PCR體系優(yōu)化入門篇

1、由于Taq DNA聚合酶是目前PCR反應(yīng)體系中應(yīng)用最廣泛的酶，因此此文主要討論使用該酶的PCR反應(yīng)體系。A 鎂離子濃度鎂離子是熱穩(wěn)定DNA聚合酶的輔因子，其濃度對PCR至關(guān)重要。模板DNA的濃度，鰲合物（如EDTA和檸檬酸鹽）、dNTP濃度和蛋白都會影響反應(yīng)體系中游離鎂離子的量。如果游離的鎂離子含量不夠，那么Taq DNA聚合酶則無法行使功能(figure1)。過多的游離鎂離子則會降低酶的保真度，可能會增加非特異性擴增。因此，研究者應(yīng)當根據(jù)實際的實驗結(jié)果來優(yōu)化每一反應(yīng)中鎂離子的濃度?？梢杂靡幌盗械逆V離子濃度梯度來驗證，鎂離子濃度范圍為14mM，每次增加或降低0.51 mM。擴增產(chǎn)量最高，非特異

2、性產(chǎn)物最低時的鎂離子濃度即為最優(yōu)。最優(yōu)鎂離子的濃度范圍跟DNA聚合酶的類型相關(guān)，例如，Pfu DNA 聚合酶似乎對鎂離子的依賴性更低，但其優(yōu)化范圍通常為26mM。許多DNA聚合酶產(chǎn)品提供Mg-free reaction buffer和單獨一管25mM MgCl2，這樣就可以自行調(diào)節(jié)Mg2+濃度，優(yōu)化反應(yīng)體系。MgCl2溶液在反復凍融后會出現(xiàn)濃度分層，為獲得均一的溶液，在配液的時候，要確保MgCl2溶液完全溶解并充分震蕩混勻。非常簡單的兩步，溶解和混勻，常常會造成實驗失敗。有些科學家傾向于使用包含MgCl2的buffer，MgCl2的終濃度為1.5mM。值得注意的是有文獻報道發(fā)現(xiàn)使用此類buff

3、er的結(jié)果并不穩(wěn)定，有時體系內(nèi)游離鎂離子的濃度會有0.6mM的變化，如果在90加熱10min，則結(jié)果趨于穩(wěn)定，因此作者假設(shè)反復凍融的buffer中MgCl2可能會有沉淀現(xiàn)象發(fā)生。Figure 1.鎂離子濃度對PCR擴增的影響。用不同濃度 Mg 2+測試，產(chǎn)物大小為1.8kb瓊脂糖凝膠電泳，EB染色泳道M為MAKER; Lane 1, 0mM Mg 2+ ; Lane 2, 0.5mM Mg 2+ ;Lane 3, 1mM Mg 2+ ; Lane 4, 1.5mM Mg 2+ ; Lane 5, 2mM Mg 2+ ; Lane6, 2.5mM Mg 2+ ; Lane 7, 3mM Mg 2

4、+ and Lane 8, 3.5mM Mg 2+B Buffer 緩沖液大多數(shù)Buffer里含有一種緩沖試劑，多數(shù)為基于Tris的緩試劑。此外還有鹽類，通常為KCL。緩沖試劑調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，pH值會影響DNA聚合酶的活性和保真度。與不添加KCL的比，適量的KCL能夠增加5060%DNA聚合酶的活性。一般來說，KCL濃度為 50mM。C 酶濃度我們推薦（promega的科研人員）在50微升體系中使用1-1.25units Taq DNA聚合酶。多數(shù)情況下，這些酶是過量的，再添加酶并不能顯著提高產(chǎn)物量。事實上，酶量不斷升高會增加Taq DNA聚合酶53外切酶活性，跑膠的時候會觀察到彌散的條

5、帶。想要準確吸取少量的含50%甘油的酶溶液是非常困難的，因此建議一次配置大量的預(yù)混液，這樣酶的加量便會很大，減少誤差。D PCR 引物設(shè)計引物決定擴增區(qū)域和擴增子的大小，引物長度一般在1530bp。理想狀態(tài)下的引物其GC含量應(yīng)該在4060%，避免在引物3端出現(xiàn)三個連續(xù)的G或C以減少非特異性結(jié)合。還要避免自身或者引物間互補，以降低引物二聚體。引物自身二級機構(gòu)干擾退火時引物與模板的結(jié)合。正反向兩條引物之間Tm值相差不超過5，以便兩條引物在同一退火溫度下?lián)碛邢嗨频臄U增效率?？梢栽谝锷咸砑悠渌猛镜男蛄?，比如在5端添加酶切位點序列，方便下一步的克隆，或者添加T7 RNA聚合酶啟動子，以便進行體外轉(zhuǎn)錄

6、。實際應(yīng)用中會發(fā)現(xiàn)不同軟件給出的Tm值不同，同一軟件不同參數(shù)得出的Tm值也不同。不必糾結(jié)于此，只需要使用同一個軟件統(tǒng)一參數(shù)去評估一個項目中所用的引物就好，Tm值只是一個相對的標準，不論哪種軟件只要你的所有引物都在一個標準體系內(nèi)評定，不會影響后續(xù)實驗的分析。就好比你帶兩塊表反而不知道具體時間，只需要有一個標準參考體系即可。E 模板質(zhì)量擴增依賴DNA模板的數(shù)量和質(zhì)量。核酸純化過程中經(jīng)常使用的試劑（鹽類、胍、蛋白酶、有機溶液和SDS）是潛在的DNA聚合酶抑制劑。例如0.01% SDS會導致90% Taq DNA聚合酶活性被抑制，而0.1% SDS則會抑制99.9%的Taq DNA聚合酶活性。其他PC

7、R抑制劑有苯酚、肝素、二甲苯藍、溴酚藍、植物多糖和多胺類物質(zhì)精胺和亞精胺。有些情況下，抑制劑并不是隨著核酸模板進入反應(yīng)體系內(nèi)的，例如紫外照射下的聚苯乙烯和聚丙烯會釋放抑制物，如果使用此類物質(zhì)作為反應(yīng)管，有可能干擾PCR。如果你覺得擴增失敗是由于模板溶液中存在抑制劑，那么向反應(yīng)液中再加入以前擴的很好的對照DNA模板和引物對，如果擴增效果變差，那可能就有干擾物質(zhì)，清理DNA模板，重點檢查苯酚、氯仿和乙醇等。F 模板量擴增所需的模板量依賴于DNA樣本的復雜性。例如，4kb的質(zhì)粒含1kb的目的序列，那么靶序列的含量就是25%。相反如果1kb的目的序列存在于人基因組中（3.3109bp），那么靶序列的含

8、量就是0.00003%。一般常犯的錯誤就是使用太多的質(zhì)粒DNA，太多的PCR產(chǎn)物或太少的基因組DNA作為模板。加太少模板擴增產(chǎn)物極少，而加太多模板則會造成非特異性擴增過多。在使用PCR產(chǎn)物作為模板的時候，應(yīng)當稀釋10至10000倍然后再進行PCR擴增。1g of human genomic DNA = 3.04 105 moleculesG 循環(huán)參數(shù)退火溫度和延伸時間是經(jīng)常需要改動的兩個參數(shù)。其他步驟的時長和溫度一般變化不大。但是在個別情況下，循環(huán)過程中的變性溫度會降低，時間會減少，以減低脫嘌呤作用（脫嘌呤作用可因此產(chǎn)物突變）。退火溫度一般設(shè)在引物Tm值5左右，使用比引物Tm值稍高的退火溫度可

9、以提高特異性，減少非特異擴增。但是較低的退火溫度會增加擴增產(chǎn)物的量，因為引物在較低溫度下更能有效退火。建議以低于引物5的Tm值為退火溫度，逐漸升高以找到最優(yōu)退火溫度。熱啟動酶在一定程度上能夠減少非特異擴增和引物二聚體。延伸時間要根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小來優(yōu)化，一般情況下1min擴增1kb。時間不要過長，過長容易增加53外切酶活性，造成條帶彌散。H PCR促進劑和添加劑PCR促進劑可以增加目標產(chǎn)物的擴增量，減少非特異性產(chǎn)物的擴增量。現(xiàn)有許多作用機理各不相同的PCR促進劑，這些促進劑并不會對所有PCR反應(yīng)有促進作用。模板和引物不同，促進劑的效用也不盡相同，因此需要通過具體實驗來驗證。以下討論常用的促進劑

10、：甜菜堿、DMSO和甲酰胺能夠促進高GC含量模板的擴增。高GC模板通常會形成較強的二級結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶擴增停止，導致擴增失敗。高GC模板之所以會成為一個難點是因為其兩條鏈不容易分離，分離后又很容易結(jié)合。而高GC含量引物會在分子間形成二級結(jié)構(gòu)，與模板結(jié)合過程競爭。甜菜堿能夠減少模板解鏈所需能量。DMSO和甲酰胺作用相似，都是干擾兩條單鏈DNA間氫鍵的形成，阻止模板兩條單鏈互補結(jié)合。如果擴增效率很差，添加適量的促進劑可以增加擴增產(chǎn)物量，促進劑的加量范圍為：甜菜堿（1M）、110% DMSO /甲酰胺。DMSO含量超過10%，或甲酰胺含量超過5%則會抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些情況下，通用

11、添加穩(wěn)定劑如BSA（0.1mg/ml），明膠（0.1-1.0%）和非離子型去垢劑（0-0.5%）能夠解決擴增失敗的問題。這些穩(wěn)定劑可以增加DNA聚合酶的穩(wěn)定性，減少管壁吸附造成的試劑損失。BSA還能幫助克服黑色素對反應(yīng)的抑制。非離子型去垢劑如Tween-20，NP-40和TritonX-100能夠克服反應(yīng)體系中殘留的痕量離子型去垢劑（如0.01%SDS）對PCR反應(yīng)的抑制作用。銨離子能偶增加擴增反應(yīng)對非優(yōu)條件的耐受性，因此一些PCR反應(yīng)試劑中包含10-20mM (NH4 )2SO4。其他PCR促進劑有 甘油（5-20%），聚乙二醇（5-15%）和氯化四甲基銨（60mM）I 核酸交叉污染盡可能的

12、降低核酸在實驗間的交叉污染相當重要。要對實驗場所進行分區(qū)，并在每一區(qū)配備專屬移液器等器材。使用低吸附槍頭或項目專用移液槍也能減少交叉污染。異補骨脂素，一種光敏交聯(lián)試劑，能夠嵌入DNA雙鏈，可阻止DNA雙鏈變性和復制。因此預(yù)先用異補骨脂素處理PCR試劑，可有效防止試劑中存在的污染雙鏈DNA在PCR過程中變性，只能擴增添加的未經(jīng)過異補骨脂素處理的樣本DNA。尿苷酶(UNG)，一種DNA修復酶，能夠把尿嘧啶從核糖上水解下來。利用其這一特性，在PCR體系中使用尿嘧啶（dUTP）代替胸腺嘧啶dTTP，那么擴增產(chǎn)物中便包含dUTP。在反應(yīng)體系中加入UNG，運行PCR程序的時候（一般在PCR反應(yīng)程序前加入1

13、0min 37的預(yù)處理，來使UNG發(fā)揮作用），UNG將會切割體系內(nèi)混入的含dUTP的擴增產(chǎn)物，阻止其擴增，以達到降低污染的目的。有校正功能的聚合酶如果使用dUTP效率將會降低（高保真酶），而沒有校正功能的聚合酶在含有dUTP的體系內(nèi)能夠穩(wěn)定擴增（比如Taq酶）。使用dUTP對EB染色和電泳遷移率無顯著影響（很多公司有含UNG的Taqman探針反應(yīng)體系，dUTP對Taqman探針應(yīng)該無顯著影響，需查文獻）。UNG處理還有一個優(yōu)勢就是它可以處理單鏈DNA也可以處理雙鏈DNA。減少錯誤的最佳方法永遠是規(guī)范化的操作。污染也是如此，規(guī)范化標準化的實驗室操作會盡可能的降低污染的可能性。有兩方面需要注意，一是加樣的時候，一定要左手拿離心管，右手去開蓋，而且動作要慢穩(wěn)，避免管內(nèi)液體飛濺；二是廢棄槍頭一定要打入含水的垃圾袋內(nèi)，實驗操作完成后，盡快密封垃圾袋，并丟棄到垃圾桶內(nèi)。工作臺的整潔直接體現(xiàn)實驗操作人員的專業(yè)素養(yǎng)，關(guān)乎實驗的成敗。請在每次實驗操作完成后認真整理實驗臺。規(guī)范化標準化的操作可能會花費