生物芯片的研究與開發(fā)

1、生物芯片的研究與開發(fā)1. 分子印章法 DNA芯片原位合成技術(shù) :結(jié)合組合化學(xué)合成與軟光刻微印刷技術(shù)的原理，采用成熟的寡核苷酸固相合成工藝，在預(yù)先制作的彈性印章上實現(xiàn)空間尋址的核酸原位合成：將不同的寡核苷酸（或多肽）合成試劑涂抹在凹凸不平的印章表面并將其壓印到基片特定位點進而進行偶聯(lián)固定。開發(fā)出高密度基因芯片設(shè)計軟件，并成功制備位點尺寸為 30微米的高寬比（大于 25）分子印章；建立了一套用于高密度基因芯片制備裝置， 并成功將軟光刻原位合成應(yīng)用到 DNA芯片和肽核酸芯片的制備中。合2成偶聯(lián)效率大于97%，25個堿基的寡核苷酸正確率大于 70%。制備出 65536/cm陣列的寡核酸芯片，雜交結(jié)果表

2、明該芯片能夠有效區(qū)分單堿基錯配序列。獲得美國專利項，中國專利 2 項，并有 5 項中國專利處于二審中。在 Laingmur，中國科學(xué)等雜志上發(fā)表論文 16篇。該技術(shù)已通過江蘇省科學(xué)技術(shù)廳鑒定。如能建立分子印章法批量化生產(chǎn)的寡核苷酸微陣列芯片的原位合成試生產(chǎn)線，制備出高質(zhì)量、標準化、低成本的寡核苷酸微陣列芯片來檢測與分析基因表達譜、圖 1 基于軟光刻技術(shù)的高密度基因芯片制備裝置。自行研制的用于高密度基因芯片制備的實驗裝置（左圖） ；表面親水處理的 PDMS分子印章的電鏡照片和全貌圖（右圖）基因突變體、免疫反應(yīng)、受體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、藥物分子等非核酸類的分子識別 / 結(jié)合領(lǐng)域， 其應(yīng)用將遍及生物、

3、 醫(yī)學(xué)的各領(lǐng)域， 如基因組研究、 SNP檢測、STR檢測、腫瘤研究、藥理學(xué)研究、藥物靶標研究、藥物毒性研究、病原體研究、醫(yī)學(xué)診斷、病理學(xué)組織研究、微生物與發(fā)酵研究等該芯片技術(shù)獲得了中國發(fā)明專利和美國專利，并被Nature Biotechnology推薦。2. 管蓋基因芯片及其檢測系統(tǒng) ：管蓋基因芯片是將基因探針固定在特制的管蓋內(nèi)表面，與內(nèi)置雜交貯液池的Eppendorf 管一起構(gòu)建的基因檢測器件。在一個全封閉的管內(nèi)，完成基因擴增，1 / 7熒光標記，芯片雜交及檢等一系列生物化學(xué)操作，實現(xiàn)多基因高通量并行檢測。用于管蓋基因芯片的檢測分析系統(tǒng)， 它包括光學(xué)檢測平臺、 圖像采集系統(tǒng)、 圖像分析系統(tǒng)及

4、結(jié)果報告系統(tǒng)。 光學(xué)檢測平臺利用尼康顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)， 通過電荷耦合器件 (CCD)的進行圖像采集。 管蓋基因芯片雜交后， 經(jīng)過熒光信號被 CCD捕獲，經(jīng)通用串行總線（ USB）傳遞給計算機。圖像經(jīng)過旋轉(zhuǎn)、去噪聲點、圖像分色、圖 2. 左圖及中圖為管蓋芯片實物，右圖為用熒光顯微鏡檢測的針對多種呼吸道病毒檢測的雜交結(jié)果。雜交信號判定、有效性判定及結(jié)果輸出。我們運用該系統(tǒng)，對于呼吸道十種病毒進行同時檢測。實驗結(jié)果表明，該系統(tǒng)能夠準確檢測病毒的雜交信號并給出檢測結(jié)果。基于管蓋型基因芯片的呼吸道病毒檢測芯片成功地檢測了國家生物制品檢定所提供的SARS標準品，并在華大基因中心檢測了30 多個SARS樣本，

5、取得了滿意的結(jié)果。 該成果已通過了江蘇省科技廳組織的科研成果鑒定。圖 3 管蓋芯片檢測儀3. 病毒及微生物收集器及一體化檢測儀 ：病毒及微生物收集器是能夠?qū)諝庵械奈⒘炕瘜W(xué)物質(zhì)和病原體（包括病毒）2 / 7進行高效、快速富集和濃縮的新裝置。 利用病毒顆粒在粘性表面的黏附作用和容易洗脫的特點，基于鼻腔結(jié)構(gòu)和鼻黏膜機理的氣體吸附腔 , 通過抽氣泵，將空氣中的病毒顆粒吸入吸附腔，粘附在黏膜表面，然后用蠕動泵將洗脫液注入腔內(nèi)，通過超聲震蕩器， 將黏膜和病毒等一起洗脫， 儲于 2ml 的標準凍存管中。 收集管中的洗脫液可收集并集中檢測。 洗脫液中加入了病毒滅活劑， 保證儀器的安全使用。該裝置的采氣速率為

6、 3 升/ 分。采氣時間為 1、10 或 30 分鐘。病毒收集在小于0.5ml 的溶液中。通過分散在空氣中的滅活甲肝病毒和標記蛋白粉末試驗，病毒顆粒的收集效率在 90%以上。經(jīng)檢索，在國際上尚沒有有效收集和檢測病毒的裝置?；谠摮晒膰鴥?nèi)發(fā)明專利已批準， 并已申報美國專利。 目前，該儀器把收集和毛細管檢測相集成， 開發(fā)出可以對各種場所里空氣中微小物質(zhì)進行收集、 濃縮并可進行 有針 對性 的實時 檢 測 。 該 系統(tǒng)已獲 2004 年 國家重 點新產(chǎn)品編號2004ED105009。病毒和微生物收集檢測器， 可用于空氣傳播的病原學(xué)研究、 空氣消毒劑效果研究、 疫點空氣消毒效果評價、 流行期疫點空氣

7、監(jiān)測和環(huán)境中微生物污染的監(jiān)測， 對控制疾病的流行具有重要意義 . 適用于大專院校、 研究機構(gòu)、醫(yī)院、疾病預(yù)防和控制中心及環(huán)境監(jiān)測單位， 以及人口密集的地方空氣中病原體以及其它生物物質(zhì)的檢測，防止生物恐怖等領(lǐng)域，具有較大的應(yīng)用市場。3 / 74. 基于抗體微陣列的細胞免疫芯片及其一體化檢測儀：該技術(shù)通過把細胞表面抗體制備成微陣列芯片，利用細胞表面所含有的抗原和對應(yīng)的抗體之間的特異性反應(yīng)， 捕獲相關(guān)的細胞，檢測細胞表面的抗原組合 35。該芯片可以高通量檢測組織、 體液中特定細胞的表面抗原譜的特點。 我們研制的細胞免疫芯片一體化檢測儀， 由恒溫孵育部分、 清洗部分和檢測部分組成， 可以將樣本與芯片的

8、孵育、清洗、檢測、結(jié)果輸出等自動完成，提高檢測結(jié)果的準確率。該檢測儀可以用于進行疾病的診斷、 預(yù)后效果判斷、環(huán)境質(zhì)量的監(jiān)測等方面。研制了白血病的免疫分型芯片，有助于臨床分型、判斷預(yù)后、指導(dǎo)治療。目前免疫分型是白血病臨床治療及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的一個重要手段。 白血病的免疫分型現(xiàn)在仍以流式細胞術(shù)（ FCM）方法為主，目前一次最多能檢測到6 種抗原。我們研制的細胞免疫芯片檢測技術(shù)， 一次可以檢測數(shù)十種細胞表面抗原， 而且無需標記。圖 6 細胞芯片檢測儀5. 基于凝膠基因芯片的 SNP檢測平臺：將丙稀酰胺修飾的核酸與丙稀酰胺單體、 過硫酸胺等混合后點樣于丙稀酰胺修飾的玻片上， 然后置于真空， 在引發(fā)劑汽化

9、的氛圍下促其發(fā)生聚合反應(yīng)形成凝膠并固定于玻片上。 通過該方法， 不僅可以固定合成的、 修飾有丙稀酰胺的寡核苷酸及其類似物， 還可以固定修飾了丙稀酰胺的 PCR產(chǎn)物。這種在凝膠內(nèi)三維的固定量比平面的固定量成指數(shù)級的提高。 雜交后，用電泳替代傳統(tǒng)的清洗方法 , 可以更好地提高信噪比和有效地區(qū)分完全匹配的序列和錯配的序列。以上方法我們用于疾病相關(guān)的功能 SNP的檢測上，由于凝膠的固定量大 , 可通過多重 PCR 一次固定多個位點的 PCR產(chǎn)物。每一位點用一對分別標記 Cy3和 Cy5的寡核苷酸探針與芯片雜交，用電泳方法區(qū)分單堿基錯配，通過掃描結(jié)果呈現(xiàn)的、黃、綠三種顏色很容易將每一位點的 SNP分型

10、, 使得 SNP的檢測更加真實可靠、簡便、低廉。隨著人類基因組計劃測序任務(wù)的完成， SNP的研究成為后基因組計劃中重要的組4 / 7成部分，特別是與人類的生命代謝、疾病相關(guān)的 SNP，國內(nèi)外眾多的研究所、醫(yī)學(xué)院，乃至大的制藥企業(yè)都投入大量的財力、人力從事該領(lǐng)域的研究。我們的SNP檢測平臺由于可靠、簡便、低廉的優(yōu)勢，在眾多的 SNP檢測方法中更具競爭力。目前已經(jīng)為江蘇省人民醫(yī)院、 南京中大醫(yī)院、 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院等多家單位提供服務(wù)，均得到滿意的結(jié)果。6. 硅烷化寡核酸探針 :DNA的固定在傳感器、 DNA固相擴增（ PCR）、核酸鍵合、基因芯片及蛋白質(zhì)芯片等生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域中被廣泛使用。 因

11、此，合成短片段寡核酸的修飾具有廣泛的市場。 目前核酸的修飾主要采用進口的亞磷酸酰胺試劑， 按照普通DNA合成的方法固相合成。 該試劑我國目前尚不能生產(chǎn)， 需要進口，且價格昂貴；由于亞磷酸酰胺試劑的反應(yīng)活性高， 很容易與水等親核試劑發(fā)生反應(yīng)而失活， 在儲存、運輸和使用上十分不便， 試劑浪費嚴重。 硅烷化寡核酸探針是通過硅烷化試劑合成的修飾寡核酸， 其價格低廉。 硅烷化試劑是一種種類繁多、 相對活潑的化學(xué)試劑。例如氨基硅烷、巰基硅烷、丙烯酰胺基硅烷等等，其國產(chǎn)價格大多在50 元/500 毫升左右。硅烷化寡核酸探針具有傳統(tǒng)修飾寡核酸的性質(zhì)：產(chǎn)品為無色粉末，極易溶于水； 在 20下能穩(wěn)定一年； 產(chǎn)品在

12、碳酸鹽等緩沖溶液等中溶解點樣于醛基等修飾的玻璃載片上能得到有效的固定； 固定的核酸與能夠有效的與互補序列雜交。 該技術(shù)已獲 2005 年國家新產(chǎn)品編號 2005ED105019，核酸探針已廣泛 DNA芯片制備，固相 PCR以及各種檢測核酸， 蛋白質(zhì)分子的及傳感器的制備。隨著基因芯片技術(shù)的不斷成熟及其應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓廣， 核酸探針的市場需求量將進一步增加。 市場將涉及對疾病， 病原體以及其它生物物質(zhì)的診斷與檢測及分子生物學(xué)相關(guān)的大專院校、 研究機構(gòu)、 醫(yī)院、疾病預(yù)防和控制中心及環(huán)境監(jiān)測等單位，具有較大的市場。7. 基因甲基化定量檢測技術(shù)：本成果采用 Q-MSP結(jié)合 MSP及實定量 PCR技術(shù)，同

13、時具有 MSP的特異性和靈敏性以及實時 PCR的快速和抗污染等特性， 可對微量 DNA的甲基化進行精確定量分析。我們利用該技術(shù)對 30 例骨肉瘤組織及相應(yīng)的正常組織的 5 個基因進行定量甲基化分析。 結(jié)果說明， 異常甲基化水平與腫瘤的病理分期密切相關(guān)， 它可以5 / 7作為一個有用的分子標記來協(xié)助判斷腫瘤的發(fā)生程度及預(yù)后效果。 本研究的結(jié)果撰寫的文章已被美國癌癥協(xié)會主辦的權(quán)威雜志 CANCER接收。8.PCR共聚焦生物芯片掃描儀：本成果是將基因?qū)崟r定量擴增技術(shù)與基因芯片技術(shù)進行有機融合，將探針固定在芯片上，通過基因擴增的同時水解探針原理來實時監(jiān)測，實現(xiàn)基于基因芯片的基因定量檢測。該儀器設(shè)計了高

14、精度的溫度循環(huán)控制系統(tǒng)和基因芯片的熒光多次掃描技術(shù)為一體， 通過軟件的控制， 實現(xiàn)對基因芯片的在片擴增過程進行實時圖 7 PCR 共聚焦生物芯片掃描儀的監(jiān)測，計算出熒光的增減變化的標準曲線。通過待測基因與標準參照體系的對比，從標準曲線上查找實測樣品對應(yīng)的檢測探針的熒光強度變化過程確定待測樣品的相對基因含量。 該成果的多基因同時定量檢測能夠在醫(yī)學(xué)、食品及生物安全等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。9. 中藥材（石斛）鑒定特異性 gDNA探針的篩選與應(yīng)用本成果以名貴中藥材石斛為實驗材料， 探索了在全基因組內(nèi)篩選種特異性探針，并建立了多種特異性探針進行中藥鑒定的 gDNA芯片新方法，對石斛樣本進行了準確鑒定。本研究成果是將抑制性差減雜交與基于尼龍膜微陣列雜交相結(jié)合篩選種特異探針。即先用抑制性差減雜交獲得兩個品種之間的 gDNA差異片段，然后用這些 gDNA差異片段與由所有研究品種的 gDNA制備成的微陣列雜交篩選到某一個品種的特異性 gDNA片段。研究證明了建立的種特異性 gDNA探針的篩選方法是可行和高效的。該研究成果發(fā)表在核酸研究和生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法雜志上。用從 5 種石斛中篩選到的 14 個種質(zhì)特異性探針點樣制備成微陣6 / 7列成功地對 5 種常見的石斛品種其中包括 中國藥典收錄的 3 種石斛進行了鑒定。建立了 DNA微陣列鑒別不同的商品石斛