細(xì)胞生物學(xué)常用研究方法

1、Southern雜交: 是體外分析特異DNA序列的方法，操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。RNAi技術(shù): 是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域?？梢岳胹iRNA或siRNA表達(dá)

2、載體快速、經(jīng)濟(jì)、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達(dá)，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段。Southern雜交 一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。 掃描電鏡技術(shù)：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。細(xì)胞顯微分光光度計(jì)：用來描述薄膜、

3、涂層厚度超過1微米的物件的光學(xué)性能的顯微技術(shù)。免疫熒光技術(shù)：將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。電鏡超薄切片技術(shù)：超薄切片是為電鏡觀察提供極薄的切片樣品的專門技術(shù)。用當(dāng)代較好的超薄切片機(jī)，大多數(shù)生物材料，如果固定、包埋處理得合適，可以切成50-100微米的超薄切片。Northern印跡雜交（Northern blot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。放射自顯影技術(shù)：放射自顯影技術(shù)是利用放射性同位素的電離輻射對乳膠（含AgBr或AgCl）的感光作用

4、，對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究的一種細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。放射自顯影技術(shù)（radioautography；autoradiography）用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。其原理是將放射性同位素（如14C和3H）標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后，將標(biāo)本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時(shí)間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。核磁共振技術(shù)：可以直接研究溶液和活細(xì)胞中相對分子質(zhì)量較小(20，000 道爾頓以下)的蛋白質(zhì)、核酸以及其它分子的結(jié)構(gòu)， 而不損傷細(xì)胞。DNA序列分析：在獲得一個(gè)基因序列后，需要對其進(jìn)行

5、生物信息學(xué)分析，從中盡量發(fā)掘信息，從而指導(dǎo)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。通過染色體定位分析、內(nèi)含子外顯子分析、ORF分析、表達(dá)譜分析等，能夠闡明基因的基本信息。分子雜交技術(shù): 具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。（一）原位雜交（in situ hybridization）。用于檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是使用帶放射性的DNA探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。蛋白質(zhì)印跡法：即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種

6、實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。GFP（綠色熒光蛋白）的應(yīng)用：用于特定蛋白的標(biāo)記定位外，GFP亦大量用于各種細(xì)胞器的標(biāo)記如細(xì)胞骨架、質(zhì)膜、細(xì)胞核等等。Shi等人曾報(bào)道將GFP融合到大腸桿菌細(xì)胞膜表面用作標(biāo)記蛋白，這一技術(shù)將有助于提高多肽庫的篩選效率、疫苗的研制、構(gòu)建細(xì)胞生物傳感器用作環(huán)境檢測以及探測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等等。負(fù)染技術(shù): 用重金屬鹽(如磷鎢酸)對鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，

7、分辨力可達(dá)1.5nm左右。細(xì)胞融合技術(shù)：所謂細(xì)胞融合就是指在外力(誘導(dǎo)劑或促融劑)作用下,兩個(gè)或兩個(gè)以上的異源(種、屬間)細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸,從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象稱為細(xì)胞融合(cell fusion)或細(xì)胞雜交(cell hybridization)免疫共沉淀：用抗體將相應(yīng)特定分子沉淀的同時(shí)，與該分子特異性結(jié)合的其他分子也會被帶著一起沉淀出來的技術(shù)。這種技術(shù)常用于驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間相互特異性結(jié)合。常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。免疫電鏡技術(shù)：是利用電子顯微鏡在超微結(jié)構(gòu)水平上研究免疫反應(yīng)的一項(xiàng)的新技術(shù)。用電子致密物

8、質(zhì)如鐵蛋白等標(biāo)記抗體，然后讓其與含有相應(yīng)抗原的生物標(biāo)本反應(yīng)，從電鏡觀察可見電子致密物質(zhì)的所在位置，識別抗原、抗體反應(yīng)的部位。由于電子顯微鏡的分辨力很高，故可準(zhǔn)確地顯示抗原所在部位。該技術(shù)是一種在分子水平上的抗原定位法，實(shí)際上是將細(xì)胞水平的熒光抗體技術(shù)的原理應(yīng)用到分子水平上。此項(xiàng)技術(shù)在細(xì)胞抗原成分的定位、識別以及細(xì)胞形態(tài)和功能關(guān)系的研究上，已成為重要的方法。主要用于病毒、細(xì)菌等抗原定位、免疫性疾病的發(fā)病機(jī)理及超微結(jié)構(gòu)免疫細(xì)胞化學(xué)研究等。冰凍蝕刻 freeze-etching: 亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將

9、組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。BrdU incorporation：阿糖胞苷（Ara-C）對人肺腺癌細(xì)胞株A549的凋亡誘導(dǎo)作用及其機(jī)制。方法AraC體外作用于t549細(xì)胞，噻唑藍(lán)還原法（MTT法）檢測AraC對A549細(xì)胞增殖的抑制作用；Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化；單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)（comet assay）測定A549細(xì)胞DNA的損傷程度；以Western blotting進(jìn)一步證明A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)果Ara-C對A549細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用；觀察到特異性的凋亡小體；AraC導(dǎo)致A549細(xì)胞發(fā)生DNA鏈斷裂，并呈明顯劑量

10、依賴性增強(qiáng)：Western blotting顯示caspase8，9，3都不同程度被激活，多聚ADP核糖聚合酶（PARP）被剪切降解。結(jié)論揭示了AraC明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡；細(xì)胞凋亡通路不僅通過線粒體途徑，還通過膜受體途徑，兩條通路協(xié)同作用使凋亡信號增強(qiáng)；提示Ara-C對A549細(xì)胞有明顯的化療作用。不可能存在絕對的核蛋白啊，因?yàn)榈鞍缀铣墒窃诎麧{，所以核里面再怎么多，胞漿里總會有那么一點(diǎn)嘛。而且很多蛋白是一直在胞漿胞核之間穿梭，特別是信號通路中的很多蛋白，始終是在胞漿與胞核之間保持一個(gè)動態(tài)的平衡，不斷地在核與漿之間循環(huán)。這種動態(tài)的平衡其實(shí)也是生物體的精妙的調(diào)控機(jī)制。 采用干細(xì)胞治療有著多種

11、優(yōu)勢：低毒性（或無毒性），即使不完全了解疾病發(fā)病的確切機(jī)理治療也可達(dá)到較好的治療效果，自體干細(xì)胞移植可避免產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，對傳統(tǒng)治療方法療效較差的疾病多有驚人的效果。隨著胚胎干細(xì)胞和iPS細(xì)胞的研究，更可能從患者自身細(xì)胞開始獲得全能的干細(xì)胞，進(jìn)而分化為所需細(xì)胞甚至器官，完全和自身匹配沒有免疫排斥的細(xì)胞或器官移植已不再是夢，當(dāng)人體器官衰老的時(shí)候，將衰老器官用自身細(xì)胞培育出的相應(yīng)器官替代移植，人類將有可能延年益壽。iPS細(xì)胞是通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)（gene transfection）將某些轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入動物或入的體細(xì)胞，使體細(xì)胞直接重構(gòu)成為胚胎干細(xì)胞（embryonic stemcell,ESC）細(xì)胞

12、樣的多潛能細(xì)胞。配體與膜上受體結(jié)合后，網(wǎng)格蛋白聚集在膜下一側(cè)，逐漸形成50-100nm的質(zhì)膜凹陷，稱網(wǎng)格有被小窩，一種小分子GTP結(jié)合蛋白在深陷有被小窩的頸部裝備成環(huán)，dynamin蛋白水解與其結(jié)合的GTP引起頸部縊縮，最終脫離質(zhì)膜形成網(wǎng)格蛋白有被小泡。1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)選用放射性標(biāo)記的CDP膽堿，用放射自顯觀察，微管用羅丹明標(biāo)記的抗微管蛋白，用免疫熒光觀察，比較圖像是否有相關(guān)。2用羅丹明標(biāo)記微管蛋白連續(xù)注入培養(yǎng)細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察。3用oligo-dT對提取的RNA進(jìn)行親和層析，提取MRNA進(jìn)行southern雜交。4用熒光原位雜交確定。5用早熟染色體凝集實(shí)驗(yàn)，PCC。6掃描電鏡技術(shù)，概念你自己找。7用綠色熒光蛋白標(biāo)記CENP-E蛋白。8用BRdu incorporation培養(yǎng)，會引起DNA突變，對其進(jìn)行序列分析。9用RNA干擾技術(shù)，本質(zhì)是與mRNA結(jié)合阻止期翻譯。10，用熒光共振能量轉(zhuǎn)移或酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。杉醇還可抑制細(xì)胞在層粘連蛋白上的粘附作用。紫杉醇可使微管蛋白和組成微管的微管蛋白二聚體