《應(yīng)用微生物學(xué)》PPT課件

1、應(yīng)用微生物學(xué),AppliedMicrobiology,應(yīng)用微生物學(xué),概論微生物的生長(zhǎng)微生物的代謝微生物的遺傳與遺傳育種微生物基因工程應(yīng)用微生物的基因操作系統(tǒng)酶工程與生物轉(zhuǎn)化微生物發(fā)酵微生物代謝工程,概論,基本概念應(yīng)用微生物學(xué)的發(fā)展微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)重要的應(yīng)用微生物,定義,應(yīng)用微生物學(xué):以一定的直接或間接應(yīng)用目標(biāo)研究微生物及其相互作用和與環(huán)境的作用的科學(xué)。(appliedmicrobiology)微生物學(xué)與相關(guān)的生物技術(shù)相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)一定的直接或間接應(yīng)用目標(biāo)。(microbiologyinapplication),微生物的特點(diǎn),資源量大（多樣性豐富）生物量大（生長(zhǎng)迅速）可塑性大（便于操作）個(gè)體?。?/p>

2、便于運(yùn)輸、攜帶）完成自然界的物質(zhì)循環(huán)造福人類引起災(zāi)難,當(dāng)前人類面臨的問(wèn)題,資源的壓力環(huán)境的挑戰(zhàn)傳染病的新生與復(fù)發(fā),微生物的應(yīng)用部分,細(xì)胞基因基因產(chǎn)物（酶、蛋白質(zhì)）代謝產(chǎn)物,應(yīng)用微生物學(xué)需解決的問(wèn)題,微生物菌種的獲得和優(yōu)化微生物培養(yǎng)條件的建立和優(yōu)化微生物的應(yīng)用,應(yīng)用微生物學(xué)研究的一般流程,提出問(wèn)題（工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、健康、國(guó)防）微生物？NoYes菌種解決問(wèn)題發(fā)酵解決問(wèn)題應(yīng)用解決問(wèn)題,應(yīng)用微生物學(xué)的發(fā)展微生物學(xué)的發(fā)展是與應(yīng)用緊密聯(lián)系的,逐步建立方法認(rèn)識(shí)微生物L(fēng)eenwenhock(1673)顯微鏡Jenner(1798)牛痘Basteur(1860s)發(fā)酵、低溫滅菌、自然發(fā)生Koch(1881)純

3、培養(yǎng)微生物形成產(chǎn)業(yè)Fleming(1929)青霉素Waksman(1944)鏈霉素現(xiàn)代生物技術(shù)Cohen(1972)DNA重組,微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu),細(xì)胞壁形態(tài)保持、物質(zhì)交換、信號(hào)識(shí)別細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞質(zhì)酶、反應(yīng)場(chǎng)所細(xì)胞核遺傳物質(zhì)核外遺傳物質(zhì)線粒體、質(zhì)粒,重要的應(yīng)用微生物,病毒：-噬菌體細(xì)菌：大腸桿菌(E.coli)棒桿菌(Corynebacterium)放線菌：鏈霉菌(Streptomyces)酵母菌：釀酒酵母(Saccharomycescerevisia)真菌：曲霉(Aspergillus),第一章微生物的生長(zhǎng),微生物生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)基生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué),微生物細(xì)胞的化學(xué)組成,細(xì)胞中幾種主要元素的含量(干重

4、的百分?jǐn)?shù)),細(xì)胞干物質(zhì)中主要組分和含量(%),微生物生長(zhǎng)的條件物質(zhì)條件,水a(chǎn)w=P/P0,微生物生長(zhǎng)的條件物質(zhì)條件,碳源和氮源OHPSKCaMgFeMnCuZnMoCoNiVBClNaSi維生素、氨基酸等,微生物生長(zhǎng)的條件環(huán)境條件,pH中性（弱酸、堿）、嗜酸、嗜堿溫度最適、生長(zhǎng)、耐受氧氣嚴(yán)格（專性）好氧、兼性、耐氧厭氧、嚴(yán)格厭氧壓力滲透壓極端環(huán)境微生物(extremophile)不可培養(yǎng)微生物(VBNCvivebutnon-cultured),極端微生物與不可培養(yǎng)微生物,極端環(huán)境微生物(extremophile):依賴于一種或多種極端物化因子生存的微生物嗜熱菌：50-80C(hyperther

5、mophiles80C)嗜冷菌：9嗜鹽菌：3M嗜壓菌不可培養(yǎng)微生物(VBNCvivebutnon-cultured),培養(yǎng)基提供微生物生長(zhǎng)所需物質(zhì)與環(huán)境條件的體系,培養(yǎng)基的組成要素,碳源、氮源、提供各種元素的無(wú)機(jī)鹽生長(zhǎng)因子或含生長(zhǎng)因子的物質(zhì)水、固化基（固體培養(yǎng)基）pH、滲透壓（糖、鹽濃度）、滅菌條件,培養(yǎng)基的種類,按物理狀態(tài)：固體、液體、半固體按化學(xué)組成：合成、豐富、半合成按使用目的：種子、發(fā)酵、篩選、再生、富集,培養(yǎng)基的選擇和設(shè)計(jì)原則,適用：利于達(dá)到目的利于下游工藝重復(fù)性好經(jīng)濟(jì)：原料價(jià)格原料用量全工藝綜合平衡安全：環(huán)境影響生物安全培養(yǎng)基的選擇和設(shè)計(jì)是應(yīng)用微生物學(xué)研究的重要內(nèi)容,生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué),增

6、值曲線（Multiplicationcurve）：細(xì)胞數(shù)-時(shí)間生長(zhǎng)曲線（growthcurve）：細(xì)胞量-時(shí)間,微生物生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)計(jì)量,顯微計(jì)數(shù)菌落計(jì)數(shù)濁度測(cè)定細(xì)胞干重,微生物生長(zhǎng)的數(shù)學(xué)描述,比生長(zhǎng)速度(specificgrowthrate)=dx/xdt細(xì)菌0.6-1.2酵母菌0.3-0.5放線菌0.1-0.3真菌0.1-0.3生物量倍增時(shí)間(biomassdoublingtime)td=ln2/增值度(multiplicationdegree)x/xo,第二章微生物的代謝,微生物初級(jí)代謝微生物次級(jí)代謝代謝調(diào)節(jié),微生物的代謝,微生物細(xì)胞所進(jìn)行的生化反應(yīng)的總和物質(zhì)代謝細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞與環(huán)境間的物質(zhì)轉(zhuǎn)

7、換的過(guò)程能量代謝載體信息代謝,微生物初級(jí)代謝,微生物從環(huán)境攝取物質(zhì)、獲得能量、合成自身新物質(zhì)的過(guò)程營(yíng)養(yǎng)物廢棄物能量（用于生長(zhǎng)）能量合成代謝（用于運(yùn)動(dòng)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)）細(xì)胞組分酶分解代謝能量來(lái)源,重要的初級(jí)代謝途徑,糖酵解途徑糖代謝的共同分解途徑三羧酸循環(huán)將糖最終氧化為二氧化碳和水，并產(chǎn)生大量能量磷酸戊糖途徑產(chǎn)生四碳糖、五碳糖和七碳糖等多種中間產(chǎn)物ED途徑細(xì)菌代謝葡萄糖產(chǎn)生乙醇的途徑氨基酸合成途徑,糖酵解途徑(Embden-Meyerhofpathway),GLCHXKZWFSOLGNDG6PG15LP6GRU5PPGIF6PPFKFBPF16PFBAGLYG3PDHAPGAPTPITDHP13GPG

8、K3PGGPM2PGENOPEPPYKPDCADHPYRACAETH,三羧酸循環(huán)(Krebscycle),PYRACoAMDHCITMALOAACTTFUMACOFUMICISDHOSMIDPSUCSUCCAKGLSCKGD,磷酸戊糖途徑,氧化（產(chǎn)生NADPH）RU5PP6GG15LG6PRKIRPE非氧化R5PX5P（分子重排）TKLTKLGAPS7PE4PTKLF6P,ED途徑,存在于某些缺乏完整EMP途徑的微生物中，是微生物特有的,將2-酮-3脫氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解為丙酮酸和3-磷酸甘油醛。,氨基酸合成途徑,GLC3PGSer,Gly,Met（3磷酸甘油酸衍生型）PPPR5

9、PPEPPhe,Try,Trp（芳香族氨基酸）HisPRYAla,Val,Leu（丙酮酸衍生型）OAAAspASALys（草酰乙酸衍生型）TCAAsnHSThrAKGMetIleArgGluGln（酮戊二酸衍生型）Pro,微生物次級(jí)代謝,次級(jí)代謝是相對(duì)于初級(jí)代謝的概念，指微生物在一定的生長(zhǎng)時(shí)期（一般為穩(wěn)定期）以初級(jí)代謝物為前體、合成對(duì)微生物生命活動(dòng)沒(méi)有明確功能的物質(zhì)的過(guò)程。次級(jí)代謝（前體聚合、初級(jí)代謝結(jié)構(gòu)修飾、裝配）營(yíng)養(yǎng)物前體次級(jí)代謝物（初級(jí)代謝物）,次級(jí)代謝的生物學(xué)意義,次級(jí)代謝的生理意義目前尚無(wú)定論，但它肯定對(duì)微生物是有意義的，否則這種需要多種酶類協(xié)同參與、并在精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制控制之下的代謝

10、過(guò)程是不會(huì)在生物體內(nèi)保存下來(lái)的。維持初級(jí)代謝的平衡次級(jí)代謝產(chǎn)物作為儲(chǔ)藏物質(zhì)的一種形式使菌體在生存競(jìng)爭(zhēng)中占優(yōu)勢(shì)與細(xì)胞分化有關(guān),青霉素,SCH3R-CO-NH-HCCHCBACH3OC-N-CHCOOH側(cè)鏈：R-CO-母核：噻唑環(huán)A，-內(nèi)酰胺環(huán)B,青霉素的生物合成,代謝調(diào)節(jié),細(xì)胞為維持正常的生理功能，它的組分、代謝物、能量和電子載體的合成大體上應(yīng)保持恒定。當(dāng)環(huán)境或細(xì)胞自身發(fā)生某種變化時(shí)，可以通過(guò)一定的反饋?zhàn)饔脕?lái)達(dá)到平衡生長(zhǎng)，這種反饋?zhàn)饔眉创x調(diào)節(jié)。,代謝調(diào)節(jié)的位點(diǎn),DNARNA酶底物底物產(chǎn)物（營(yíng)養(yǎng)物）（或中間物）底物進(jìn)入，酶的活性，酶的合成,代謝調(diào)節(jié)的本質(zhì)：酶的調(diào)節(jié),酶合成的調(diào)節(jié)：誘導(dǎo)與阻遏基因水

11、平酶活性的調(diào)節(jié)：反饋抑制蛋白質(zhì)水平,適應(yīng)現(xiàn)象,例1，大腸桿菌乳糖代謝：半乳糖苷酶乳糖-半乳糖+葡萄糖E.coli生長(zhǎng)于無(wú)乳糖培養(yǎng)基，半乳糖苷酶：3分子/細(xì)胞E.coli生長(zhǎng)于含乳糖培養(yǎng)基，半乳糖苷酶：3000-5000分子/細(xì)胞例2，大腸桿菌色氨酸代謝：E.coli生長(zhǎng)于無(wú)色氨酸培養(yǎng)基，合成色氨酸合成酶，當(dāng)色氨酸濃度增加時(shí)，色氨酸合成酶濃度下降。細(xì)胞需要某種酶時(shí)才合成，反映出細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)機(jī)理。這種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)可誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生與輔抑物抑制可阻遏酶的產(chǎn)生的現(xiàn)象稱適應(yīng)現(xiàn)象。乳糖：誘導(dǎo)物(inducer)色氨酸：輔抑物(corepressor),底物與誘導(dǎo)物,底物不等于誘導(dǎo)物,乳糖操縱子,iPOZYA調(diào)

12、節(jié)基因i：編碼阻遏蛋白啟動(dòng)子P：有CAP(CAP與cAMP復(fù)合物)和RNase兩個(gè)位點(diǎn)操縱基因O：阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)基因LacZ：半乳糖苷酶LacY：半乳糖苷透性酶LacA：半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶,協(xié)同誘導(dǎo)和順序誘導(dǎo),協(xié)同誘導(dǎo)Ia、b、cabc順序誘導(dǎo)ABCDIaBbCc,操縱子(operon),IPOS1S2S3調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因變構(gòu)(+or-)外界信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白IorCoR操縱子：一組功能相關(guān)的基因共同組成的轉(zhuǎn)錄單位，它們結(jié)構(gòu)上緊密聯(lián)系、功能上協(xié)同表達(dá)，接受同一調(diào)控序列的調(diào)控。,誘導(dǎo)與阻遏,調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)蛋白活性操縱子結(jié)構(gòu)基因酶合成誘導(dǎo)正打開(kāi)表達(dá)誘導(dǎo)負(fù)打開(kāi)表達(dá)阻遏正關(guān)閉不表達(dá)阻遏負(fù)關(guān)閉不

13、表達(dá),反饋抑制,反饋抑制：在合成代謝途徑中，代謝終產(chǎn)物抑制途徑中第一個(gè)酶的作用。E1E2E3E4ABCDE反饋抑制能對(duì)環(huán)境變化做出快速反應(yīng)特點(diǎn)：1，只有終產(chǎn)物或其結(jié)構(gòu)類似物有反饋抑制2，受抑制的是途徑中的第一個(gè)酶3，反饋抑制是可逆的,別構(gòu)酶(allostericenzyme),有多亞基和四級(jí)結(jié)構(gòu)有結(jié)合底物的活性中心和結(jié)合調(diào)節(jié)物的別構(gòu)中心活性中心和別構(gòu)中心在酶分子的不同部位,分支生物合成途徑的調(diào)節(jié),P1ABCP2協(xié)同反饋抑制同功酶反饋抑制累積反饋抑制順序反饋抑制（細(xì)調(diào)）,協(xié)同反饋抑制,P1ABCP2合成代謝途徑中的第一個(gè)酶有幾個(gè)變構(gòu)中心，分別可與不同終產(chǎn)物結(jié)合，每一種終產(chǎn)物對(duì)第一個(gè)酶都沒(méi)有反饋抑

14、制作用，只有當(dāng)幾種終產(chǎn)物同時(shí)過(guò)量時(shí)才有反饋抑制作用。,同功酶反饋抑制,P1ABCP2合成代謝途徑中的第一個(gè)酶有幾種結(jié)構(gòu)略有不同的同功酶，每一種終產(chǎn)物只對(duì)一種同功酶有反饋抑制作用，只有當(dāng)幾種終產(chǎn)物同時(shí)過(guò)量時(shí)，才使幾種同功酶同時(shí)被作用而抑制合成反應(yīng)。,積累反饋抑制,P1ABCP2每一種終產(chǎn)物對(duì)第一個(gè)酶都有一定的反饋抑制作用，他們合在一起達(dá)到最大程度的反饋抑制。,順序反饋抑制,P1ABCP2合成代謝途徑中的第一個(gè)酶的效應(yīng)物不直接是終產(chǎn)物而是代謝分支點(diǎn)的中間物，每一種終產(chǎn)物抑制分支后的第一個(gè)酶，使分支點(diǎn)的中間物積累，然后抑制合成代謝途徑的第一個(gè)酶。這一調(diào)節(jié)作用可根據(jù)不同終產(chǎn)物的量分別調(diào)節(jié)，是一種細(xì)調(diào)。

15、在許多分支代謝的調(diào)節(jié)中，細(xì)調(diào)與粗調(diào)往往同時(shí)發(fā)生。,第三章微生物的遺傳與菌種選育,微生物的遺傳物質(zhì)基因突變基因重組遺傳育種,微生物的遺傳物質(zhì),核酸(DNARNA)染色體染色體外遺傳物質(zhì),DNA是遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)證明,肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化S-dead，S-alive，R-aliveSdead-S-SR噬菌體感染T2(DNA-32P,protein-35S)-E.coli-上清T2（35S）沉淀E.coli（32P）雙螺旋模型,遺傳育種,基本過(guò)程基因突變、重組、導(dǎo)入、敲除篩選出發(fā)菌株包含變異株的群體優(yōu)良變異株目的株檢驗(yàn)檢驗(yàn)產(chǎn)生變異株選擇變異株檢驗(yàn)變異株,基因突變,遺傳物質(zhì)小范圍的改變，只涉及一對(duì)或少數(shù)幾對(duì)堿

16、基，又稱點(diǎn)突變。,基因突變的類型,基因型置換：GA,CT轉(zhuǎn)換(transition)；G,AC,T顛換(transversion)移碼(frameshift)：DNA分子中一對(duì)或幾對(duì)核苷酸的增加或缺失表型形態(tài)：造成形態(tài)發(fā)生改變的突變致死：造成個(gè)體死亡或生活力下降（半致死）的突變條件致死：在一定條件下有致死效應(yīng)的突變生化：沒(méi)有形態(tài)效應(yīng)的突變，如營(yíng)養(yǎng)缺陷、抗藥性等翻譯同義、錯(cuò)義、無(wú)義(UAG,UGA,UAA),基因突變的特性,稀有性突變率低（可通過(guò)理化處理提高突變率）隨機(jī)性獨(dú)立性Kmr10-5,Apr10-6,KmrApr10-11可逆性回復(fù)突變率也很低穩(wěn)定性突變率：一個(gè)世代或一定時(shí)間內(nèi)發(fā)生突變的

17、概率。,幾種微生物每次復(fù)制的突變率,誘變劑,能引起微生物遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的化學(xué)物理因子化學(xué)：堿基類似物（5-溴尿嘧啶、羥胺、亞硝酸）烷化劑（亞硝基胍、硫酸二乙酯）物理：短波（紫外線）射線（X-射線、射線）,誘變劑的作用,基因突變的應(yīng)用-誘變育種,雖然分子生物學(xué)技術(shù)已普遍用于育種，誘變育種仍是重要而基本的育種方法。誘變育種的基本步驟：出發(fā)株誘變劑處理初篩復(fù)篩鑒定一般要進(jìn)行多次，以積累有益突變。誘變譜系：誘變劑處理1誘變劑處理2出發(fā)株中間株1中間株2目的株,誘變育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié),出發(fā)株：性狀、潛力誘變處理：誘變劑選擇、劑量篩選：方法、篩選量High-throughputscreening,致死率與誘

18、變效果,突變株的篩選,初篩：棄去大量無(wú)價(jià)值菌株復(fù)篩：選出少數(shù)有價(jià)值菌株方法：直接測(cè)定利用可觀察現(xiàn)象營(yíng)養(yǎng)限制培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基,組成型育種,半乳糖苷酶加誘導(dǎo)酶抑制劑培養(yǎng)基：乳糖+鄰硝基-D-巖藻糖苷（誘導(dǎo)型酶抑制劑）只有組成型能利用乳糖交替培養(yǎng)法培養(yǎng)基1：乳糖培養(yǎng)基2：葡萄糖交替培養(yǎng)使組成型優(yōu)勢(shì)擴(kuò)大,交替培養(yǎng)法,營(yíng)養(yǎng)缺陷型育種,營(yíng)養(yǎng)缺陷型C-ABCB積累ABCD積累D,抗反饋抑制育種,原理：產(chǎn)物+酶（結(jié)合于調(diào)節(jié)中心）反饋抑制類似物+酶（結(jié)合于調(diào)節(jié)中心）影響生長(zhǎng)抗類似物的變異株類似物與酶的調(diào)節(jié)中心不能結(jié)合產(chǎn)物與酶的調(diào)節(jié)中心不能結(jié)合反饋抑制解除產(chǎn)物能過(guò)量積累,抗反饋抑制育種舉例,蘇氨酸C.crenatumAS1.5420mg/mlMNNGLR-1458AHVr6mg/mlA)：使G的7位和A的3位N部分甲基化，中性pH加熱，G(少量A)堿基脫落，再用0.1molNaOH處理，加熱到90C使糖基脫落硫酸二甲酯處理后加稀酸:A先斷裂(AG)，再用0.1molNaOH處理，加熱到90C使糖基脫落DNA與肼反應(yīng)(C+T)：C、T脫落成核糖脲，與哌啶作用在C、T處切斷DNADNA與肼反應(yīng)時(shí)加2MNaCl(C)：可抑制T脫落,雙脫氧法,4種反應(yīng)體系中摻入ddATP、ddCTP、ddGT