病毒的細(xì)胞培養(yǎng)(1)

1、病毒的細(xì)胞培養(yǎng),趙健喬,一 基本原理 二 細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念 三 主要優(yōu)點(diǎn) 四 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品的前期處理 五 培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型 六 細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)步驟 七 病毒的細(xì)胞培養(yǎng),一 基本原理,通過機(jī)械解離或消化等方法將組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個細(xì)胞，給與必要的生長條件。模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體外能繼續(xù)生長與增值。 在長成致密單層細(xì)胞后，將病毒接種在細(xì)胞上，置于適當(dāng)環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變（CPE）待75%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE后收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，置-70保存?zhèn)溆谩?細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念,傳代：細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。 原代培養(yǎng)：取自體內(nèi)新鮮組織

2、并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。,二 主要優(yōu)點(diǎn), 研究的對象是活的細(xì)胞。 研究的條件可以人為的控制。 研究的樣本，可以達(dá)到比較均一性。 研究的內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄。 研究的范圍比較廣泛。 研究的費(fèi)用相對較經(jīng)濟(jì)。,三 分類,原代細(xì)胞培養(yǎng) 傳代細(xì)胞培養(yǎng),原代細(xì)胞培養(yǎng),概念：從供體獲取組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，細(xì)胞染色體仍為二倍體，接近和反映體內(nèi)生長特性，適合做藥物測試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的實(shí)驗(yàn) 缺點(diǎn)：傳代次數(shù)較多細(xì)胞就會衰亡。,傳代細(xì)胞培養(yǎng),概念：原代細(xì)胞經(jīng)過一系列傳代，產(chǎn)生變異，轉(zhuǎn)化為能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞。 傳代細(xì)胞可以直接從腫瘤組織

3、獲得，又可以通過人工馴化獲得。 常用的傳代細(xì)胞：PK-15、IBRS-2、Vero、Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela 等,四 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品的前期處理,1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿 (2)塑料器皿 2.包裝 3.消毒：在組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，務(wù)必保證組織細(xì)胞在無微生物的條件下生長。,4.細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基（液）:,（1）水：蒸餾水、雙蒸水，可高壓除菌。 （2）平衡鹽溶液（PBS)：PH為7.27.4，不含鈣鎂離子 ， 可高壓除菌。 （3）消化液 : 胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的濃度為025，pH值7.2左右。需過濾除菌。 EDTA液：常用濃度為 002，配制時采用無Ca2

4、+、Mg2+平衡鹽液溶解，高壓滅菌后即可使用。,(4) 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。 天然培養(yǎng)基： 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。 優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好 缺點(diǎn)：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，易發(fā)生支原體污染,合成培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量

5、相對固定。成本低 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。,人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。,血清中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） 多種金屬離子 激素 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。 各種生長因子 轉(zhuǎn)移蛋白 不明成分,一般說來含5小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長一般需加10血清 對于血清支持細(xì)胞生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚 血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量

6、最好。 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。 血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘,（5）丙酮酸鈉、葡萄糖：是屬碳水化合物的成分，是細(xì)胞生命的能量來源。 （6）抗生素：最終濃度為青霉素 100 Uml，鏈霉素100Uml（青霉素為80萬U瓶，將其溶解于4ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加人0.5ml；鏈霉素為100萬U瓶，將其溶解在5ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液加0.5ml）。 （7）凍存液：二甲基亞砜 （8）細(xì)胞生長液：是用以維持細(xì)胞生長增殖的液體。 其是配方： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8090 血清 10% 雙抗 100u/ml （9）細(xì)胞維持液：用以維持細(xì)胞緩慢生長或不

7、死的培養(yǎng)液。 其是配方： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 95 血清 25 雙抗 100u/ml,五 培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型, 貼附生長型細(xì)胞 必須貼附于底物才能生長的細(xì)胞。從形態(tài)上大體分為上皮細(xì)胞型及成纖維細(xì)胞型，還有一些難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的細(xì)胞。 懸浮生長型細(xì)胞 不需要附著于底物而于懸浮狀態(tài)下即可生長。,每代貼附生長細(xì)胞的生長過程,游離期 貼壁期 潛伏期 對數(shù)生長期 停止期（平臺期）,貼附生長型細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板,懸浮生長型細(xì)胞,六 細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)步驟,1原代細(xì)胞的培養(yǎng) 以雞胚成纖維細(xì)胞為例 （1）取胚 （2）組織處理 （3）消化 （4）分裝、培養(yǎng),（1）取胚,選取9-11

8、日齡SPF雞胚，大頭朝上直立于蛋架上，用碘酒、酒精消毒氣室外殼。用鑷子從氣室端打開蛋殼，撕開殼膜，用無菌鑷子輕輕取出雞胚，放入滅菌平皿中。,（2）組織處理,用PBS液沖洗胚體2-3次，再將雞胚的頭、爪、內(nèi)臟去除，剩下的胚體在用PBS液沖洗胚體2-3次，然后再放入平皿中，用剪刀將雞胚剪成碎塊。,（3）消化,用PBS液充分沖洗組織碎塊2-3次，加入3-5倍量的胰蛋白酶消化液，置37消化10分鐘，每隔2-3分鐘輕輕搖動一次。待組織碎塊聚合成團(tuán)，邊緣毛樣模糊時取出，輕輕吸取上層消化液，加適量DMEM培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞分散。,（4）分裝、培養(yǎng),將細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入到

9、10ml DMEM，充分混勻，讓細(xì)胞呈單個形式存在，最后將其放入恒溫箱中培養(yǎng)。,2傳代細(xì)胞的培養(yǎng),（1）細(xì)胞的復(fù)蘇 （2）細(xì)胞的傳代 （3）細(xì)胞的換液 （4）細(xì)胞生長狀況的觀察 （5）細(xì)胞的凍存,（1）細(xì)胞的復(fù)蘇,概述 復(fù)蘇細(xì)胞與凍存的要求相反，應(yīng)采用快速融化的手段。這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化。避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損害。,操作步驟 準(zhǔn)備好培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液和離心管等放于超凈工作臺內(nèi)。 從保存液氮或低溫冰箱中凍存管（安瓶）的小袋或凍存盒內(nèi)取出的凍存管（安瓶）應(yīng)直接投入37溫水中，并輕輕搖動令其內(nèi)容盡快融化。 從37水浴中取出凍存管或安瓶，離心100

10、0r1min,用酒精消毒后開啟，用滴管吸出上清液，注入培養(yǎng)液1ml充分混勻，轉(zhuǎn)入刻度離心管制成細(xì)胞懸液后低速離心，除去上清液，必要時再重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次。 用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)。如果復(fù)蘇時細(xì)胞密度較高要及時傳代。細(xì)胞復(fù)蘇時細(xì)胞數(shù)可以做1020倍稀釋，接種密度以5105 ml為宜。,（2）細(xì)胞的傳代,原理 在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和（細(xì)胞增值達(dá)到一定密度后），為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接

11、分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。,操作步驟 將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。 用1-2ml營養(yǎng)液或PBS緩沖液，清洗培養(yǎng)瓶，倒出 加入1ml含有EDTA的胰酶，清洗五面，倒出 在加入1ml含有EDTA的胰酶，當(dāng)看到培養(yǎng)瓶上含有一兩個小空斑，也可看到有灰白色渾濁時，將胰酶倒掉 加入培養(yǎng)液，用移液管吹洗貼有細(xì)胞的一面，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上吹下來 然后進(jìn)行傳代,消化傳代的步驟,（3）細(xì)胞的換液,原理： 當(dāng)細(xì)胞的量很少，未能鋪滿整個生長表面，但細(xì)胞培養(yǎng)液的pH值已經(jīng)發(fā)生很大變化；或者是細(xì)胞形態(tài)很差等情況時，需要給細(xì)胞換液。,操作步驟 （1）吸棄或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)的舊培養(yǎng)液 （2）加入PBS溶

12、液清洗細(xì)胞瓶五面 （3）加入足量的細(xì)胞生長液，放入37、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。,（4）細(xì)胞生長狀況的觀察,原理： 應(yīng)每日或隔日觀察一次細(xì)胞，及時了解細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量及培養(yǎng)液pH值、污染與否等情況，以便采取相應(yīng)的措施處理。 肉眼觀察 顯微鏡觀察,（5）細(xì)胞的凍存,傳代細(xì)胞應(yīng)有充足的凍存儲備。 一則防止細(xì)胞因污染等原因造成細(xì)胞系的絕種。 二則防止細(xì)胞因傳的代次太多，造成細(xì)胞衰老或細(xì)胞發(fā)生變異。,細(xì)胞凍存方法,（1）選取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用常規(guī)傳代的方法將細(xì)胞制成懸液并計(jì)數(shù)，800-1000r/min離心5min，棄上清。 （2）用細(xì)胞凍存液將沉淀重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至106-107個/ml，分裝于

13、凍存管，注明細(xì)胞名稱，傳代及凍存日期。 （3）冷凍保存：將凍存管于4放置30min，然后移入-80超低溫冰箱過夜，再放入液氮罐長期保存。亦可使用程序降溫劑逐漸降溫，凍存速度先為每分鐘下降速度1-2，當(dāng)溫度達(dá)到-25時，可調(diào)整下降速度為每分鐘5-10，溫度降至-100時，再放入液氮罐中長期保存。,七 病毒的細(xì)胞培養(yǎng),以禽流感感染雞胚成纖維細(xì)胞為例。 （1）病料的處理 （2）病毒分離、繁殖 （3）細(xì)胞病變的觀察 （4）效價測定 （5）中和實(shí)驗(yàn),（1）病料的處理,采集疑是感染禽流感禽的心、腦、肺、淋巴結(jié)在含有雙抗的PBS液中研磨，4過夜，3000r/min離心10min，上清通過0.22m抽濾,（2）病毒分離、繁殖,1 將病毒液稀釋成多個濃度分別接種在雞胚中，雞胚死亡后收集尿囊液。取效價最高的尿囊液接種細(xì)胞。 2 將長成單層致密的雞胚成纖維細(xì)胞液倒掉，用PBS反復(fù)清洗3次，將死亡或脫落的細(xì)胞洗掉 3 取0.5ml處理好的禽流感病毒液注入細(xì)胞瓶內(nèi)，使病毒液充分鋪滿瓶底,