單核苷酸多態(tài)性snp實驗_W

1、單核苷酸多態(tài)性（SNP）實驗SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即單核苷酸多態(tài)性，是由于單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態(tài)性(Polymorphism)。據(jù)估計，在人類基因組中，大約每千個堿基中有一個 SNP，無論是比較于度多態(tài)性(RFLP)分析還是微標記(STR)，都要廣泛得多。實驗方法原理：SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即單核苷酸多態(tài)性，是由于單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態(tài)性(Polymorphism)。據(jù)估計，在人類基因組中，大約每千個堿基中有一個 SNP，無論是比較于限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析還

2、是微標記(STR)，都要廣泛得多。SNP 是我們考察遺傳變異的最小單位,據(jù)估計，人類的所有群體中大約存在一千萬個SNP 位點。一般認為，相鄰的 SNPs 傾向于一起遺傳給后代。于是，我們把位于染色體上某一區(qū)域的一組相關聯(lián)的 SNP 等位位點稱作單體型（haplotype）。大多數(shù)染色體區(qū)域只有少數(shù)幾個常見的單體型（每個具有至少 5%的頻率），它們代表了一個群體中人與人之間的大部分多態(tài)性。一個染色體區(qū)域可以有很多 SNP 位點，但是我們一旦掌握了這個區(qū)域的單體型，就可以只使用少數(shù)幾個標簽 SNPs(tagSNP)來進行基因分型，獲取大部分的遺傳多態(tài)模式。實驗材料：組織樣品試劑、試劑盒：液氮、PB

3、S、GA 緩沖液、GB 緩沖液、蛋白酶K、無水乙醇、蛋白液、漂洗液等儀器、耗材：離心管、離心機、廢液收集管、吸附柱、水浴鍋、分光光度計、低溫冰箱等實驗步驟：一、DNA 抽提1.取新鮮肌肉組織約 100 mg，PBS 漂洗干凈，置于 1.5 ml 離心管中，加入液氮，迅速磨碎。2.加 200 l 緩沖液 GA，震蕩至徹底懸浮。加入 20 l 蛋白酶 K（20 mg/ml）溶液，混勻。3.加 220 l 緩沖液 GB，充分混勻，37消化過夜，溶液變清亮。加 220 l 無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。4.將上述一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB 中，（吸附柱放入廢液收集管中）1

4、2 000 rpm 離心 30 秒，棄掉廢液。5.加入 500 l 去蛋白液 GD（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。6.加入 700 l 漂洗液 GW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入 500 l 漂洗液 GW，12 000 rpm 離心 30 秒，棄掉廢液。將吸附柱CB 放回廢液收集管中，12 000 rpm 離心 2 分鐘，盡量除去漂洗液。7.將吸附柱 CB 轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，加入 100 l 洗脫緩沖液（洗脫緩沖液應在60-70水浴預熱），混勻，室溫放置 15 分鐘，12 000 r

5、pm 離心 30 秒。洗脫第二次，將洗脫緩沖液 50 l 加入吸附柱中，室溫放置 15 分鐘，12 000 rpm 離心 30 秒。8.采用 Beckman DU 640 spectrophotometer 檢測提取到的基因組 DNA 濃度，在OD260 處有顯著吸收峰。同時檢測純度，OD260/280 的值應為為 1.7-1.9。9.從原液中取出相應體積 DNA 溶液，稀釋致 50 ng/ul，原液置于-70保存，稀釋液置于-20保存。二、 PCR 擴增目的片段1.按相關的試劑說明在標準反應管中準備反應體系，典型的 PCR 反應體系如下（20 ul體系）：2.向左扳動儀器蓋子上的手柄，揭開儀

6、器蓋子，小心放置樣品管于儀器的相應樣品孔中，輕輕蓋上蓋子，將頂部的旋鈕慢慢旋緊，讓熱蓋緊密接觸樣品管，樣品放置完畢。三、 在 T1 型 PCR 儀上編輯一個程序1.按C programs進入編輯模式。要在主目錄中創(chuàng)建一個程序請按D enter。要進入一個子目錄，用鍵將光標向右移動，然后用鍵選擇一個子目錄。按D enter進入選擇的子目錄。2.輸入程序中要求的溫度：用D enter確認溫度。為其輸入時間，用小數(shù)點來間隔。順序為 h.m.s。用D enter確認時間設置，或者用光標鍵移動到下一個區(qū)域。表示循環(huán)的次數(shù)。設定循環(huán)值=總循環(huán)值-1，即，總循環(huán)數(shù)為 30 時應輸入“29”。用C pgm o

7、k來儲存一個完整的程序。程序數(shù)據(jù)永久的儲存在記憶中。四、運行程序按B start/stop選擇一個程序。用鍵選擇一個子目錄，或者用D enter進入主目錄。輸入您想要啟動的程序的號碼?；蛘?，按A list在該子目錄中的所有程序的列表中選擇一個程序。用鍵在列表中滾動選擇。用D enter確認用強光突出的程序。按D start啟動程序。五、控制測試過程運行過程中，按 A 按鈕，可以獲得程序剩余的時間信息。運行完成后，按 STOP 按鈕終止實驗，按 YES 確認終止。小心旋開熱蓋，按照放置樣品的操作順序，打開蓋子，取出實驗樣品，再蓋上蓋子，關閉電源，本次實驗結(jié)束。六、PCR 產(chǎn)物測序由專門負責測序的服務公司完成。七、數(shù)據(jù)分析少量可人工讀取，大量可軟件讀取。比對發(fā)現(xiàn)的 SNP 在基因組中的位置：重點是啟動子區(qū)、外顯子區(qū)域（包括編碼區(qū)的 cSNP 及 5及 3UTR）、剪切邊界等，子的改變是否導致氨基酸的改變：錯義突變、無義突變、終止突變。注意事項：1.為保證待測目的區(qū)域測序真實可靠，引物設計應該使待測目的區(qū)域邊界距離上下游引物至少各 50 bp；2.引物設計建議使用在線方式，以保證成功率；3.為保證測序敏感性，PCR 產(chǎn)物片段大小應在 250 bp650 bp 范圍；4.為方便實驗，建議引物合成時分裝成 1