH試紙，

消毒藥棉等高壓或高溫滅菌備用。

五、實(shí)驗(yàn)藥品

RPMI1640培養(yǎng)基，5%NaHCO3,小牛血清，青霉素，鏈霉素，

谷氨酰胺，0.25%胰蛋白酶液,0.1%EDTA-Na2液,75%乙醇，HC1,臺(tái)酚

藍(lán)染色液，NaCLKC1,Na2HPO4,KH2Po4。

六、實(shí)驗(yàn)步驟

1.洗凈雙手，入無(wú)菌室緩沖間穿戴工作服、鞋、帽、口罩后進(jìn)入無(wú)

菌室。

2.點(diǎn)燃煤氣（或酒精）燈，用75%乙醇棉球抹拭雙手、操作臺(tái)表

面、各種試劑瓶口。

3.配制有關(guān)溶液

（1）RPMH640培養(yǎng)液：

1640粉劑一袋（10.4g）+1升millce水+谷氨酰胺0.3g+NaHCCh

2g,混勻后逐滴加入（）.5ml濃HCI到pH6.8,過(guò)濾滅菌，分裝，-20

℃保存。臨用時(shí)加10%小牛血清和兩種抗菌素溶液；最終濃度分別

為100單位/毫升。

（2）小牛血消滅活：小牛血清溶解后放置56C,30min,然

后分裝小瓶，?20℃保存。

（3）兩種抗菌素（雙抗）溶液：取青霉素8（）萬(wàn)單位和鏈霉素

80萬(wàn)單位，溶于80ml無(wú)菌水中，配成每毫升1萬(wàn)單位溶液，4℃保

存。

（4）PBS溶液：NaCl4g,KC10.1g,NazHPOM無(wú)水）

0.57g或（12H2O）1.43g,KH2Po40.1g,雙蒸水500mlpH7.2,10磅20

分鐘滅菌，4c保存。

（5）（）.1%EDTA：l（X）mgEDTA+100mlPBS

（6）胰蛋白酶溶液：50mg胰蛋白酶+100mlPBS

（7）胰酶消化液：溶液（5）+（6）,得到200ml溶液過(guò)濾滅

菌。

（8）細(xì)胞培養(yǎng)液：45mli640培養(yǎng)液+5ml小牛血清+0.5ml雙

抗。

4消化細(xì)胞

取接種3—5天形成單層的細(xì)胞株，使細(xì)胞面朝上，將培養(yǎng)液用

吸管吸去，用1—2滴管PBS洗1—2次，加入2滴管消化液。消化1

-2min,待細(xì)胞單層上出現(xiàn)透明針尖小孔隙時(shí)（此時(shí)鏡檢可見(jiàn)成片

層的細(xì)胞固縮成圓形，細(xì)胞與細(xì)胞之間相互接觸松散或互不接觸），

使細(xì)胞面朝上，輕輕吸去消化液，丟入廢物缸，然后加入2滴管完

全培養(yǎng)液，吸打細(xì)胞使其成細(xì)胞懸液。

如果消化過(guò)頭而細(xì)胞已自行脫落時(shí)，可加少量血清或完全培養(yǎng)液

以中止消化。滴管吸打均勻使成細(xì)胞懸液并轉(zhuǎn)移至離心管離心（1000r

，3—5min》后用完全培養(yǎng)液再懸浮。

5.細(xì)胞接種

取小型細(xì)胞培養(yǎng)瓶1只，然后加入5ml左右培養(yǎng)液，再將上述

細(xì)胞懸液等量（1：3或1：4）或不等量（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要）接種入內(nèi)，打勻、

平置、編號(hào)，37c培養(yǎng)，隔天觀察結(jié)果。

6.細(xì)胞計(jì)數(shù)

胰醐徹底消叱細(xì)胞，用4.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到試

管中，加0.5ml臺(tái)酚藍(lán)染色液，滴管吸打細(xì)胞懸液使均勻，吸取細(xì)胞懸

液（要充滿滴管，不能有氣泡）沿細(xì)胞計(jì)數(shù)板血蓋片邊沿輕輕滴入計(jì)數(shù)

板（不能有氣泡、空隙，也不能使其外溢以免定量有誤），在光學(xué)顯微鏡

（10X10）下計(jì)數(shù)按圖中四角大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，按公式計(jì)算如下

4大格細(xì)胞總數(shù)木IO1

4

求出每ml平均細(xì)胞數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)為該瓶細(xì)胞總數(shù)。

附錄二細(xì)胞培養(yǎng)用液-

1.平衡鹽液

(1)Hank液

原液：取NaC180.()g,Na2HPO4?2H2O0.6g,KC14.0g,KH2PCh

0.6g,MgSO4?7H2O2.0g,葡萄糖10.0g,無(wú)水CaC0L4g,

加水至1000mlo

配制:取Hank原液100mL加蒸鐳水896mL加0.5%酚紅4ml,混

勻。分裝，包扎，0.0552MPa(8psi)/30min或?.0689MPa

臨用前，加NaHCOs液調(diào)pH至72

(2)D-Hank液

NaCI8.0g,KCI0.4g,NazHPCh?12比00.12g,KH2Po40.06g,

葡萄糖1.0g,酚紅(1%)2mL加三蒸水至1000ml。

0.0689MPa(lOpsi)/lOmin滅菌，冷卻后置4c冰箱保存。

(3)Earle液

原液A：取NaCI68.0g,KCI4.Og,NaH2Po「HQ1.4g,福萄糖

10.0g,加水至500ml。

原液B:取CaCk2.0g,MgS04-7H202.Og,0.5%酚紅4.0ml,加

水至500ml?

配制：取原液A、B各1份,加18份水混勻。分裝，包扎,0.0552

MPa(8psi)/30min或0.0689MPa：10psi)/15nii