病毒的分離鑒定

1、病毒的分離與鑒定要證明某種疾病是由某一感染性病毒所引起，則必須滿足以下原則：從患病者體內(nèi)分離出病毒；在實驗動物或寄主細胞中可以培養(yǎng)；證明這種培養(yǎng)物具有濾過性；在原始宿主或相關種屬內(nèi)能產(chǎn)生同樣的病癥；能重新分離出病毒。1. 病毒的分離1.1 標本的處理1.1.1標本的收集a) 糞便標本：將5g糞便標本和50ml PBS放入盛有20-25顆玻璃小珠的100ml無菌瓶中，攪拌成懸液，倒出上清，3000g，4離心6min。b) 拭子和生物體液：拭子浸在2-3ml運載培養(yǎng)基中，將棉拭子中的液體盡量擠出以獲得標本，如果液體被污染，應3000g 4離心30min。c) 組織標本：用無菌乳缽或勻漿器研磨組織標

2、本，同時加入足量的PBS制備成20%的懸液，3000g 4離心30min。1.1.2 除菌處理a) 糞便可加青鏈霉素使最終濃度為10000單位/毫升，置4過夜。b) 鼻咽拭子一般加抗生素最終濃度為2000單位/毫升，置4作用4小時。c) 對乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、腸道病毒、呼腸孤病毒、腺病毒、痘病毒等，則可加入等量的乙醚4過夜除菌。1.2 病毒的分離培養(yǎng)病毒是嚴格的細胞內(nèi)寄生微生物，培養(yǎng)病毒必須使用細胞。根據(jù)病毒的不同選用敏感動物（動物接種）、雞胚（雞胚接種）或離體細胞進行分離培養(yǎng)（細胞培養(yǎng)）。1.2.1 雞胚接種a) 雞卵的選擇：一般都選新鮮、10天以內(nèi)的受精卵以保證規(guī)格質(zhì)量上的一致 。b

3、) 孵育：孵育時可將雞卵放入卵箱內(nèi)進行,氣室向上，孵育的最適溫度為38-39，相對濕度為4070，孵育8日后，雞卵應每天翻動12次，以幫助雞胚發(fā)育勻稱和防止雞胚膜粘連。c) 檢卵：雞卵孵育45天后，即可用檢卵器檢查雞胚發(fā)育情況（二天一次）。未受精雞卵：在檢卵器上僅見到模糊的陰影。活雞卵：雞胚發(fā)育4天后，在檢卵器上就可見到清晰的血管，雞卵內(nèi)有一小黑點（雞胚），有明顯的自然轉(zhuǎn)動。死胎：如果發(fā)現(xiàn)雞卵血管模糊、擴張、胚胎活動呆滯或不能自主地轉(zhuǎn)動，則可判斷胚胎頻死或已經(jīng)死亡，應將其挑撿出來。雞胚孵育完畢后，用鉛筆劃出氣室邊緣和胚胎的位置待用。d) 接種：圖2. 雞胚羊膜腔接種：用1214天雞胚，將檢材注

4、入羊膜腔，孵育后取羊水檢查。常用于流感病毒的初次分離。圖1. 雞胚卵黃囊接種：用58天雞胚，以細長針頭由雞卵氣室端刺入卵黃囊。孵育后取獲卵黃囊膜檢查。常用于某些嗜神經(jīng)病毒的分離。圖3. 尿囊腔接種 用912天雞胚，將標本接種于尿囊腔, 孵育后取尿囊液檢查, 常用于培養(yǎng)流感病毒和腮腺炎病毒等。圖4. 絨毛尿囊膜接種：用10l 2天雞胚，以無菌手續(xù)在蛋殼上開小窗，然后將材料滴在絨毛尿囊膜上孵育后。觀察膜上有無斑點病變。常用于培養(yǎng)單純皰疹病毒、天花病毒和痘病毒。e) 剖檢及收獲收獲前雞胚應置4冰箱過夜，使雞胚內(nèi)血液凝固。收獲時，用碘酒將氣室部卵殼消毒，將氣室處卵殼剝?nèi)ィú灰獙⑺槠淙霘つぃ?。然后用無

5、菌手術刀柄從胚胎背部輕輕下壓，（切勿壓破卵黃囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶內(nèi)，于低溫保存。f) 優(yōu)缺點優(yōu)點：技術簡單、來源充沛、價格低廉、數(shù)量可大、不需特殊設備。缺點：很多病毒不能適應，主要是哺乳動物的病毒。 1.2.2 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)(cell culture)是指利用機械、酶或化學方法使動物組織或傳代細胞分散成單個乃至24個細胞團懸液進行培養(yǎng)。根據(jù)細胞的類型和培養(yǎng)細胞代數(shù)的不同，可將其分為兩種：原代細胞培養(yǎng)；傳代細胞培養(yǎng)。組織細胞培養(yǎng)的病毒，當出現(xiàn)穩(wěn)定的細胞病變后，就可取培養(yǎng)液或培養(yǎng)液與細胞培養(yǎng)物混和物，細胞培養(yǎng)物中的病毒可采用凍融、超聲波等方法使其釋放出來。 優(yōu)點：a) 每個細胞

6、生理特性基本一致，對病毒易感性相等；b) 無個體差異，準確性和重復性好；c) 可嚴格執(zhí)行無菌操作；d) 細胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長特征；e) 應用空斑技術可進行病毒的克隆化。2. 病毒的鑒定2.1 形態(tài)學鑒定細胞病變效應（cytopathic effect，CPE）：病毒在細胞內(nèi)增殖后，可引起細胞的不同變化。常見的形態(tài)學改變?nèi)缂毎麍A縮、聚合、溶解或脫落。CPE出現(xiàn)的時間是鑒定病毒的標志之一。某些病毒感染細胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變化，在普通光學顯微鏡下可見胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小數(shù)量不等的圓形或不規(guī)則形的團塊狀結構，病毒學上稱為包涵體。2.2 血吸附和血凝作用多見于以出芽方

7、式釋放的病毒。血吸附指感染細胞具有吸附紅細胞的能力；血凝作用指感染細胞的培養(yǎng)液中有許多游離病毒存在，具有凝集紅細胞的作用。2.2.1 血吸附實驗具有血凝能力的病毒能使感染的細胞吸附紅細胞，這種現(xiàn)象被稱作吸附作用。大多數(shù)粘液病毒能引起吸附。具體檢驗步驟如下：a) 用PBS配制10%的豚鼠紅細胞懸液，4保存，用前按需要量稀釋成0.5%的濃度（10%懸液1ml加19ml PBS混勻）。b) 吸去對照和試驗管培養(yǎng)細胞的上清液，試驗管的上清液留待電鏡觀察。c) 每管加入0.2ml紅細胞懸液，4孵育30min。用4的PBS清洗培養(yǎng)細胞3次。d) 顯微鏡下讀取結果并記錄，根據(jù)吸附紅細胞的量可分為0（陰性）4

8、（完全吸附）級。e) 37孵育60min，有神經(jīng)氨酸酶的病毒將會從紅細胞上游離下來。2.2.2 血凝實驗a) 在血凝板第一排的112孔加入50l生理鹽水。b) 在第1孔中加入50l病毒，混勻后吸50l到第2孔，如此倍比稀釋直到第10孔，混勻后棄50l；最后兩孔（11、12）為紅細胞對照。c) 將1%的紅細胞輕輕搖動混勻，在112孔中每孔加入50l。d) 手工震蕩，37靜置30min（室溫40min）后觀察結果。2.3 電子顯微鏡檢查病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結構等必須借助電子顯微鏡進行檢查。對于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒，可直接從感染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細胞培養(yǎng)收獲的材

9、料作電子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子。2.3.1 正染法：超薄切片法取材固定（戊二醛/四氧化鋨）清洗與脫水浸透、包埋與聚合切片染色（鈾染/鉛染）a) 優(yōu)點：可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過程。b) 缺點：操作復雜，費時，但標本可長時間保存。2.3.2 負染技術負染是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強樣品外周的電子密度，使樣品顯示負的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。具體步驟（漂浮法）為：現(xiàn)將需負染的樣品滴幾滴在干凈的載玻片上，再將有支持膜的載網(wǎng)漂浮在樣品液滴上以沾取樣品，用濾紙吸干樣品余液使樣品在載網(wǎng)上僅有一薄層液膜，在樣品未干時即加一滴復染液的銅網(wǎng)上，用濾紙吸干多余的染液即可。a) 優(yōu)點：快速簡易（10-20min）；分辨率高；圖象清晰地病毒結構。b) 缺點：敏感性低，要求病毒量在107以上；所有樣品應處于懸浮狀態(tài)。2.4 血清學試驗可采用ELISA、瓊脂擴散、中和試驗、標記抗體技術等免疫血清學方法檢查病畜的抗體消長情況和發(fā)病組織中的病毒抗原。2.4.1 中和反應利用病毒與特異性中和抗體結合的特性鑒定病毒的種類，觀察特異性抗體能否保護易感的試驗動物死亡，能否抑制病毒的細胞病變效應。2.4.2