04光學(xué)顯微鏡

1、1,表面形貌分析方法：,光學(xué)顯微鏡 電子顯微鏡 掃描探針顯微鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,2,第一章 光學(xué)顯微鏡,近年來，光學(xué)顯微鏡得到了很大的發(fā)展：主要為,熒光標(biāo)記,數(shù)字成像與分析,共焦顯微鏡,3,第一章 光學(xué)顯微鏡,第0節(jié) 預(yù)備知識(shí),The Realm of Geometrical Optics,QUANTUM OPTICS,ELECTROMAGNETIC OPTICS,WAVE OPTICS,we will not need to consider wave or E incident angle ,Law of Reflection, = ,Question: What is the dir

2、ection of the reflected ray?,9,第一章 光學(xué)顯微鏡,第0節(jié) 預(yù)備知識(shí),Problem: What is the direction of the reflected ray,Put it on the moon!,Application?,Corner Cube,10,第一章 光學(xué)顯微鏡,第0節(jié) 預(yù)備知識(shí), taken from normal for n2 n1: ray bends towards normal,Snells Law,11,第一章 光學(xué)顯微鏡,第0節(jié) 預(yù)備知識(shí),The Power of Snells Law,h = 0.7 mm,h = 1 mm

3、,Snells Law can calculate the focal spot of the glass sphere. Glass spheres are used to couple light into and from optical fibers. Use Snells law and that is all!,note: these rays are NOT paraxial,12,第一章 光學(xué)顯微鏡,第0節(jié) 預(yù)備知識(shí),Paraxial Rays,We want to simplify the end results of light ray physics We assume

4、in the following equations that light rays make small angles with the “optic axis”,optic axis,1 deg: sin(30.5 mrad) 30.5 E-3,5 deg: sin(.873 rad) 0.872,10 deg: sin(.175 rad) 0.174,15deg sin(.262 rad) 0.259,30 deg: sin(.524 rad) .5,45 deg: sin(.785 rad) .707,13,第一章 光學(xué)顯微鏡,Refraction at a Surface,for p

5、araxial rays (i.e. small angle, 0,object is VIRTUAL when rays converge to object: so 0,image is VIRTUAL when rays diverge : si 0 when line lands on right R 0 R2 0,lens is DIVERGING when rays diverge: f 0,f 0,bi-convex,bi-concave,f 0,f 0,symmetric lenses cancel some aberrations,focus or magnify light

6、 produce real or virtual images,light expanders produce real or virtual images,planar convex,planar concave,increase f of systems symmetric lenses cancel some aberrations,23,Collection Efficiency,24,We Forgot Collection Efficiency,So, now we couple this system, and find out that we have too little l

7、ight striking the tissue what went wrong?, 1o,so,D/2,notice that a collimated beam (i.e. laser) would couple nicely,Power loss large,25,The Numerical Aperture (NA),2,CASE 1,CASE 2,CASE 3,26,Numerical Aperture,describes light gathering capability for: lenses microscope objectives (where n may not be

8、1) optical fibers , NA photons gathered,27,Which lens collects more light?,D = 5 mm,D = 10 mm,f = 10 mm,f = 10 mm,Collection Efficiency Revisited,28,The F/#,referred to as the “f-number” or speed measure of the collection efficiency of a system smaller f/# implies higher collected flux: f or D decre

9、ases the flux area f or D increases the flux area,f/#,29,F/# and NA,In many cases, the best coupling you can get occurs when you match the f/# between optical systems. Realistic f/#s: lens 2 fibers 1.5,30,Focusing and Aperture Stops,31,Example: Beam Expander,f1,f2,a,b,example of usage: He Ne laser b

10、eam diameter 1 mm microscope objective few mm note that low divergence of laser means high coupling! (there are other considerations: Gaussian Beam Optics, which is not covered here),32,Example of Aperture Stop,evil stray ray (prolongs graduation),aperture stop (pinhole),33,Aperture Stops,The apertu

11、re stop (AS) determines the amount of light reaching the image Note the AS increases the f/# AS needed to “clean up” optical signals such as: in front of a detector, such as in confocal microscopy in front of an objective to reduce stray light,34,Focusing Light in the Real World (1),Things to consid

12、er when focusing: #1,Light can not be focused through an aperture smaller than a diffraction-limited spot,for a standard lens 630 nm, this is 3 m,diffraction thru circular aperture,35,Focusing Light in the Real World (2),Things to consider when focusing: #2,Lens imperfections will only increase the

13、spot size These imperfections are known as “aberrations” Nowadays, computers generate lens combinations and surfaces to minimize these defects.,36,Aberrations,37,Spherical Aberration,38,Coma Aberration,39,Astigmatism, Curvature of Field,40,Distortion,41,Chromatic Aberration,n varies with wavelength,

14、 causing color-sensitive image changes may be corrected using achromatic doublets (cancels abbs),42,第一章 光學(xué)顯微鏡,第1節(jié) 引言,19世紀(jì)中前，光學(xué)設(shè)計(jì)水平低 像差大 分辨率差,19世紀(jì)中期，Lister(利斯特)和Amici(阿米西)消色差物鏡出現(xiàn),物鏡的NA提高到0.65和1.25,43,1886年，Abbe(阿貝 )設(shè)計(jì)高級(jí)消色差物鏡，,無像差、大NA物鏡出現(xiàn),1893年，Kohler(科勒 )提出照明方式，充分利用Abbe 物鏡的分辨率,在上述研究基礎(chǔ)上，到19世紀(jì)末，光學(xué)顯微鏡得到

15、了更新，出現(xiàn)了金相顯微鏡，雙目顯微鏡等,第一章 光學(xué)顯微鏡,第1節(jié) 引言,44,20世紀(jì)初，等焦面顯微鏡出現(xiàn),二次世界大戰(zhàn)前，Zernike(澤爾尼克)原理，相襯顯微鏡出現(xiàn),1953年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng),1955年，Nomarski(諾馬斯基 )顯微鏡（微分干涉顯微鏡）,1977年，Hoffman(霍夫曼 )調(diào)制襯度顯微鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,第1節(jié) 引言,45,光學(xué)顯微鏡示意圖1,第一章 光學(xué)顯微鏡,第1節(jié) 引言,46,光學(xué)顯微鏡示意圖2,第一章 光學(xué)顯微鏡,第1節(jié) 引言,47,第2節(jié) 成像原理,Airy斑與物鏡數(shù)值孔徑的關(guān)系,第一章 光學(xué)顯微鏡,48,瑞利判椐：,第2節(jié) 成像原理,第一章 光學(xué)

16、顯微鏡,49,第3節(jié) 聚光系統(tǒng),聚光系統(tǒng)收集顯微鏡光源發(fā)出的光，將它會(huì)聚成各個(gè)方向均勻的照明光束，照明樣品。,調(diào)整聚光系統(tǒng)得到所需的照明光束強(qiáng)度和發(fā)射角對(duì)獲得好的成像質(zhì)量特別重要。,更換物鏡時(shí)需重新調(diào)整聚光系統(tǒng)的光闌大小。,第一章 光學(xué)顯微鏡,50,Illumination: Koehler, Nelson, Abbe, critical It is important that the object be illuminated brightly, evenly, and at high numerical aperture. With Nelson (Abbe, critical) ill

17、umination, the condenser is adjusted to focus the light source (such as an oil flame) onto the object. Most electrical lamps for microscopes have coiled filaments, and focusing those onto the object gives very uneven lighting, although there are ribbon filament lamps designed to avoid that problem.

18、Koehler illumination uses a lens immediately in front of the lamp, and focuses an image of that lens onto the object. Some systems place a diffuser (ground glass) in front of the lamp instead of a lens; this is generally less desirable, but cheaper.,51,第3節(jié) 聚光系統(tǒng),第一章 光學(xué)顯微鏡,52,第4節(jié) 顯微物鏡,第一種結(jié)構(gòu),對(duì)紅光和藍(lán)光校正軸向

19、色差,校正綠光的球差,一塊單鏡和兩個(gè)雙膠合結(jié)構(gòu),最便宜的物鏡！,第一章 光學(xué)顯微鏡,53,第二種結(jié)構(gòu),校正紅光和藍(lán)光的色差,校正兩個(gè)波長(zhǎng)的球差,三組雙膠合透鏡，一個(gè)半月形透鏡和一個(gè)單鏡,較大NA，較好分辨率，較貴,第4節(jié) 顯微物鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,54,第三種結(jié)構(gòu),校正紅光、綠光和藍(lán)光的色差,校正兩個(gè)波長(zhǎng)的球差,一個(gè)三透鏡組合，兩個(gè)雙膠合透鏡，一個(gè)半月形透鏡和一個(gè)單鏡,大NA，好分辨率，貴,第4節(jié) 顯微物鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,55,上述三種透鏡沒有校正場(chǎng)曲，要矯正場(chǎng)曲，還需增加透鏡數(shù)目。,第4節(jié) 顯微物鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,56,第4節(jié) 顯微物鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,57,第5節(jié) 目鏡

20、,目鏡進(jìn)一步放大物鏡產(chǎn)生的中間像,它也要矯正像差,目鏡的示意圖,第一章 光學(xué)顯微鏡,58,第6節(jié) 焦深和景深,在考慮分辨率時(shí)，通常考慮的是垂直于光軸 平面內(nèi)點(diǎn)到點(diǎn)的分辨。,還有一個(gè)分辨率是軸向分辨率，也稱作景深。,景深由物鏡的NA決定，目鏡只是放大被分辨物的細(xì)節(jié),景深是顯微鏡物方會(huì)聚最近和最遠(yuǎn)位置間的距離,第一章 光學(xué)顯微鏡,59,在顯微鏡中，景深是非常小，通常在微米量級(jí),另一個(gè)參數(shù)是焦深：經(jīng)常與景深相互混淆,焦深是指像平面內(nèi)的最近與最遠(yuǎn)清晰成像的距離,幾何像面是指對(duì)非常薄樣品的切片，即使沒有像差，由于衍射效應(yīng)，每個(gè)像點(diǎn)都會(huì)擴(kuò)展到這個(gè)像面的上下。,第6節(jié) 焦深和景深,第一章 光學(xué)顯微鏡,60,

21、焦深隨著NA和M的變化而變化，在通常情況下，大NA有大的焦深，但景深很小。,焦深,景深,第6節(jié) 焦深和景深,第一章 光學(xué)顯微鏡,61,第7節(jié) 顯微鏡整體結(jié)構(gòu)示意圖,第一章 光學(xué)顯微鏡,62,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制,明場(chǎng)顯微鏡 ：振幅樣品,亮度和顏色,襯度=(B-S)/B*100%,B 背景處強(qiáng)度 S 樣品處強(qiáng)度,簡(jiǎn)單方法：顏色+濾光片,第一章 光學(xué)顯微鏡,63,物理解釋 （stop周圍多余光）,第一章 光學(xué)顯微鏡,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制：暗場(chǎng)顯微鏡,64,第一章 光學(xué)顯微鏡,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制：暗場(chǎng)顯微鏡,65,第一章 光學(xué)顯微鏡,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制：明場(chǎng)+暗場(chǎng),66,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制,第

22、一章 光學(xué)顯微鏡,67,相位物體：只有相位變化，無強(qiáng)度變化。,如何將相位變化轉(zhuǎn)變成強(qiáng)度變化,人眼的特性：強(qiáng)度和顏色變化,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制：相襯顯微鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,68,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制：相襯顯微鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,69,各向同性 各向異性,應(yīng)用：非等軸晶系的試樣,結(jié)晶方位 磁光薄膜 鐵磁材料,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制：偏光顯微鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,70,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制：偏光顯微鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,71,利用光的干涉產(chǎn)生的干涉條紋，觀察和測(cè)定表面起伏和傾斜的顯微鏡。特別適合于觀察薄膜的厚度。,原理：光的干涉現(xiàn)象,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制：干涉顯微鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,7

23、2,原理: Polarizer與Analyzer 偏振方向互相垂直。,應(yīng)用：臺(tái)階與表面,由Prism出射的兩束光光程差,（ne-no）2dtg,光的分束點(diǎn)在焦點(diǎn)上,4/(+)=(2n+1),不同折射率不同高度產(chǎn)生襯度,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制：微分干涉襯度顯微鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,73,應(yīng)用結(jié)果,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制：微分干涉襯度顯微鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,74,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制：熒光顯微鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,75,熒光染料,第8節(jié) 襯度增強(qiáng)機(jī)制：熒光顯微鏡,第一章 光學(xué)顯微鏡,76,總結(jié),分辨率限制,襯度增強(qiáng)方法,光學(xué)成像原理,顯微鏡結(jié)構(gòu),顯微鏡使用：調(diào)節(jié)，粗調(diào)，細(xì)調(diào),高放大倍數(shù)情況下要注意,第一章 光學(xué)顯微鏡,77,EVERYTHIN