基因工程的基本操作程序

1、基因工程的基本操作程序,基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：,提取,棉花細(xì)胞(含抗蟲基因),蘇云金芽孢桿菌,抗蟲基因,普通棉花(無(wú)抗蟲特性),棉花植株(有抗蟲特性),基因工程的基本操作程序,（1）目的基因的獲取 （2） （3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 （4）目的基因的檢測(cè)與鑒定,基因表達(dá)載體的構(gòu)建,一、目的基因的獲取,1、目的基因：主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。 2、獲取方法： （1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因； （2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因； （3）通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成,（一）從基因文庫(kù)中獲取目的基因,1.什么叫基因文庫(kù)？ 將含有某種生物不同基因的許

2、多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。,基因組DNA文庫(kù),cDNA文庫(kù),基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較,補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子,終止子,RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。,轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。,轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來(lái)，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來(lái)。,不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能 編碼蛋白質(zhì)。,：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能 編碼蛋白質(zhì),編碼區(qū),非編碼區(qū),原核

3、細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核 苷酸序列，在該序列中， 最重要的是位于編碼區(qū)上 游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,啟動(dòng)子,終止子,補(bǔ)：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),非編碼區(qū),與RNA聚合酶 結(jié)合位點(diǎn),內(nèi)含子,外顯子,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,內(nèi)含子：,外顯子：,真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的RNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。,非編碼序列：,包括非編

4、碼區(qū)和內(nèi)含子,結(jié)構(gòu)基因,外顯子,內(nèi)含子,轉(zhuǎn)錄、加工修飾,mRNA,原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,思考,編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,基因表達(dá)的計(jì)算,在真核生物中，對(duì)應(yīng)的是 的堿基數(shù),631,氨基酸數(shù),堿基數(shù),？,補(bǔ)充資料,基因中外顯子,基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系,基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的比較,小,大,無(wú),有,無(wú),有,某種生物的部分基因,某種生物的全部基因,可以,部分基因可以,概念辨析,基因文庫(kù)與基因庫(kù),基因庫(kù)是指某一生物群體中的全部基因。,基因文庫(kù)與基因克隆,基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。 基因文庫(kù)中

5、包含著為數(shù)眾多的克隆，建成后可供隨時(shí)選取其中任何一個(gè)基因克隆之用。,基因組文庫(kù)的構(gòu)建模式圖,通過(guò)對(duì) 受體菌 的培養(yǎng)而儲(chǔ)存基因,2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,（1） 鳥槍法 （2） 反轉(zhuǎn)錄法 （3）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法,人工合成法,（真核生物）,多用于原核生物,直接分離法,（1）鳥槍法：,供體細(xì)胞中的DNA,許多DNA片段,運(yùn)載體,限制酶,與載體連接,受體細(xì)胞,產(chǎn)生特定性狀,導(dǎo)入,外源DNA擴(kuò)增,目的基因,分離,(直接分離法),以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，再反轉(zhuǎn)錄酶的催化下反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，即cDNA，從而獲得所需的基因。,（2）反

6、轉(zhuǎn)錄法（cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法）,（3）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,推測(cè),推測(cè),目的基因,化學(xué)合成,上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？,操作簡(jiǎn)便廣泛使用,工作量大，盲目，分離出來(lái)的有時(shí)并非一個(gè)基因,專一性強(qiáng),操作過(guò)程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高,專一性最強(qiáng),僅限于合成核苷酸對(duì)較少的簡(jiǎn)單基因,思考： 如何從基因文庫(kù)中得到所需要的基因？,依據(jù)：目的

7、基因的有關(guān)信息。,如：根據(jù)基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色體上的位置； 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA； 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。,注意：,基因文庫(kù)中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因。,（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)條件 PCR過(guò)程 PCR的特點(diǎn),重復(fù)13步 2530輪,目的DNA片段 擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈 與引物復(fù)性,DNA變性 形成2條單鏈,子鏈延伸 DNA加倍,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過(guò)程 PCR的特點(diǎn),引物1,引物2,DNA引物,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過(guò)程 PCR的特點(diǎn)

8、,引物1,引物2,DNA引物,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過(guò)程 PCR的特點(diǎn),第1輪結(jié)束,第2輪開始,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過(guò)程 PCR的特點(diǎn),Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過(guò)程 PCR的特點(diǎn),第2輪結(jié)束, 概念：PCR全稱為_，是一項(xiàng) 在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù)。,前提條件：_； 原料：_、_ 、 _、 _。,原理：_,方式：以_方式擴(kuò)增，即_（n為擴(kuò)增循 環(huán)的次數(shù)）,結(jié)果：,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,DNA復(fù)制,已知基因的核苷酸序列,四種脫氧核苷酸,DNA引物,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,指數(shù)

9、,2n,使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增,模板DNA,過(guò)程：,變性、退火、延伸三步曲,變性：加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA 退火：冷卻至5560部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合 延伸：加熱至7075以目的基因?yàn)槟０澹铣苫パa(bǔ)的新DNA鏈,變性,退火,延伸,過(guò)程：,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從 引物的5端3端延伸，合成與模板互補(bǔ) 的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,思考？,1個(gè)DN

10、A分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增,循環(huán)4次， 理論上至少需要幾個(gè)引物？,2（2n-1）(n為循環(huán)次數(shù)),（24-1）2=30,模板DNA 特異性引物 耐熱DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,PCR體系基本組成成分,一對(duì)寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補(bǔ),PCR總結(jié)：,PCR的基本反應(yīng)步驟,變性 90-95C,延伸 70-75C,退火 55-60C,PCR總結(jié)：,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),溫度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較,堿基互補(bǔ)配對(duì),四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA

11、在高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復(fù)制,細(xì)胞核內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整個(gè)DNA分子,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過(guò)程 PCR的特點(diǎn),模板DNA,第1輪擴(kuò)增,第2輪擴(kuò)增,第3輪擴(kuò)增,第4輪擴(kuò)增,第5輪擴(kuò)增,第6輪擴(kuò)增,理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù) 實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù),根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的mRNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,

12、推測(cè),推測(cè),目的基因,化學(xué)合成,（三）化學(xué)方法人工合成目的基因,人工合成,(基因比較小),DNA合成儀,從基因文庫(kù)中獲取 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增 利用化學(xué)方法人工合成,歸納：獲取目的基因的方法,用一定的_切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切 口，露出_。 用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。,將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處， 再加入適量_，形成了一個(gè)重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA連接酶,1.過(guò)程:,二、構(gòu)建表達(dá)載體, 核心,質(zhì)粒,DNA分子,限制酶處理,一個(gè)切口 兩個(gè)黏性末端,兩個(gè)切口 獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,同

13、一種,過(guò)程:,2.基因表達(dá)載體的目的 （1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代； （2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,科學(xué)家在培育抗蟲棉時(shí)，經(jīng)歷了多次失敗，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。 然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲能力。,資 料:,思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？（P15）,不可

14、以。 因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。 必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：,（1） 生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；,（2） 通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄；,（3） 目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；,（4） 為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子（增強(qiáng)基因啟動(dòng)子工作效率的順式作用序列，能夠在相對(duì)于啟動(dòng)子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都發(fā)揮作用。）等；,（5） 有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)

15、胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。,3.基因表達(dá)載體的組成：,它們有什么作用？,a、目的基因,b、啟動(dòng)子,c、終止子,d、標(biāo)記基因,調(diào)節(jié)基 因,操縱基 因,結(jié)構(gòu)基因,RNA聚合酶,半乳糖苷酶,酶,酶,啟動(dòng)子,RNA聚合酶,啟動(dòng)子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。,思考1： 表達(dá)載體為什么一定要有啟動(dòng)子？,（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能有利于基因的表達(dá)； （2）通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒有啟動(dòng)子，

16、只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞無(wú)法轉(zhuǎn)錄。,思考2：終止子的作用是什么？ 終止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。,是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。,思考3：標(biāo)記基因有什么作用？,載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。,注意,用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵。,啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少。,目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。,基因工程技術(shù)

17、路線,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,常用的受體細(xì)胞：,有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：,借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。,（一）轉(zhuǎn)化：,目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過(guò)程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),（二）方法,將目的基因?qū)?植物細(xì)胞,將目的基因?qū)?動(dòng)物細(xì)胞,將目的基因?qū)?微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細(xì)胞,1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法,（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,特點(diǎn)： 易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力,原理： Ti質(zhì)粒上的T-DN

18、A可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。,植物腫瘤,過(guò)程：,優(yōu)點(diǎn):比較經(jīng)濟(jì)和有效,適用于 雙子葉植物 裸子植物,轉(zhuǎn)化過(guò)程:,Ti質(zhì)粒 目的基因,構(gòu)建,表達(dá)載體,導(dǎo)入,植物細(xì)胞,插入,植物細(xì)胞染色DNA,表達(dá),新性狀,轉(zhuǎn)入,農(nóng)桿菌,種子植物,裸子植物,被子植物,雙子葉植物,單子葉植物,: 松、柏、杉,:花生、大豆、棉花,: 水稻、小麥、玉米,雙子葉植物網(wǎng)狀脈,單子葉植物平行脈,基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。,（2）基因槍法,適用于單子葉植物,（3）花粉通道法,植物花粉在柱頭上萌

19、發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。,適用于被子植物,胚珠,花藥,花絲,柱頭,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）,思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？,（2）操作程序:,提純含目的基因表達(dá)載體,取受精卵,顯微注射,移植到子宮,受精卵發(fā)育,新性狀動(dòng)物,常用法：Ca2+處理,常用菌：大腸桿菌,微生物作受體細(xì)胞原因： 繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少,過(guò)程：,Ca2+處理大

20、腸桿菌,感受態(tài)細(xì)胞,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA,3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,思考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)胞？,用Ca2處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性,受精卵 體細(xì)胞,受精卵,細(xì)胞/個(gè)體,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注 射技術(shù),用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞,采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的作法正確的是（）A.將毒素蛋白注射到受精卵中B.將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)C.將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵D.將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中,B

21、C,1、基因工程中科學(xué)家常用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是 A結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便 B繁殖速度快 C遺傳物質(zhì)含量少、簡(jiǎn)單 D性狀穩(wěn)定、變異少 2、基因工程常用的受體細(xì)胞有 大腸桿菌 枯草桿菌 支原體 動(dòng)植物細(xì)胞 A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的，在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是 A.人工合成基因 B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合 C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D.目的基因的檢測(cè)和表達(dá),C,4. 采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是 將毒素蛋白質(zhì)注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋

22、白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵中 將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng) A B C D,C,5. 下列屬于基因工程中導(dǎo)入目的基因方法的是 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管道法 顯微注射法 胚胎移植 DNA分子雜交法 A B C D,C,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢測(cè): 是否插入目的基因 是否轉(zhuǎn)錄 是否翻譯 鑒定: 分子水平鑒定 個(gè)體生物學(xué)水平鑒定,1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因, 首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；,（1）方法:,DNA分子雜交,（2）過(guò)程:, 將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,

23、以此做探針；, 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。,（一）檢測(cè),基因探針：是一段帶有檢測(cè)標(biāo)記，且序列已知的，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列。 基因探針通過(guò)分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號(hào)，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來(lái)。,DNA分子雜交示意圖,采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。,1、用-珠蛋白的DNA探針可以檢測(cè)出的遺傳病是 A鐮刀狀細(xì)胞貧血癥 B白血病 C壞血病 D苯丙酮尿癥,A,2、應(yīng)

24、用基因工程技術(shù)診斷疾病的過(guò)程中必須使用基因探針才能達(dá)到檢測(cè)疾病的目的。這里的基因探針是 A用于檢測(cè)疾病的醫(yī)療器械 B用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的DNA分子 C合成-珠蛋白的DNA D合成苯丙羥化酶的DNA片段,B,（二）鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）,2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法:,分 子 雜 交,方法:,抗原-抗體雜交,過(guò)程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。,提取,（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),方法抗原-抗體雜交,Bt毒素蛋白,將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi),從小鼠血

25、管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體,抗體,蛋白質(zhì),出現(xiàn)雜交帶,脫分化,組織培養(yǎng),若不能表達(dá)，要對(duì)抗蟲基因再進(jìn)行修飾。,怎樣檢驗(yàn)抗蟲基因在棉細(xì)胞內(nèi)是否表達(dá)呢？,沒有抗蟲基因 的棉植株,有抗蟲基因的棉植株,棉鈴蟲,蟲沒有死,蟲被殺死,沒有表達(dá),目的基因表達(dá),目的基因的表達(dá)和檢測(cè),提示： DNA分子雜交技術(shù)首先提取受體細(xì)胞中的DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標(biāo)記的DNA探針雜交； 抗原抗體雜交所用到的抗體是用表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動(dòng)物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出而來(lái)的。,歸納: 基因工程的基本操作程序,獲取目的基因 從基因文庫(kù) 利用PCR 化學(xué)方法人工合成 構(gòu)建基因表達(dá)載體 目的基因、啟動(dòng)子、終

26、止子、標(biāo)記基因 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 轉(zhuǎn)化法（微生物）、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（植物）、顯微注射法（動(dòng)物） 目的基因的檢測(cè)與鑒定 檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯,為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？,構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過(guò)PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在

27、個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。,利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？,有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。,尋根問(wèn)底：,根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個(gè)抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做

28、?,要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物； 要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的誘導(dǎo)的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。,酚類誘導(dǎo)物主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中,4.-珠蛋白是動(dòng)物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時(shí)，動(dòng)物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計(jì)？,（1）從小鼠中克隆出-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA)。 （2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動(dòng)子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)

29、建成一個(gè)表達(dá)載體。 （3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無(wú)四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會(huì)不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長(zhǎng)出大腸桿菌菌落，則表明-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。 （4）培養(yǎng)進(jìn)入了-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取-珠蛋白。,DNA,附著在膜上,硝酸纖維素膜,加探針,報(bào)告基因（含熒光素分子）,變性,DNA分子雜交 （如檢測(cè)SARS病毒等）,a,b,c,d,檢測(cè)是否插入目的基因，利用DNA分子雜交技術(shù)，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的DNA雜交，看是否有雜交帶。 檢測(cè)是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，利用分子雜交技術(shù)，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的mRNA雜交，看是否有雜交帶。 檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)。抗體與蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原抗體雜交，看是否有雜交帶。 還可以進(jìn)行個(gè)體水平的