現(xiàn)代酶工程-11-蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用.ppt

1、蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用構(gòu)建新蛋白質(zhì)(酶)的一種途徑,生物體系之所以能夠相對(duì)獨(dú)立地存在于自然界中，并維持其獨(dú)立性和生命的延續(xù)性，都是因?yàn)樯矬w內(nèi)的一系列酶在發(fā)揮著作用。,酶保證了生物體內(nèi)組成生命活動(dòng)的大量生化反應(yīng)得以按照預(yù)定的方向有序、精確而順利地進(jìn)行，幾乎所有生物的生理現(xiàn)象都與酶的作用緊密相關(guān)，可以這樣說(shuō)，沒(méi)有酶的存在，就沒(méi)有生物體的一切生命活動(dòng)。,酶的工業(yè)應(yīng)用: 利用酶作為催化劑進(jìn)行生物催化與生物轉(zhuǎn)化，已成為生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品、手性藥物、食品添加劑等的重要工具,獲得了廣泛應(yīng)用。,天然酶的局限: 隨著酶催化應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大和研究的逐步深入，研究者已經(jīng)越來(lái)越發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的天然酶的催化特性常常

2、不能很好地滿(mǎn)足酶學(xué)研究和工業(yè)化應(yīng)用的要求。,主要原因：1 天然酶的穩(wěn)定性差、對(duì)某些底物的催 化活性低，以及缺乏有商業(yè)價(jià)值的 催化功能及其他性質(zhì)2 越來(lái)越多的情況需要一些酶催化很 多在自然界中并不存在的各種底物 來(lái)完成特定的反應(yīng)過(guò)程,根源: 天然酶的局限性源于酶的自然進(jìn)化過(guò)程。,天然酶的進(jìn)化過(guò)程: 在自然進(jìn)化過(guò)程中，進(jìn)化保證了酶對(duì)環(huán)境任何改變的適應(yīng)能力，但是自然進(jìn)化既沒(méi)有特定的方向，也沒(méi)有特定的目標(biāo)，它是在整個(gè)生物的繁殖和生存過(guò)程中自發(fā)進(jìn)行.,酶的進(jìn)化主要不是表現(xiàn)為某個(gè)酶分子的活力和穩(wěn)定性的不斷提高，而是在于生物整體的適應(yīng)能力、調(diào)控能力的增強(qiáng)，因此，通常只要求酶在生物體內(nèi)對(duì)特定的生物學(xué)功能有專(zhuān)一

3、性。,應(yīng)用過(guò)程對(duì)酶的要求 在酶催化過(guò)程的研究和應(yīng)用過(guò)程中，人們總是期望酶的活力和穩(wěn)定性越高越好，并具備良好的催化性能：能在非水溶劑、極端溫度和pH等特殊條件下催化反應(yīng)，尤其重要的是能接受自然界中不存在的各種底物。,正是由于天然酶的性質(zhì)與實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中人們對(duì)酶的期望之間的巨大差距，使對(duì)天然酶在分子水平上進(jìn)行改造顯得十分重要和迫切。,從目前的情況來(lái)看，具有新功能和特性的酶可以通過(guò)從大量未知的自然種系中尋找以及對(duì)現(xiàn)有的天然酶進(jìn)行改造，其中對(duì)于在自然進(jìn)化過(guò)程中沒(méi)有經(jīng)過(guò)特性和功能選擇的酶而言，對(duì)現(xiàn)有的天然酶進(jìn)行改造比大量篩選可能更加合適。,對(duì)酶進(jìn)行改造的理論基礎(chǔ): 無(wú)數(shù)的研究工作已經(jīng)表明，酶分子內(nèi)某些氨

4、基酸殘基的微小改變可使酶的催化能力和立體選擇性產(chǎn)生很大的改善。,遺憾的是，由于技術(shù)的限制，酶分子中氨基酸殘基與它的空間結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)功能之間相互關(guān)系等信息嚴(yán)重匱乏，加上這些關(guān)系又非常復(fù)雜，迄今為止，人們對(duì)它們的理解和認(rèn)識(shí)仍然非常膚淺,如何利用相對(duì)簡(jiǎn)單的方法以達(dá)到對(duì)天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶就顯得非常有研究意義和應(yīng)用前景。,解決辦法:蛋白質(zhì)定向進(jìn)化 20世紀(jì)80年代末，在PCR技術(shù)出現(xiàn)的初期，就有人著手利用Error-prone PCR技術(shù)改造蛋白質(zhì)。1994年，美國(guó)科學(xué)家Stemmer 開(kāi)創(chuàng)了可以在分子水平上實(shí)現(xiàn)家族基金內(nèi)部序列重組的新技術(shù)DNA Shuffling，可以在一個(gè)基因及其PCR

5、誘變產(chǎn)物，或一組家族基因的基礎(chǔ)上創(chuàng)造新基因。,酶分子的定向進(jìn)化技術(shù) 人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)突變，從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的親本酶（天然的或者人為獲得的）出發(fā)，經(jīng)過(guò)基因的突變和重組，構(gòu)建一個(gè)人工突變酶庫(kù)，通過(guò)一定的篩選或選擇方法最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進(jìn)化酶。,定向進(jìn)化技術(shù)的作用 使發(fā)生在自然界中漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程能在實(shí)驗(yàn)室中得以模擬，使人類(lèi)可以按照自己的意愿和需要改造酶分子，甚至設(shè)計(jì)出自然界中原來(lái)并不存在的全新酶分子(全新蛋白質(zhì))。,與自然進(jìn)化相比，酶分子的定向進(jìn)化過(guò)程完全是在人為控制下進(jìn)行的，使酶分子朝向人們期望的特定目標(biāo)進(jìn)化。,大量的研究已經(jīng)表明：

6、在目前對(duì)酶分子認(rèn)識(shí)還不成熟的情況下，通過(guò)DNA水平上的適當(dāng)修飾來(lái)改變酶的氨基酸順序，進(jìn)而改變酶的性能，是可能在重組生物中產(chǎn)生新的酶類(lèi)，并獲得比天然酶活力更高、穩(wěn)定性和催化性能更好的進(jìn)化酶，以滿(mǎn)足研究和應(yīng)用的需要。,定向進(jìn)化技術(shù)( directed evolution)的原理,Susanne Brakmann and Kai Johnsson (eds) Directed Molecular Evolution of Proteins Wiley-VCH,2002, ISBN 3-527-30423-1,定向進(jìn)化過(guò)程的原理,分子生物學(xué)文庫(kù)的分類(lèi)與構(gòu)建方法,定向進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展,定點(diǎn)突變（site-

7、specific mutagenesis或site-directed mutagenesis） 易錯(cuò)PCR技術(shù)(error prone PCR) DNA改組(DNA shuflling)：由美國(guó)Stemmer 于1994 年首次提出 一項(xiàng)體外重組技術(shù) 隨機(jī)引導(dǎo)重組(RPR) 1998 年,Arnold 提出了一種有效的新方法 交錯(cuò)延伸技術(shù)(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一種簡(jiǎn)化的DNA shuffling 技術(shù) 過(guò)渡模板隨機(jī)嵌合生長(zhǎng)(RACHITT)：與DNA shuffling 概念上明顯不同的、改進(jìn)的基因家族重組技術(shù).,定點(diǎn)突變,定點(diǎn)突變（site-specific mutagen

8、esis或site-directed mutagenesis）是指在目的DNA片斷（例如：一個(gè)基因）的指定位點(diǎn)上引入特定的堿基對(duì)變化的技術(shù)。 最早的通用性定點(diǎn)突變技術(shù)是由M. Smith的研究小組于1982年發(fā)明的，這種基于M13噬菌體載體的定點(diǎn)突變技術(shù)可以在任意一段DNA片斷的特點(diǎn)位點(diǎn)上引入點(diǎn)突變。這一技術(shù)在其發(fā)明后的一段時(shí)間曾被世界各國(guó)的研究者廣泛使用。Smith后來(lái)還因?yàn)榇隧?xiàng)研究與PCR的發(fā)明者M(jìn)ullis共享了1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,基于M13載體的寡核苷酸介導(dǎo)定點(diǎn)突變,基于M13載體的寡核苷酸介導(dǎo)定點(diǎn)突變,理論上，如果含突變的DNA鏈和正常的DNA鏈復(fù)制速率相同，應(yīng)該有50%的克

9、隆帶突變基因。但是，由于許多技術(shù)上的原因，實(shí)際上一般只有1%到5%的克隆帶突變基因。顯然，這樣的效率還不盡人意。 此后，研究者又設(shè)計(jì)出很多方法以提高定點(diǎn)突變的頻率，其中比較常用的Kunkel提出的一種配合該技術(shù)的誘變體產(chǎn)量富集法。,Kunkel的誘變體產(chǎn)量富集法,Kunkel提出的這種方法用具dut和ung基因缺陷的大腸桿菌制備M13載體。dut基因編碼催化dUTP 分解的dUTPase，該基因缺陷會(huì)使細(xì)胞中dUTP含量升高，導(dǎo)致復(fù)制時(shí)少量dUTP代替dTTP摻入DNA。ung 基因編碼尿嘧啶DNA糖基化酶，該基因缺失后，不能除去摻入DNA的dUTP。因此，利用dut ung 菌株制備的M13

10、載體中，大約1%的T被U取代。以這樣制備的M13(+)鏈為模板進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變，然后將得到的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化到dut+ ung+菌株中，最初的含UU的模板會(huì)被降解，而突變鏈則因不含U被復(fù)制。這樣，帶有定點(diǎn)突變基因的噬菌體比例可顯著提高。,Kunkel的誘變體產(chǎn)量富集法,以雙鏈DNA為模板的定點(diǎn)突變,定點(diǎn)突變的應(yīng)用實(shí)例 T4溶菌酶及其幾個(gè)突變種的特性,注：Tm為蛋白質(zhì)的總體結(jié)構(gòu)50%發(fā)生變性的溫度，用以表征蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。,易錯(cuò)PCR（error-prone PCR，簡(jiǎn)稱(chēng)EP-PCR）,利用PCR過(guò)程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配對(duì)特定基因進(jìn)行隨機(jī)誘變的技術(shù)稱(chēng)為易錯(cuò)PCR（error-prone P

11、CR，簡(jiǎn)稱(chēng)EP-PCR）。 為了降低PCR中DNA復(fù)制的精確度，最常用的方法是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反應(yīng)體系中加入一定量的Mn2+（替代天然的輔助因子Mg2+），并同時(shí)使反應(yīng)體系中各種dNTP的比例失衡（通常是將其中的一種dNTP降至5%10%）。這樣，由于Taq DNA聚合酶缺乏校對(duì)活性，其錯(cuò)配率會(huì)大大增加，通?？梢赃_(dá)到每千堿基對(duì)1個(gè)突變左右。另外，還可以加入dITP等三磷酸脫氧核苷類(lèi)似物來(lái)控制錯(cuò)配水平，采用這種方法可以將錯(cuò)配率提高到最高達(dá)每5個(gè)堿基對(duì)1個(gè)突變。當(dāng)然，錯(cuò)配率并不是越高越好，一般認(rèn)為，理想的突變頻率為每個(gè)基因1.55個(gè)點(diǎn)突變。,error-pronePCR,DNA重

12、排的原理及步驟,隨機(jī)引導(dǎo)重組(RPR),體外隨機(jī)引導(dǎo)重組是以單鏈DNA為模板，配合一套隨機(jī)引物，產(chǎn)生互補(bǔ)于模板不同位置的短DNA 片段庫(kù)(由于堿基錯(cuò)配，這些短DNA 片段也含有少量的點(diǎn)突變)，然后進(jìn)行類(lèi)似于DNA shuffling的全長(zhǎng)基因裝配反應(yīng)，獲得多樣性文庫(kù)。 與DNA shuffling相比，RPR具有以下優(yōu)點(diǎn)： a用單鏈DNA為模板對(duì)模板量要求少，大大降低了親本組分， 便利篩選 b克服了DNA shuffling中片段重新組裝前必須徹底去除DNase I的缺點(diǎn) c片段組裝體系與片段合成體系緩沖系統(tǒng)可兼容，組裝前無(wú)需純化操作 d隨機(jī)引發(fā)DNA合成不受模板DNA長(zhǎng)度的限制，便利了小肽的

13、改造,隨機(jī)引導(dǎo)重組(RPR),交叉延伸程序（Staggered extension process，StEP）,交叉延伸程序（Staggered extension process，StEP）是一種簡(jiǎn)化并改進(jìn)的DNA重排技術(shù)。它是由France Arnold研究小組在1997年提出的。在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中以?xún)蓚€(gè)以上相關(guān)的DNA片段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物先在一個(gè)模板鏈上延伸，隨之進(jìn)行多輪變性、短暫復(fù)性（延伸）過(guò)程，在每一輪PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機(jī)地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸，由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)進(jìn)行直到獲得全長(zhǎng)基因片段，重組的程度可以通過(guò)調(diào)整時(shí)

14、間和溫度來(lái)控制。此方法省去了將DNA酶切成片段這一步，因而簡(jiǎn)化了DNA重排方法。,交叉延伸程序,過(guò)渡模板隨機(jī)嵌合生長(zhǎng)(random chimeragenesis on transient templates，RACHITT),過(guò)渡模板隨機(jī)嵌合生長(zhǎng)技術(shù)是與DNA shuffling概念上明顯不同的、改進(jìn)的基因家族重組技術(shù)它不包括熱循環(huán)、鏈轉(zhuǎn)移或交錯(cuò)延伸反應(yīng)，而是將隨機(jī)切割的基因片段雜交到一個(gè)臨時(shí)DNA模板上進(jìn)行排序、修剪、空隙填補(bǔ)和連接。其中的懸垂切割步驟使短片段(比DNase消化片段還短)得以重組，明顯提高了重組頻率；如果在片段重組前后采用錯(cuò)誤傾向PCR還可引入額外點(diǎn)突變。,RACHITT,R

15、ACHITT,Coco等報(bào)道此法改造二苯并噻吩單加氧酶，產(chǎn)生的嵌合文庫(kù)平均每個(gè)基因含14個(gè)交叉，重組水平比DNA shuffling類(lèi)方法(14個(gè)交叉)高出幾倍；并且可在短至5 bp的序列同一區(qū)內(nèi)產(chǎn)生交叉。這種高頻率、高密度的交叉水平是DNAshuffling所難以達(dá)到的。,分子定向進(jìn)化技術(shù)經(jīng)典實(shí)例頭孢菌素酶基因的單基因重排和家族基因重排,Moxalactam,羥羧氧酰胺頭孢菌素,頭孢菌素酶基因的單基因重排和家族基因重排,首先從四種不同的細(xì)菌中分別獲得長(zhǎng)度為1.6kb的頭孢菌素酶基因。它們的DNA同源性很低，從58%到82%不等。然后每個(gè)基因分別重排，從各自的文庫(kù)中選出50000個(gè)克隆子移入含羥羧氧酰胺頭孢菌素的平板。從平板上篩選得到的最好的突變子，它對(duì)羥羧氧酰胺頭孢菌素的抗性相對(duì)于親本來(lái)說(shuō)大約增加了8倍。 作為比較，對(duì)四個(gè)基因進(jìn)行家族基因重排來(lái)構(gòu)造頭孢菌素酶基因的重組文庫(kù)。同樣選出50000個(gè)克隆子移入含羥羧氧酰胺頭孢菌