第07講-基于受體的藥物設計.ppt

1、藥 物 設 計 學,王遠強,1,2,思考題,簡述分子對接方法的原理及主要應用； 全新藥物設計的基本步驟包括哪些？,3,第四節(jié) 基于受體的藥物設計方法之一 -分子對接 (Molecular Docking),4,基于受體結構的藥物設計直接法,給定一個藥物受體或受體的結合位點 找出能夠與位點結合改變受體作用的化合物,全新藥物設計的基本流程,5,6,基于受體結構的藥物設計思路流程圖,對接,所謂分子對接主要研究分子間（即配體和受體）相互作用，預測并計算結合模式和親和力的一種理論模擬方法。分子對接就是受體和底物之間通過能量匹配和幾何匹配而互相識別的過程。 分子對接是一種廣泛應用的研究分子間相互作用的分子

2、模擬方法，其本質是找到已知結構的分子之間合理的結合構象，其過程涉及分子之間的空間匹配和能量匹配。 分子對接方法已經有幾十年歷史，利用分子對接方法研究蛋白-配體作用模式在基于結構的藥物設計中應用非常廣泛，主要應用于全新藥物設計、虛擬篩選、虛擬組合庫設計等。,分子對接方法的基本原理,分子對接中兩大關鍵問題是分子間的空間匹配和能量匹配。 (1) 空間匹配是分子間發(fā)生相互作用的基礎，進行分子對接計算時，首先在受體的表面凹槽產生一系列假定的結合位點，將配體分子放入該位點中，如果兩者之間滿足分子的空間匹配原則，則可以結合；如果不能滿足則選擇其他位點進行結合。 (2) 能量匹配是分子間保持穩(wěn)定結合的基礎。當

3、配體分子進入結合位點時，通過一定的程序計算它們之間的可能的結合模式和結合能，并對結果進行評價，通過打分函數(shù)評判配體受體的結合程度。,9,分子對接的最初思想起源于19世紀Fisher 提出的受體學說，F(xiàn)isher認為，藥物與體內的蛋白質大分子即受體會發(fā)生類似鑰匙與鎖的識別關系，稱為“鎖鑰模型”，這種識別關系主要依賴兩者的空間匹配。即受體與配體的相互識別首要條件是空間結構的匹配。,配體 受體 復合物,受體配體的鎖和鑰匙模型,10,隨著受體學說的發(fā)展，人們對生理活性分子與生物分子的相互作用有了更加深刻的認識，從基于空間匹配的剛性模型逐漸發(fā)展成為基于空間匹配和能量匹配的柔性模型。,11,藥物與受體的結

4、合強度取決于結合的自由能變化,G結合 = H結合 - T S結合 = -RT ln Ki,大部分的分子對接法忽略了全部的熵效應，而在焓效應也只考慮配體與受體的相互作用能，即：,Einteraction= Evdw + Eelectrostatic + Eh-bond,12,分子對接方法的分類,分子對接方法根據(jù)不同的簡化程度大致可以分為三類： （1）剛性對接 在對接過程中研究體系的構象不發(fā)生變化； （2）半柔性對接 在對接過程中考慮配體的柔性； （3）柔性對接 既考慮配體結構的柔性又考慮受體的柔性。,13,（一） 剛性的分子對接方法,這種方法是最初的分子對接的方法，在對接中，小分子和蛋白質兩種都

5、保持剛性。,基于最大團搜索的方法 （Clique-Search Based Approaches）,對接兩個剛性分子可以理解為分子在空間的匹配問題，這種匹配可以是一種形狀上的互補或相互作用，如氫鍵受體與氫鍵給體的互補。搜索在三維空間中有效的條件下的最大匹配。,14,受體的活性位點,配體,有效匹配的距離圖集,受體配體的示意圖，字母代表特征部分如氫鍵等，相應的有效匹配的圖集如右，三個環(huán)形頂點組織的三角形為這個圖集的一個最大團(clique),15,Dock對接程序中剛性對接的算法就是基于這種思想,Dock利用球集來表示受體活性位點和配體的形狀,16,一系列的球集填充在受體活性位點的表面，這些球集代

6、表能被配體占據(jù)的體積。配體可以用球集表示或者用自己的原子表示，在Dock程序中，四個有效匹配的對應點被考慮，先考慮配體中第一個球集與活性位點的球集的匹配，第二個點則滿足d ，其中d為第二個匹配點中配體和受體的球心與第一個點球心的距離，第三個點又必需滿足與前兩個球心的距離限制，以上過程一直進行到找不到更多匹配點為止。,17,（2）基于pose clustering的方法,這種方法是一種基于模式識別的方法。,在LUDI模型中，如圖所示，對每一個作用基團，定義作用中心和作用表面。受體的作用表面近似地用離散的點表示，和對應的配體的中心目標點相匹配。,三個氫鍵受體的作用表面,Pose clusterin

7、g 算法中的作用點,18,（二）柔性對接中的構象產生方法,（1）構象的系綜方法,Flexibase用來儲存小分子庫中每個分子的一系列不同構象，用距離幾何和能量最小化的方法產生構象，每個分子根據(jù)rmsd的差異選擇25個系列構象。,19,（2）片段的方法,片段的方法是處理小分子柔性的最通用的方法，配體分割成一些小的片斷，這些片斷可以認為是剛性構象或一個小的構象系綜。一般，有兩種方法來處理: 第一種方法是把一個片段放入受體的作用位點，然后加上余下的片段，這種方法稱為連續(xù)構建 “incremental construction”. 第二種方法把所有或一部分片段獨立地放入受體的作用位點，再重新連接至構成

8、一個完整的配體分子，這種策略稱為“放置&加” “place & join” 。,FlexX,Dock程序,第一個連續(xù)構建的算法是Kuntz發(fā)展的Dock程序。 首先，一個單獨的錨碎片通過手工選擇對接進受體的活性結合位點，并且考慮了氫鍵的作用。這個錨的優(yōu)勢位置主要包含有大量匹配氫鍵對、高打分值和低相似性。 接著，在當前錨位置加上一個碎片后，優(yōu)化的方法用來減少立體的張力和改善氫鍵的幾何構型。用回溯算法（backtracking algorithm）來搜索整個配體在結合位點的非重疊放置空間。 最后的位置通過過濾，優(yōu)化和基于力場的方法來打分評價。 FlexX也是一個基于連續(xù)構建算法的對接程序 。,21

9、,（3） 遺傳算法,遺傳算法開始應用到分子對接技術中：,第一步，找出一個稱為染色體的線性表示符，描述構型的所有自由度，找到這個染色體描述符是算法中最困難的一步。 第二步，確定一個一個類似如打分函數(shù)的目標函數(shù)。,著名的GOLD，Autodock軟件包括了這種算法。,22,（4）基于分子模擬的方法,模擬退火的方法，Autodock程序包含了這種方法,分子動力學的方法,Monte Carlo模擬 分子動力學模擬,23,評價：打分函數(shù),每一個對接的算法都會采用平衡了時效和精確度的簡單自由能預測方法，現(xiàn)在的打分函數(shù)主要包括三種：基于分子力場的方法、基于經驗的回歸參數(shù)的方法、基于知識的打分函數(shù) 。,24,

10、（1）基于力場的方法,只考慮熱焓對能量的貢獻，不考慮熵的影響，一般情況下，采用標準力場的非鍵作用能如真空靜電和范德華作用能作為打分函數(shù)，如DOCK程序中采用AMBER的能量函數(shù)：,25,（2） 基于經驗的打分函數(shù),基于經驗的打分函數(shù)用多元回歸的方法擬合各種物理參數(shù)對結合自由能的貢獻，如FlexX程序中采用這種函數(shù)。所采用的方程包括，配體旋轉鍵的個數(shù)、氫鍵、離子鍵、疏水和芳香環(huán)的堆積作用以及親水作用。這種方法能快速直接地估算結合自由能。,26,（3）基于知識的打分函數(shù) 采用統(tǒng)計的方法，通過考察原子與原子之間相互接觸的頻率或距離來推測基團相互作用的有利或者不利。 最初應用于蛋白質結構預測，在對接中

11、，打分函數(shù)用統(tǒng)計力學的方法得到蛋白質配體的復合物結構，用分子間距離的平均能的加和為函數(shù)來計算結合自由能。 基于知識的打分函數(shù)是一種比較有前途的方法。,27,對接軟件,文獻報道過的或者沒報道過的分子對接軟件有很多，很多最初都是由實驗室開發(fā)，免費發(fā)布。當軟件很完善，沒有什么缺陷時，可能會被專門的商業(yè)軟件公司購買，就變成了某個大型軟件包中的模塊。 其實不止分子對接軟件，其他還有藥效團軟件、定量構效關系軟件、數(shù)據(jù)庫篩選軟件等，都是這樣的發(fā)展歷程。不過，其中還是有一些實驗室，在商品化大潮的影響下屹立不倒，依舊免費給我們提供免費的強大的軟件，甚至是源代碼（source code）。,28,1、AutoDo

12、ck 據(jù)官方數(shù)據(jù)顯示，autodock是引用文獻最多的軟件（Sousa, Fernandes & Ramos (2006) Protein-Ligand Docking: Current Status and Future Challenges Proteins, 65:15-26）。 AutoDock向外提供源代碼，只要下載協(xié)議單（license agreement），簽名后傳真發(fā)回，就可以獲得下載鏈接和帳號信息。目前最新版本是4.2，速度很。單個CPU一天可以做40,000個剛性對接?？梢钥紤]蛋白質側鏈的柔性。 官方主頁：/,2、DOCK

13、。 DOCK也是以源代碼發(fā)布，對學術用戶免費?？梢韵蚬俜桨l(fā)郵件申請，他們會返回一個下載鏈接和帳號，可以使用5次。 官方主頁：/ 3、3D-DOCK。 免費以源代碼發(fā)布，分為三個部分：FTDock, RPScore，MultiDock。 官方主頁：http:/www.bmm.icnet.uk/docking/,29,4、FRED 是Openeye軟件包中的一個模塊。Openeye軟件包對學術用戶免費1年，普通用戶可以申請2個月的試用期。只要在線申請就可以，不需要下載申請表打印簽字發(fā)傳真。不過FRED速度超快，在各種平臺都可運行。Openeye軟件包中除了分子對接

14、軟件，還有數(shù)據(jù)庫篩選軟件，分子格式轉化軟件（Babel），圖形可視化軟件（Vida），溶劑化工具等。 申請試用版： 5、Surflex，Surflex對學術用戶免費，最初國內的同行都說這個軟件最難申請，沒有申請成功的。,30,6、FlexX是另一個運算速度超快的分子對接軟件，收費。不過可以申請6周的試用版，速度很快。有獨立運行版本，也有Sybyl軟件包(Tripos Co. Ltd.)中的一個模塊。 官方主頁：www.biosolveit.de/FlexX/ 7、Glide。收費軟件，是Maestro軟件包中的一個模塊。運算速度也很快。 8、GOLD。收費軟件，精度很好。以前可以申請2個月的試

15、用版。 9、ICM。ICM-pro是很大型的軟件包，收費，功能很強大，據(jù)說精度也很高。不過ICM-Browser是免費的，可以下載。下載鏈接 官方主頁：,31,10、MVD。是最新出的軟件，據(jù)官方數(shù)據(jù)表明是對接精度最好的軟件，甚至要超過了Glide、Surflex、FlexX等軟件。提供一個月的試用期。不過運行速度很慢，按默認設置，對接一個分子需要10分鐘。 從這里申請下載（在線申請，不需要下載表格打印簽名發(fā)傳真）： 官方主頁,32,33,名稱 構象搜索方法 結合評價方法 速度 Flex X (Sybyl)片段生長法 半經驗自由能快 LigandFit(Cerius2)蒙地卡羅模擬 半經驗自由

16、能快 Glide (薛定諤軟件)系統(tǒng)搜索 半經驗自由能一般 Gold 遺傳算法 半經驗自由能快 Affinity（InsightII) 蒙地卡羅/MM/MD 分子力場 慢 AutoDock 遺傳算法 半經驗自由能一般 Dock 片段生長法 分子力場 快 ICM-Dock 隨機全局優(yōu)化 半經驗自由能快 Fred (openeye)系統(tǒng)搜索 半經驗自由能快,34,對接方法的應用,估算配體和受體之間的結合能力 虛擬篩選 先導化合物的優(yōu)化 組合庫設計 全新藥物設計 預測蛋白配體復合物 理解配體和受體的結合模式,35,分子對接計算的注意點,小分子問題 起始構象對對接結果有一定影響 對接時應以代謝物的結構

17、進行 對分子進行加電荷和加氫處理 蛋白質問題 如何選擇合理的蛋白質活性位點 對接問題 搜索結合模式的正確性、對接的效率、評分的正確性 采用多個軟件進行評價，減少結合模式搜索誤差 定量指標，需要結合分子動力學進一步評價,分子對接用于虛擬篩選的具體流程,第一步，受體模型的建立：,蛋白質結構的準備是虛擬篩選的重要一步。虛擬篩選的蛋白靶標的結構可以從PDB庫中直接下載使用：/pdb/index.html,也可以通過和家族中同源蛋白的序列、結構信息比較，同源模建而得。,1）大分子結構獲取,虛擬篩選的實現(xiàn)步驟,2）接著是結合位點的描述，選擇合適的配體結合口袋對分子對接至

18、關重要,一種是直接從配體受體復合物結構中抽出；,選擇口袋有兩種方式：,如果沒有復合物結構，則需要根據(jù)生物功能如結合、突變等實驗信息來手動選擇結合部位。,第二步，建立小分子數(shù)據(jù)庫,二維結構用結構轉換程序如CORINA、CONCORD實現(xiàn)三維結構的轉化。,建好的三維結構加氫加電荷后，便可以用于對接程序。,第三步，對接和打分，這一步是虛擬篩選的核心步驟。,對接操作就是把每個小分子放到受體蛋白的配體結合位點，優(yōu)化配體構像和位置，使之與受體有最佳的結合作用，給最佳結合構象打分，對所有化合物根據(jù)打分排序，然后從化合物庫中挑出打分最高的小分子。,第四步 命中化合物的后處理,通過計算分子的類藥性質ADME/T

19、 (吸收absorption、器官分布distribution、體內代謝metabolism、排泄excretion 和毒性toxicity)性質的估算，排除那些不具有類藥性質的分子。,可以利用一些經驗規(guī)則如“五規(guī)則” 等，快速排除那些不適合進一步藥物開發(fā)的分子。,通過以上四步處理，大部分分子從化合物庫中剔除，形成一個合理大小的化合物庫，僅對這些適合成藥的化合物或購買、或合成、或分離得到，然后再進行實際的生物測試。,43,（一） 配體對CDK2，CDK4激酶選擇性的研究,細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases, CDKs）是一類Ser/Thr 蛋白激酶，直

20、接參與調控細胞分裂周期，顧名思義，CDK只在周期蛋白Cyclin活化下才能工作. 現(xiàn)在已經發(fā)現(xiàn)了13種CDK蛋白激酶和25種周期蛋白Cyclin，但它們具體的生物功能還不十分明了。其中CDK2、CDK5、CDK6已經解析出晶體結構，但CDKs的一級序列存在高的同源性，它們之間一級序列的高同源性暗示了三維結構的相似性。,CDK1、CDK2、CDK4、CDK6是基于CDKs結構化學治療癌癥的主要靶標。至今為止，文獻報告的CDKs抑制劑有多種 。,44,NU6102 (6-cyclohexylmethyl-2-(4-sulfamoylanilino) purine)是第一個基于活化狀態(tài)的CDK2-c

21、yclin A復合物結構的高效的小分子抑制劑。實驗表明NU6102對CDK2和CDK4有著不同的選擇活性，對CDK2有一個較高的親和力Ki= 6nM，但是對CDK4的親和力比較低Ki = 1600nM，為了解釋這種選擇性差異的起源。,小分子NU6102的結構,CDK2NU6102的作用模式圖,45,解決思路：,采用同源模建、分子對接、分子動力學模擬和自由能計算來闡明配體和激酶的作用機理。,由于CDK4的三維結構還沒有解析出來，所以我們通過序列聯(lián)配、同源模建的方法得到CDK4的結構，在通過分子對接的方法得到NU6102CDK4的復合物結構。,46,CDK2和CDK4的序列聯(lián)配，序列同源性45.6

22、%,47,通過分子對接得到CDK4NU6102的作用模式,通過CDK4NU6102復合物和CDK2NU6102復合物結構對比，可以很清楚地看到造成NU6102親和力差別的主要原因是在CDK2NU6102復合物中，Asp86位起了一個很重要的識別作用，它與配體的磺胺基形成了兩個穩(wěn)定的氫鍵，并且通過能量分解的方法也可以得到導致配體活性差異主要識別基團在磺胺基,48,第五節(jié) 基于受體的藥物設計方法之二 -全新藥物設計,全新藥物設計（de novo drug design）就是根據(jù)靶標分子結合位點的幾何特征和化學性質，設計出與其相匹配的具有全新結構的化合物。,49,全新藥物設計的一般過程,50,具體步

23、驟：,（一） 確定活性位點 根據(jù)靶標的三維結構以及受體配體的作用特征，合理定義受體活性結合位點的結構和化學特征，如疏水場分布、氫鍵作用位點、靜電場分布、立體結構等特征，這些特征除了從受體的結構或生化實驗中得到外，也可以用一些計算的方法得到如COMFA模型、藥效團模型、分子對接模型等等。 如果只知道靶點的三維結構，而不知道配體與靶點作用的結合位點，可根據(jù)靶點蛋白的互補與小分子配體的互補原則確定結合位點。常用的是活性位點分析法（active site analysis, ASA）。,51,活性位點分析法（active site analysis, ASA）,ASA方法主要預測與生物大分子有較好結合

24、的原子或基團，用來分析的探針分子可能是一些簡單的分子或碎片，例如水或苯環(huán)，結果可找到這些分子或碎片在活性部位中的可能結合位置。這一方法在全新藥物設計方法中十分重要，并且是一個成功的全新藥物設計的重要組成部分。,52,如圖 顯示了怎樣將一些典型分子碎片放置在受體活性部位中的合適位置上。,53,評價選擇的碎片和靶標蛋白活性位點結合好壞的方法有好幾種： 基于能量計算的方法，用分子力場的方法，計算碎片與受體大分子的作用能，這種方法計算量大，計算依賴于力場參數(shù)，并且在能量計算中，溶劑的作用十分重要。,現(xiàn)在發(fā)展了一些經驗計算方法來克服這些缺點，這些經驗參數(shù)是建立在大量實驗數(shù)據(jù)的基礎上，雖然其物理意義不是十

25、分明確，但比較實用，并且計算速度比能量計算方法快。,54,基于ASA方法有關的軟件：Grid,Grid，是Goodford等發(fā)展的評價小的有機分子片段和受體相互作用的方法。 其基本的原理將受體生物大分子的活性部位劃分為有規(guī)則的網(wǎng)格點，將探針分子放置在這些網(wǎng)格點上，用分子力場的方法計算網(wǎng)格點上各種探針分子與受體活性位點原子的相互作用能，得出一系列能量值，負的能量值代表探針與蛋白分子間的作用區(qū)域。根據(jù)探針的不同，可確定作用屬于哪一類型。,55,ASA方法能獲得不同碎片與受體結合的最佳位置，并且通過能量評價可以發(fā)現(xiàn)不同碎片與受體結合的取向，為以后的配體分子的產生打下了基礎，再者運用不同的碎片作為探針

26、，大大擴大了分子設計的范圍，可以提供多個候選分子參考合成。,優(yōu)點：,56,（二） 產生合適的配體分子,根據(jù)活性位點的特征，產生相應的相匹配的配體小分子片段，用連接基團將小分子片段連接成完整的分子。,（1）自動模板定位法Automated molecular template-directed drug design,模板定位法是指在受體活性部位用模板構建出一個形狀互補的圖形骨架，然后再根據(jù)其他性質如靜電、疏水和氫鍵性質，把骨架圖形轉化為一個具體分子。,a. 建立模版庫 模板庫為三維圖形，其頂點表示原子，邊表示鍵。模板可分為環(huán)狀模板和非環(huán)狀模板。 b. 放置一個模版 首先選擇一個合適形狀的模板，

27、將模板的頂點置于靶點中心，模板圍繞頂點旋轉而選擇合適位置。 c. 模版連接 在初始模板的基礎上，加入新的模板來構建骨架，骨架朝剩余靶點的位置生長。得到滿足所有立體條件的空間骨架，裁去與靶點發(fā)生碰撞的部分， d. 新化合物生成 用適當?shù)脑雍突瘜W鍵取代模板中的頂點和邊，以產生所需要的靜電、疏水和氫鍵相互作用。,自動模板法步驟,60,（2）原子生長法（atombuild）,原子生長法是指在受體活性部位根據(jù)靜電、疏水和氫鍵相互作用，逐個添加原子，最終生長出與受體活性部位性質、形狀互補的分子。 其初始結構可以是一個種子原子（受體上容易形成氫鍵的原子），也可以是一個初始基團。 生長方式可以是隨機生長和系

28、統(tǒng)生長。 隨機生長可根據(jù)結構和構象進行取樣，提高效率。系統(tǒng)生長則能產生所有可能的結構，但因此產生大量的結構，難以后期處理。,61,62,（3）碎片連接法（linked-fragment approach） 碎片連接法就是將與受體活性位點有較好作用的基團用連接基團連接起來，這一基本思想就是組成整個分子的各部分，它們本身能與受體有很好的結合，對整個分子與受體的結合都有貢獻。 首先要有儲存各種碎片的碎片庫和各種連接子的連接子庫。,63,這種方法可以很快地把位于活性口袋中的候選片段進行連接得到完整的配體分子，碎片與受體活性部位的結合方式可以用多種方法得到，碎片間的連接方式也有多種，同時也可以設計柔性骨架，考慮碎片和骨架的柔性。但設計的分子可能比較復雜，難以合成。代表軟件有HOOK，CAVEAT，SPLICE等。,64,（4）碎片生長法 (fragment build) 逐步生長法以一個片段為起點，逐步生長得到一個完整的配體分子的方法。 如果以不同的孤立片段做為起點，可以得到不同的配體分子，這種方法在生長的過程中，新加入的片段一般會進行構象分析來確定最佳構象，這樣很大程度上可以避免漏篩，但這種