氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析-PHP.ppt

1、,氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析,彭花萍,E-mail:,儀器分析實(shí)驗(yàn),目的要求：,1、了解高效液相色譜的基本原理 2、了解高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)及正確使用 3、學(xué)習(xí)外標(biāo)法測定組分的含量,色譜起源,色譜的發(fā)明人,俄國科學(xué)家：M. S. Tswett,提出經(jīng)典液相色譜,植物的石油醚提取液在碳酸鈣吸附劑填充的玻璃管中分離出葉綠素及其他色素,流動(dòng)相：攜帶樣品流過整個(gè)系統(tǒng)的流體 固定相：靜止不動(dòng)的一相，色譜柱,色譜法分離的基本原理：,各組分性質(zhì)結(jié)構(gòu)差異,與固定相相互作用差異,隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度不等,反復(fù)多次分配平衡(吸附解吸),保留時(shí)間不同,達(dá)到分離效果,A+B+C,A,B,C,C,B,A,C,B,A,

2、C,C,B,色譜洗脫過程與色譜圖,t，min,色譜法：利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù),色譜定義,色譜是一種分離技術(shù). 色譜的主要目的是對混合物中的目標(biāo)物分離和定量,色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對時(shí)間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間。,保留體積VR 調(diào)整保留體積VR 死體積V0 峰面積 相對保留值 保留指數(shù),V=t.Fc；Fc為流動(dòng)相流速,保留值,區(qū)域?qū)挾?W1/2=2.335 W=4,W1/2 W,液相色譜,按流動(dòng)相與固定相的分子聚集狀態(tài)分類,氣相色譜,液相色譜,超臨界色譜,液相色譜：以液體作為流動(dòng)相的色譜分離方法 適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和

3、熱穩(wěn)定性差的化合物的分析 流動(dòng)相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用,HPLC,是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段： 高精度、耐高壓的輸液泵 高性能的色譜柱 高靈敏度的檢測器,HPLC特點(diǎn),分離性能好 靈敏度高（10-910-12 g） 選擇性高（同分異構(gòu)，旋光異構(gòu)） 分析速度快 進(jìn)樣量小（1-100 mL）,10,HPLC應(yīng)用領(lǐng)域,藥物分析（抗生素、維生素） 臨床分析（藥物代謝） 化學(xué)品（鄰苯二甲酸、醛、酮、藥物中間體） 環(huán)境（多環(huán)芳烴、農(nóng)殘、微嚢藻毒素） 食品（孔雀石綠、蘇丹紅） 生命科學(xué)（蛋白質(zhì)、多肽）,液相色譜的基本流程圖,流動(dòng)相,高壓泵,色譜柱,檢測器,高壓輸液

4、系統(tǒng),分離系統(tǒng),檢測系統(tǒng),記錄系統(tǒng),進(jìn)樣閥,進(jìn)樣系統(tǒng),預(yù)備柱, ,12,HPLC分析過程,分析前，選擇適當(dāng)?shù)纳V柱和流動(dòng)相，開泵，沖洗柱子，待柱子達(dá)到平衡而且基線平直后，用微量注射器把樣品注入進(jìn)樣口，流動(dòng)相把試樣帶入色譜柱進(jìn)行分離，分離后的組分依次流入檢測器的流通池，最后和洗脫液一起排入流出物收集器。當(dāng)有樣品組分流過流通池時(shí)，檢測器把組分濃度轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，經(jīng)過放大，用記錄器記錄下來就得到色譜圖。色譜圖是定性、定量和評(píng)價(jià)柱效高低的依據(jù)。,美國Agilent,美國Waters,日本島津,常用的高效液相色譜儀,LC-15C,4.2.2 高效液相色譜主要部件,(1) 泵輸液系統(tǒng) 主要部件之一，壓力：1

5、535MPa。提供高壓流動(dòng)相 應(yīng)具有壓力平穩(wěn)，脈沖小，流量穩(wěn)定可調(diào)，耐腐蝕等特性。,(2) 進(jìn)樣裝置,流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥 其結(jié)構(gòu)如圖所示：,泵,柱,進(jìn)樣,排放,泵,排放,柱,進(jìn)樣,六通閥是很好的定量裝置，使得高效液相色譜的進(jìn)樣量得到準(zhǔn)確的控制。,定量環(huán),裝填狀態(tài),進(jìn)樣狀態(tài),色譜柱（C18柱，ODS）,ODS柱是一種常用的反相色譜柱，也叫C18柱；由于它是長鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，適合分離有機(jī)物，因此在分析工作中應(yīng)用的最為廣泛。,常用流動(dòng)相：水、甲醇、乙腈,目前最普遍的檢測器 測量通過溶液后的紫外或可見光光強(qiáng)度的損失 吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系 在

6、被測物的最大吸收波長處檢測時(shí)靈敏度最大,紫外檢測器,朗伯比爾定律,眼藥水中的氯霉素,氯霉素滴眼液 用于治療由大腸桿菌、流感嗜血桿菌、克雷伯菌屬、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌和其他敏感菌所致眼部感染，如沙眼、結(jié)膜炎、角膜炎、眼瞼緣炎等。 為無色或幾乎無色的澄明液體。 其主要成份氯霉素，輔料為硼酸、硼沙、氯化鈉、防腐劑等,氯霉素,條件：需要已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品 待測成分與雜質(zhì)間分離良好,對照品 20ul,成份 A,樣品 20uL,成份 A,峰面積A樣品,峰面積A對照,外標(biāo)一點(diǎn)法,色譜定量： 峰面積與樣品濃度成正比。,已知濃度的氯霉素溶液,眼藥水稀釋液,氯霉素含量的測定,精密吸取眼藥水10mL，用7:

7、3的水:甲醇溶液稀釋至250.0mL，配制成眼藥水的稀釋溶液,1、對照品配制（0.1mg/mL),用清洗溶劑清洗微量進(jìn)樣針三次，用待測溶液潤洗三次，吸取待測溶液約25L，進(jìn)樣，記錄5分鐘，得色譜圖。,2、眼藥水樣品配制,精密稱取25.0mg氯霉素樣品，用5mL甲醇溶解，用7:3的水:甲醇溶液稀釋至250.0mL，配制成0.1mg/mL的對照品溶液,3、色譜測試,色譜條件：,色譜儀 島津LC-15C高效液相色譜 色譜柱 C18柱（5m，1504.6mm） 柱溫 室溫 流動(dòng)相 甲醇水（ 70 30 ） 流速 1.000ml/min 波長 272nm,色譜操作步驟：,1、依次打開檢測器、泵的開關(guān) 2、打開電腦主機(jī)，打開操作界面 3、排氣泡 4、設(shè)置色譜條件，打開泵開關(guān) 5、讓流動(dòng)相沖洗色譜系統(tǒng)，至色譜基線水平，約半小時(shí) 6、基線調(diào)零，填寫數(shù)據(jù)文件名及信息 7、單次運(yùn)行，進(jìn)樣并記錄數(shù)據(jù)