PCR污染防治手冊

1、聚合酶鏈反應(yīng)污染預(yù)防手冊首先，我們?yōu)槭裁匆绱酥匾晫酆厦告湻磻?yīng)污染的預(yù)防和控制？聚合酶鏈反應(yīng)是一種在體外選擇性擴增核酸或核酸片段的方法。在擴增過程中，擴增的dna產(chǎn)量呈指數(shù)級增長。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的濃度一般為1013拷貝/毫升，而1毫克的人類基因組dna只含有1.4106拷貝的單拷貝基因片段，因此使得聚合酶鏈反應(yīng)擴增反應(yīng)的靈敏度非常高。正是因為聚合酶鏈反應(yīng)的擴增效率很高，所以很容易被污染，而極少量的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物污染會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。在人乳頭瘤病毒分型試劑盒的應(yīng)用過程中，主要有兩個污染源：1 .樣本之間的交叉污染；2.污染2。聚合酶鏈反應(yīng)擴增產(chǎn)物。第二個污染源是最常見的。通過下面的例子可以

2、認識到聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品污染的嚴重性。在100毫升的反應(yīng)管中可以產(chǎn)生1012份分子。如果這些分子在標準的奧林匹克游泳池(50米*25米* 2米)中稀釋，0.1毫升的稀釋液含有400個擴增分子拷貝，這遠遠超出了在聚合酶鏈反應(yīng)擴增反應(yīng)中檢測幾個拷貝的限度。因此，我們必須重視產(chǎn)品殘留污染問題，尤其是臨床實驗室。二。聚合酶鏈反應(yīng)污染源對于人乳頭瘤病毒分型檢測試劑盒，污染源主要是聚合酶鏈反應(yīng)擴增產(chǎn)物的污染。有兩種常見的污染方式。一個是氣溶膠污染?？諝夂鸵后w表面摩擦?xí)r會形成氣溶膠。在操作過程中，反應(yīng)管劇烈搖動。當打開蓋子，樣品被吸入，被污染的樣品被取樣槍反復(fù)吸入時，會形成氣溶膠并被污染。據(jù)計算，一個氣溶膠粒

3、子可以包含48，000個拷貝，因此它造成的污染是一個值得特別注意的問題。第二是聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品的膠帶污染，這主要是由于未能嚴格遵守區(qū)劃規(guī)定，導(dǎo)致聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品擴散到樣品提取或聚合酶鏈反應(yīng)實驗室。實驗外套、手套、移液槍、槍頭、槍頭盒和試管架是膠帶的常見污染源。當污染發(fā)生時，這些地方是主要的懷疑場所。三、聚合酶鏈反應(yīng)污染追蹤在污染意外發(fā)生或疑似發(fā)生的情況下，可以設(shè)計一個簡單的小實驗來確定污染源。下列模板通過人乳頭瘤病毒聚合酶鏈反應(yīng)擴增系統(tǒng)擴增：a:水-作為陰性對照，如果試管擴增陽性，可以確定試劑被污染或氣溶膠被污染。b:陽性樣品-作為陽性對照，驗證實驗的成功。c-x :-使用浸泡在無菌水中的消毒

4、棉簽擦拭待檢場所的可疑污染源，浸泡后使用0.1毫升去離子水作為模板。需要檢查的常見地方是各種實驗臺面、移液槍、槍頭、槍頭盒、試管架、冰箱、冰箱把手、水浴鍋、提取相關(guān)試劑和相關(guān)人員的桌子。如果在上述跟蹤實驗后無法找到確切的污染源，污染可能是由空氣中的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的氣溶膠造成的。這時，實驗場地應(yīng)該被替換。如果條件不允許，室內(nèi)可以配備紫外線燈照射過夜，徹底通風(fēng)，并停止實驗幾天。四、聚合酶鏈反應(yīng)污染防治在進行聚合酶鏈反應(yīng)操作時，操作人員應(yīng)嚴格遵守一些操作程序，以盡量減少可能的聚合酶鏈反應(yīng)污染或防止污染。1.操作區(qū)域的劃分：實驗操作在三個不同的區(qū)域進行。聚合酶鏈反應(yīng)的前處理和后處理應(yīng)在不同的隔離區(qū)進

5、行。最基本的原則是，在聚合酶鏈反應(yīng)擴增和雜交檢測領(lǐng)域的東西屬于污染源，不得帶到前兩個領(lǐng)域。答：樣品制備區(qū)，包括擴增模板的制備；聚合酶鏈反應(yīng)加樣區(qū)，包括反應(yīng)液的制備和聚合酶鏈反應(yīng)擴增；c:聚合酶鏈反應(yīng)擴增和雜交檢測區(qū)，在此完成雜交操作。分區(qū)注意事項：每個工作區(qū)域都要有一定程度的隔離，操作設(shè)備要特殊、有方向性。例如：樣品制備聚合酶鏈反應(yīng)擴增產(chǎn)品分析產(chǎn)品處理。樣品保存應(yīng)在上述三個區(qū)域之外的單獨區(qū)域進行。藝術(shù)樣品制備區(qū)聚合酶鏈反應(yīng)樣品裝載區(qū)聚合酶鏈反應(yīng)擴增和雜交檢測區(qū)樣品制備和聚合酶鏈反應(yīng)樣品添加區(qū)聚合酶鏈反應(yīng)擴增和雜交檢測區(qū)緩沖室緩沖室聚合酶鏈反應(yīng)擴增和雜交檢測區(qū)樣品制備區(qū)聚合酶鏈反應(yīng)樣品裝載區(qū)圖1

6、圖二走廊聚合酶鏈反應(yīng)擴增和雜交檢測區(qū)聚合酶鏈反應(yīng)樣品裝載區(qū)樣品制備區(qū)圖4圖二圖32.實驗操作注意事項：a:佩戴一次性手套。如果反應(yīng)液意外濺出，請立即更換手套。b:使用一次性吸頭。禁止在聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)品分析室內(nèi)將其與吸頭混合。吸頭不應(yīng)長時間暴露在空氣中，以避免氣溶膠污染。c:以避免反應(yīng)液飛濺。為了避免在打開反應(yīng)管時出現(xiàn)這種情況，在打開蓋子之前，稍微離心收集管底部的液體。如果不小心灑在手套或桌面上，請立即更換手套，并用稀酸擦拭桌面；在d:操作過程中建立陰陽對照和空白對照，可以驗證聚合酶鏈反應(yīng)的可靠性，有助于判斷擴增系統(tǒng)的可信度。e:盡可能使用可更換的或高壓的樣品涂抹器。由于樣品涂抹器最容易受到產(chǎn)

7、品氣溶膠或樣品dna的污染，因此最好使用可更換的或高壓的樣品涂抹器。如果沒有這種特殊的進樣器，至少槍的外部和槍管應(yīng)該經(jīng)常擦洗。3.嚴格處理聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品：聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品包括雜交產(chǎn)品。閱讀后，雜交產(chǎn)品或聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品應(yīng)包裝在一次性封閉容器(垃圾袋、自密封袋)中，丟棄或倒入1摩爾/升鹽酸溶液或1:25 84消毒液中，浸泡半小時以上后丟棄。如果任何產(chǎn)品濺到桌面或電器上，應(yīng)立即用1摩爾/升鹽酸溶液或1:25 84消毒劑擦拭。4、根據(jù)實驗室情況建立完善的日常pcr防控體系并嚴格執(zhí)行這取決于人類。只有該系統(tǒng)得到實施，才能達到應(yīng)有的效果。系統(tǒng)根據(jù)實驗室的實際情況建立后，必須嚴格執(zhí)行。因為方便，放松警惕

8、是絕對不可能的。5.聚合酶鏈反應(yīng)污染后的處理1.如果設(shè)備受到污染，可以用1毫升/升鹽酸或1:25 84消毒劑擦拭或浸泡可疑設(shè)備。如果桌面被污染，盡可能用紫外線燈照射一夜。2.如果是試劑污染，請更換試劑，但試劑污染通常伴隨著儀器污染，所以一定要找到污染源并及時處理。3.對于受污染的地區(qū)，最好更換實驗場地，如果可能的話，安裝紫外燈整夜照明。如果沒有，必須加強通風(fēng)幾天，并在實驗停止后檢查是否有任何污染。六、實驗室實例：1、分區(qū)情況：實驗室分為兩個區(qū)域，類似于圖2所示。由于條件有限，沒有設(shè)置緩沖區(qū)，但兩個區(qū)域相距較遠，可以有效避免氣溶膠的擴散。2.規(guī)章制度：a:定期監(jiān)測：每月用棉簽進行一次定期監(jiān)測。監(jiān)

9、測位置為：超凈臺面、超凈臺面中的槍(包括槍吸孔和槍體內(nèi)部)、超凈臺面的槍頭盒、超凈臺面中的普通聚乙烯管架和聚合酶鏈反應(yīng)管架、冰箱手柄(兩套)、冰箱內(nèi)部(每個冰箱3個棉簽，包括冰箱內(nèi)表面和隨機冰箱內(nèi)部試劑盒)、普通試劑盒和試劑表面。抽取桌面、抽取區(qū)槍(包括槍吸孔和槍體)、抽取區(qū)常用試管架、抽取區(qū)槍頭盒、水浴水、沸水浴水、相關(guān)測試人員辦公桌面、鼠標和鍵盤。工作內(nèi)容：安排專人每月進行一次監(jiān)控。填寫每項監(jiān)測的記錄表(見附表)。b:物流：嚴格的單向流動僅允許物品從區(qū)域a(樣品制備和聚合酶鏈反應(yīng)樣品添加區(qū)域)流向區(qū)域b(聚合酶鏈反應(yīng)擴增和雜交檢測區(qū)域)。在進入?yún)^(qū)域a (1:100)之前，必須對區(qū)域b(聚合

10、酶鏈反應(yīng)管架、聚乙烯管架)中的任何物品進行處理84消毒液浸泡哈爾c:人流：必須為提取、聚合酶鏈反應(yīng)和區(qū)域b提供單獨的實驗服。當進入?yún)^(qū)域a和區(qū)域b進行實驗時，他們必須穿上自己的實驗服，不允許穿到其他區(qū)域。(注意：如果進入一個區(qū)域不是為了實驗，你不可以穿實驗服，但是絕對不允許從另一個區(qū)域穿實驗服進入)。實驗用的衣服每兩周洗一次，但是記住不要在兩個區(qū)域洗同一批衣服。本周你可以在一個地方洗衣服，下周在另一個地方洗衣服。需要做的是：指定一個星期洗衣服，每個人都要對衣服負責。d:實驗程序：1。實驗期間必須戴橡膠手套或薄膜手套；提取桌面的實驗完成后，用84。聚合酶鏈反應(yīng)實驗室每天晚上使用紫外線輻射(如果實驗

11、量小，可以減少)。如果在實驗過程中發(fā)現(xiàn)樣品(包括提取前和提取后)或聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物，必須立即用84洗滌；如果手接觸桌面或其他地方(槍、luminex儀器等)，必須盡快在區(qū)域b進行洗手。)可能污染聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品。定期處理：每周用1:25-84消毒液擦洗各區(qū)的槍支(不需要拆卸，主要在槍體和吸樣孔內(nèi))。每個地區(qū)的試管架每周用1: 25 84消毒劑擦洗。每周用1:25-84的消毒劑擦洗每個桌面。冰箱把手和外表面每周用1: 25 84消毒劑擦洗。水浴鍋和沸水浴鍋每周更換一次。每周用1: 25 84消毒劑擦洗相關(guān)員工的桌子。需要做什么：實驗(尤其是雜交檢測)并立即擦洗任何溢出的產(chǎn)品。b.經(jīng)常洗手。聚合酶

12、鏈反應(yīng)d、每周安排專人擦洗指定位置。聚合酶鏈反應(yīng)實驗室完成實驗并打開紫外線。:聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品處理：準備一個保鮮袋，每個聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品(包括雜交產(chǎn)品和聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品)在丟棄前必須與保鮮袋系好。在雜交試驗區(qū)，準備帶有保鮮袋和蓋子的垃圾桶，并將用過的槍頭捆綁起來丟棄。電泳旁邊的冰箱是聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品的臨時儲存區(qū)。嚴禁打開蓋子存放聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品，并定期清洗(一個月)。要做的工作：答：嚴格操作，小心處理作為高風(fēng)險項目的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品。指定一個清理聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品的日期。f:污染后的處理：如果懷疑污染，應(yīng)執(zhí)行監(jiān)測程序，并可制作更多的關(guān)鍵可疑物體的拷貝。找到污染源后，桌面用84擦洗，然后用紫外線照

13、射一夜，槍用84擦洗(拆卸)，然后用紫外線照射一夜，槍頭盒和試管架擦洗，然后用紫外線照射一夜，槍頭丟棄，試劑丟棄，衣服用84浸泡，然后清洗干凈。冰箱把手-84被擦洗，紫外線照射過夜。如果污染嚴重，用自來水清洗后，擦洗冰箱84的內(nèi)部，擦洗套件84或用自來水清洗。處理后，執(zhí)行監(jiān)測程序檢查污染情況。聚合酶鏈反應(yīng)污染監(jiān)測表測試日期_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _序列號編號位置試驗結(jié)果評論1超級干凈的桌面2超級干凈的槍在槍吸孔和槍體內(nèi)部3超凈桌面槍頭盒4超凈臺中的環(huán)氧樹脂管架和聚合酶鏈反應(yīng)管架5冰箱把手6冷凍手柄7冰箱內(nèi)部18冰箱內(nèi)部29冰箱試劑盒10