細胞培養(yǎng)和藥用化合物的合成.ppt_第1頁
細胞培養(yǎng)和藥用化合物的合成.ppt_第2頁
細胞培養(yǎng)和藥用化合物的合成.ppt_第3頁
細胞培養(yǎng)和藥用化合物的合成.ppt_第4頁
細胞培養(yǎng)和藥用化合物的合成.ppt_第5頁
已閱讀5頁,還剩30頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、細胞培養(yǎng)與藥物的工程生產(chǎn),1.前言 2.次生代謝產(chǎn)物的生物化學與細胞生物學 2.1異喹啉生物堿合成 2.2萜類吲哚生物堿生物合成 2.3托烷生物堿和煙堿合成 3.細胞培養(yǎng)與次生代謝物的生產(chǎn) 3.1建立高代謝物生產(chǎn)線 3.2器官分化和次生植物產(chǎn)品 3.3生產(chǎn)率的遺傳不穩(wěn)定 4. 逾越屏障:利用分子生物學手段提高植物細胞的次生代謝物產(chǎn)量 4.1克服代謝途徑的限速過程 4.2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和整體激活 4.3次生代謝物的定性控制和生物合成目的基因的隔離 4.4次生代謝物的積累和存儲 5. 未來展望 6. 結語,高等植物是藥用化合物的豐富來源。然而,許多藥用植物,由于種植技術上的困難以及經(jīng)濟上的原因,仍

2、然只能從野外獲取。藥用化合物要求的增加和植物可利用性的大幅減少增加了通過替代途徑生產(chǎn)藥用化合物的壓力,尤其是使用細胞/組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因植物。此外,優(yōu)質(zhì)原材料的需求也有增加。1970年之前,從細胞培養(yǎng)獲得次生代謝物的產(chǎn)量普遍低于那些從植物中獲得的產(chǎn)量。然而,一些細胞培養(yǎng)可以有相當大的生產(chǎn)力,并在某些情況下,其產(chǎn)量超過目前一些完整的植物體。目前對于操縱次生代謝產(chǎn)物代謝的分子和細胞生物學進展的了解,為細胞/器官培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因植物中次生代謝物的商業(yè)化生產(chǎn)提供了樂觀的基礎。我們總結了生物堿最近研究取得的進展作為一個主要的模式并討論控制其生產(chǎn)率和質(zhì)量的因素,側重于器官分化,遺傳不穩(wěn)定性,代謝途徑的限速酶,基

3、因轉(zhuǎn)錄監(jiān)控機構,次生代謝物的運輸和儲存。,1前言,高等植物產(chǎn)生多種化學品。迄今已確定超過25,000種萜類,約12,000種生物堿,8000種酚類物質(zhì)。這些化學物質(zhì)可在植物中提供多種功能。它們抵御草食動物和病原體,套種的競爭援助,吸引有益生物,如授粉者,并有對于非生物脅迫如紫外線的照射,溫度變化,水的狀態(tài),和礦質(zhì)營養(yǎng)的保護作用。此外,許多植物生產(chǎn)的次生代謝產(chǎn)物被用來作為香料,染料,芳香劑,調(diào)味劑,或人類的藥品。這些化學物質(zhì)中的許多還可以通過多種不同的方式促進人類健康和豐富我們的生活。,2次生代謝產(chǎn)物的生物化學與細胞生物學,許多植物中的次生代謝產(chǎn)物不僅做為藥品,同時也作為膳食補充劑和功能食品促進

4、人類的健康。植物生產(chǎn)的重組蛋白和植物療法同等重要。由次生代謝產(chǎn)物功能和結構的不同而分為幾個主要群體。萜類化合物和類固醇,這是由異戊二烯基團形成,包括抗腫瘤藥二萜類紫杉醇;抗瘧倍半萜類青蒿素;薯蕷皂甙元,口服避孕藥和激素類藥物的前體;抗強心劑地高辛甾苷;來至于派生莽草酸途徑的苯丙醇;包括抗腫瘤藥物木酚素,鬼臼毒素;生物堿是一種含氮的堿性有機化合物,包括許多具有生物活性的化學品如毒芹堿,咖啡因,嗎啡,尼古丁,和馬錢子堿等。我們這里重點研究生物堿,理由是其具有相對較高的有益的生物活性,尤其是異喹啉生物堿,萜吲哚生物堿,和托烷生物堿,是目前正在深入研究的主題。,1Morphine 嗎啡 2Acetyl

5、 salicylic acid乙酰水楊酸 3Artemisinin青蒿素 4Paclitaxel (Taxol) 紫杉醇(泰素) 5Podophyllotoxin鬼臼毒素,2.1異喹啉生物堿合成,異喹啉生物堿是一個龐大和多樣化的生物堿約有2500組定義結構。它們包括從罌粟屬植物獲得的鎮(zhèn)痛嗎啡,從秋水仙中提取的秋水仙堿,從吐根屬吐根中獲得的催吐藥和依米丁,從馬錢子屬植物中獲得的骨骼肌松弛劑,從小檗堿屬和血根堿屬植物物種中提取的抗菌化合物筒箭毒堿和黃連素等。其中有許多異喹啉生物堿都是作為藥品使用。,異喹啉生物堿合成開始于酪氨酸通過羥化,脫羧,脫氨轉(zhuǎn)化為多巴胺和4- 羥基苯乙醛。在這些早期步驟,只有

6、酪氨酸/多巴脫羧酶,分別把酪氨酸和多巴胺轉(zhuǎn)換成其相應的胺,這種酶已被純化和修飾。這種小的基因家族已從罌粟中分離而且每個亞科已被證明有明顯的發(fā)育和誘導表達模式。 TYDC基因家族的成員分為兩組(TYDC1和TYDC2),其在罌粟中表達存在差異。在成熟的植物體中,TYDC2在莖和根系中存在,并占主導地位。而TYDC1只在根部存在。,多巴胺和4 - 羥基苯乙醛被NCS(烏藥堿合酶)濃縮為(S)norcoclaurine,這是合成所有異喹啉類生物堿的前體。近日,NCS已被從培養(yǎng)的唐松桿菌中純化和修飾。 研究還表明,從培養(yǎng)的黃連粳稻細胞分離的一種新型加雙氧酶也促進NCS的反應。 TYDC(酪氨酸/多巴脫

7、羧酶)、TfNCS和CjNCS在擬南芥或大米中的同源性表明,這些基因或者有其他的基本生物學作用,或者在異喹啉生物合成途徑是普遍存在的,即使擬南芥或水稻中TfNCS和CjNCS的同源性相對較低,而且并沒有在水稻和擬南芥中發(fā)現(xiàn)異喹啉生物堿。STR(異胡豆苷合酶,催化萜類生物堿的關鍵反應)基因也在動物和擬南芥中被發(fā)現(xiàn)。 (S)Norcoclaurine是按順序地被依賴于S -腺苷蛋氨酸(SAM)的烏藥堿6-o-甲基轉(zhuǎn)移酶先轉(zhuǎn)換成烏藥堿;再被N 烏藥堿甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)換為N 甲基烏藥堿;然后由細胞色素P450羥化酶轉(zhuǎn)化為3-羥化-N-甲基化烏藥堿,最后由3-羥化-N-甲基化烏藥堿4- O -甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化

8、生成牛心果堿。詳細的研究這些重組酶,發(fā)現(xiàn)其有嚴格的反應特異性,協(xié)調(diào)生物合成按照一定的方式和順序進行。,各種異喹啉生物堿生物合成途徑。不間斷的箭頭表明單一的酶轉(zhuǎn)換和斷箭表明多種酶的步驟,以粗體顯示相應已被克隆的酶基因。,2.2萜類吲哚生物堿生物合成,萜類吲哚生物堿包括約3000種化合物,包括從馬達加斯加長春花中獲得的抗腫瘤藥長春堿,喜樹中的喜樹堿,并從金雞納屬植物中獲取的抗瘧藥奎寧。萜類吲哚生物堿生物合成的中間產(chǎn)物是異胡豆苷,這是由異胡豆苷合成酶催化色胺和環(huán)烯醚萜葡糖苷開鏈馬錢子甙合成的。色胺是由色氨酸脫羧酶催化色氨酸產(chǎn)生。,催化開鏈馬錢子甙生物合成二個步驟中的酶都依賴于細胞色素P450:香葉醇

9、 10-羥化酶把香葉醇轉(zhuǎn)化為10-羥化香葉醇,而開鏈馬錢子甙合成酶催化馬錢子甙轉(zhuǎn)化為開鏈馬錢子甙。萜類化合物的前體的供應是萜吲哚生物堿生物合成的限速步驟,香葉醇10-羥化酶的活性也和生物堿的積累成正相關性。異胡豆苷合成酶是一個萜類生物堿生物合成的關鍵酶,其cDNA已被從印度蘿芙木和長春花中分離。異胡豆苷被異胡豆苷葡糖苷酶去糖基化,然后通過幾個不穩(wěn)定的中間體進行轉(zhuǎn)化。,各種萜吲哚生物堿生物合成途徑。不間斷的箭頭表明單一的酶的轉(zhuǎn)換和虛線箭頭表示多種酶的步驟,以粗體顯示相應已被克隆的酶基因。,2.3托烷生物堿和煙堿合成,托烷生物堿主要存在于茄科,包括抗膽堿藥物阿托品,莨菪堿,東莨菪堿和麻醉藥可卡因。

10、腐胺N-甲基是托烷生物堿合成的前體,也是尼古丁合成的中間途徑。腐胺N-甲基由鳥氨酸或精氨酸分別在鳥氨酸脫羧酶或精氨酸脫羧酶催化脫羧所生產(chǎn)。托烷生物堿和尼古丁合成與多胺代謝也密切相關。托烷/尼古丁生物堿生物合成的第一個關鍵步驟是由丁二胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶催化,它與亞精胺合成酶有高度的同源性。甲基腐胺隨后由二胺氧化酶脫氨基,然后自發(fā)環(huán)化反應形成N -甲基- 1-咯啉陽離子。后者被認為給托烷環(huán)或煙酸形成尼古丁提供了一個前體,但是具體細節(jié)并不清楚。,莨菪酮是托烷生物堿合成的一個分支點??捎蓛蓚€相關的脫氫酶催化,托品酮還原酶I催化其生成托品堿和托品酮還原酶催化其生成&-托品堿,在煙草樟子松中,尼古丁生物合

11、成的基因被茉莉酸甲酯的外源性應用激活,但這種激活作用有效抑制了乙烯同步處理,即使乙烯和茉莉酸通常被認為是相互協(xié)同作用。相比之下用茉莉酸甲酯處理顛茄的根并沒有導致顛茄丁二胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的上調(diào)表達。托烷生物堿和尼古丁生物合成的不同反應說明了這些生物合成可能由不同的基因調(diào)控系統(tǒng)控制。,托烷生物堿,相關的化合物和尼古丁的生物合成途徑。不間斷的箭頭表示單酶轉(zhuǎn)換和斷箭頭表示多個酶的步驟。以粗體顯示相應已被克隆的酶基因。,3.細胞培養(yǎng)與次生代謝物的生產(chǎn),當我們在體外培養(yǎng)植物細胞時,不同類型的體系生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的能力不同。一類代謝產(chǎn)物產(chǎn)生在未分化的細胞的體外培養(yǎng),而另一類代謝產(chǎn)物產(chǎn)生在培養(yǎng)體系條件差異化

12、的系統(tǒng)中,例如,幼苗或根培養(yǎng)。在某些情況下,細胞在再分化后會失去藥用化合物生物合成潛力,即完全喪失其自然的生物合成潛力。例如嗎啡烷生物堿不在未分化的罌粟培養(yǎng)體系中生成。而另外幾個細胞培養(yǎng)如罌粟和山茶花,產(chǎn)生大量的與異喹啉生物堿結構相關的產(chǎn)品,血根堿和黃連素。有趣的是嗎啡,血根堿,黃連素的合成都是通過酪氨酸轉(zhuǎn)化成相同的中間體,牛心果堿,表明在代謝途徑的早期步驟并不確定細胞培養(yǎng)的最終產(chǎn)品。,3.1建立高代謝物生產(chǎn)線,雖然一些代謝產(chǎn)物可以在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生,但建立一個高收益的培養(yǎng)體系是代謝物商業(yè)化必不可少的部分,要求培養(yǎng)體系有較高的生產(chǎn)力和穩(wěn)定性,起始原料應該具有適當?shù)倪z傳多樣性。因此,實證試驗需要

13、建立合適的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)力細胞株。例如,H.niger是一個良好的植物物種通過細胞培養(yǎng)生產(chǎn)托烷生物堿。但與完整的植株相比,顛茄和曼陀羅細胞培養(yǎng)體系生產(chǎn)代謝物的效率較低。 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,包括溫度、光照、通氣等等是重要的因素。其他因素如剪切壓力,氣體成分,細胞密度也是擴大細胞培養(yǎng)規(guī)模的重要條件。例如,黃連素的生產(chǎn)要求更高,因為每個生物合成步驟都需要氧氣供應。同樣,照明可提高長春花生產(chǎn)萜吲哚生物堿的能力。細胞培養(yǎng)優(yōu)化條件的機制還沒研究清楚,一個詳細的生物合成途徑表征和調(diào)控機制可能有助于了解細胞培養(yǎng)的優(yōu)化條件。,此外,選擇高且穩(wěn)定的生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的細胞是至關重要的。由于植物細胞在開發(fā)過程中其套數(shù)條件的

14、改變和細胞培養(yǎng)誘導自發(fā)突變,選擇的細胞應建立一個有效的高代謝物生產(chǎn)線,而且連續(xù)的細胞培養(yǎng)常常會導致不穩(wěn)定性。高而穩(wěn)定的生產(chǎn)代謝物的細胞培養(yǎng)的維持也很重要,因為培養(yǎng)條件發(fā)生微妙的變化可以輕松地改變細胞的表型。一個內(nèi)源性的因素,對生產(chǎn)效率的影響即是對細胞產(chǎn)生代謝產(chǎn)物可行性的影響。由于許多代謝產(chǎn)物的生物活性,即細胞毒性,這些化學物質(zhì)的大量積累可誘發(fā)細胞死亡或生長發(fā)育遲緩,例如,黃連素抑制生產(chǎn)黃連素植物細胞的生長。ABC轉(zhuǎn)運的異位表達避免細胞毒性明確表明,如果細胞缺乏解毒/隔離的機械或耐受體系,代謝產(chǎn)物本身可能是有毒的。雖然穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)所需的重要因素尚未確定,我們的經(jīng)驗表明,生長緩慢的細胞更穩(wěn)定。這

15、可能是由于生長緩慢的細胞存在低的分裂和突變頻率,以及主要代謝產(chǎn)物與細胞生長和次生代謝物之間的競爭較少,觀察的結果是細胞生長和生物堿產(chǎn)量之間往往呈負相關性的。,3.2器官分化和次生植物產(chǎn)品,對于第二種情況,代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生在器官分化的過程中,植物器官培養(yǎng)是一種大規(guī)模的合適替代。土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的毛狀根,也已發(fā)現(xiàn)適合生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物,由于其在無激素的培養(yǎng)條件下穩(wěn)定,生產(chǎn)效率高。還有幾個藥用植物物種也成功地以這種方式進行了轉(zhuǎn)變。雖然這種類型的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)體系提供了穩(wěn)定的材料和一個有趣的研究領域,但毛狀根的形成如何影響代謝產(chǎn)物的機理尚不明確。毛狀根系統(tǒng)有一個更復雜的調(diào)節(jié)水平因為其組織機構和集成轉(zhuǎn)基因的影響

16、。 在高等植物和其它復雜的有機體中,某幾個代謝途徑能依靠一般的有機體的發(fā)展而進行,包括器官,組織,特別是專門細胞的發(fā)展。幾個次生化合物的生物合成和積累發(fā)生在一個生物體發(fā)育過程的特定階段?;衔镌谄鞴俸徒M織的合成不一定高水平的積累,例如,托烷生物堿在顛茄屬植物根中和尼古丁生物堿在煙草根中生成然后輸送到植物地上部分。,對于次生代謝物依賴特定的細胞結構發(fā)展到何種程度的機制尚不清楚。罌粟植物有專門負責次生代謝物儲存的異形細胞和排泄的乳汁細胞。萜類吲哚和托烷生物堿也需要類似的細胞合作:異甲羥戊酸途徑的酶和香葉醇 10-羥化酶產(chǎn)生10羥化香葉醇存在于韌皮部內(nèi)薄壁細胞中,色氨酸脫羧酶和異胡豆苷合成酶,作用于

17、萜類吲哚生物堿合成途徑的早期,存在于表皮細胞中,而長春花朵靈脫乙酰 4-O-羥化酶和長春花朵靈脫乙酰 4-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶,作用于合成途徑的后期,存在于植物地上部分的異形細胞中。丁二胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶作用于托烷生物堿的合成,存在于在皮層和內(nèi)皮層細胞中,天仙子胺-6-羥化酶作用于合成的最后一步,存在于根中柱鞘細胞中。這些結果表明,中間體應該驅(qū)動反應從開始到結束。為了每個特定的代謝反應,形態(tài)分化的細胞需要功能分化。然而,功能和形態(tài)分化之間的聯(lián)系的分子基礎目前尚不清楚。事實上,這種觀察可以解釋為什么生產(chǎn)一些代謝產(chǎn)物需要器官分化。例如,托烷生物堿合成的關鍵酶天仙子胺-6-羥化酶的過度表達可以提高細胞培養(yǎng)

18、生產(chǎn)東莨菪堿的產(chǎn)量。,3.3生產(chǎn)率的遺傳不穩(wěn)定,生產(chǎn)率損失是工業(yè)應用中的一個關鍵因素。前面提到過維護連續(xù)培養(yǎng)的細胞將導致突變的積累。目前,避免生產(chǎn)率突變損失的唯一手段是冷凍保存,盡管一些實證試驗表明,反復選擇穩(wěn)定的細胞生產(chǎn)體系可以克服這個問題。事實上,篩選的山茶花細胞顯示了完整的18條數(shù)目的染色體,而其他細胞系表現(xiàn)出相當不同數(shù)目的染色體。需要進一步研究,以確定如何在細胞培養(yǎng)中控制自發(fā)突變和后成的遺傳修飾。,生物合成活性的波動更頻繁地被觀察,尤其是在連續(xù)傳代培養(yǎng)中。舉例來說,高生產(chǎn)力的轉(zhuǎn)基因株系中生物堿的積累表現(xiàn)出相當?shù)牟环€(wěn)定,受培養(yǎng)條件的影響較強烈。由于初生代謝和次生代謝相互爭奪培養(yǎng)基基質(zhì),快

19、速生長的細胞很可能消耗完培養(yǎng)基,以至于在生產(chǎn)次生代謝物時無能源可利用,也就是細胞快速生長但生物堿產(chǎn)量低。細胞的生長和代謝產(chǎn)物的優(yōu)化是工業(yè)化的重要問題。我們特別點到的兩個步驟是分別促進細胞培養(yǎng)生長和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量是克服這些制約因素所必需的。 活性波動的另一個原因是代謝產(chǎn)物的輸送。我們有時會遇到細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化,這表明代謝也不是一成不變的。最近生物堿的代謝產(chǎn)物喜樹堿的剖面分析表明蒽醌類,它可以被認為是植物抗毒素,存在于毛狀根和愈傷組織提取物中,不存在于分化的小蛇根草中。這僅僅是一個例子說明分化的植物和毛狀根愈傷組織成分的差異。罌粟細胞生產(chǎn)嗎啡烷生物堿的生產(chǎn)率低可能由于中間體在苯并啡叮生物堿中被

20、積極輸送而不是在嗎啡烷生物堿中。一個詳細代謝流的分子特性應該是有幫助的而且可以闡明導致生產(chǎn)率較低的機制。,4. 逾越屏障:利用分子生物學手段提高植物細胞的次生代謝物產(chǎn)量,基因工程技術建立后,代謝途徑的修改和基因調(diào)控次生代謝成為可能。事實上,如果我們能夠提高生產(chǎn)率,或通過減少培養(yǎng)時間或增加代謝產(chǎn)物的水平,那么次生代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)是比較可行的。此外,或可能通過減少不必要的途徑,以改善代謝產(chǎn)物的質(zhì)量,或引入新的途徑,以產(chǎn)生新的化合物,或完全切斷某個途徑以積累中間體。這種代謝工程將植物細胞修改成為“綠色化學工廠”以獲得所需的化合物。在下面的章節(jié)中,我們討論如何用遺傳工程可以有助于消除在細胞培養(yǎng)或完

21、整的植物代謝途徑的障礙。一個結果表明,改造細胞本身可能有效地克服這些障礙。被根瘤土壤桿菌和毛根土壤桿菌轉(zhuǎn)化了的長春花能穩(wěn)定的生成長春花朵靈,這不是在細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的。這種轉(zhuǎn)化細胞的代謝活動說明生物堿生物合成所需的細胞特異性類型表達不一定在任何情況下都是必要的可能性。,克服植物細胞生產(chǎn)代謝產(chǎn)物局限性的策略 1)預先存在的途徑(2)早期的限速步驟過度表達,明確監(jiān)管和的產(chǎn)生過量的代謝產(chǎn)物(3)建立一個新的分支途徑產(chǎn)生新的化合物F和增加庫強度(4)減少不需要的途徑,以提高代謝流所需的路徑(5)轉(zhuǎn)錄因子的過度表達同時激活整個生物合成途徑(6)生物合成酶基因的突變或表達下調(diào)來積累中間途徑,4.1克服代謝途

22、徑的限速過程,如果我們能確定限速步驟和隔離靶基因,限速酶的過度表達對于所需藥物化合物的積累有好處。關鍵的一點是確定限速步驟。前期的步驟被推測成整個代謝途徑的限速步驟,次生代謝產(chǎn)物前期酶簡單的過度表達通常沒有足夠的誘導能力來合成所需的最終產(chǎn)品,由于缺乏足夠的后期酶誘導。這些研究表明,整體和綜合的調(diào)控生物合成途徑是至關重要的。 其他研究也旨在通過托烷生物堿和尼古丁的生物合成途徑增加通量。因此,煙草的丁二胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因在顛茄和樟子松中過度表達。雖然丁二胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶活力在顛茄中增長了3.3倍,觀察只有甲基腐胺水平升高,生物堿含量沒有增加。轉(zhuǎn)基因植株丁二胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶的過度表達體現(xiàn)在尼

23、古丁含量增加40,而在相同情況下野生型中只有3的增加量。一個途徑中的某些步驟可能是限速的,在大多數(shù)情況下由于編碼基因的過度表達,立刻會露出新的限速步驟。,4.2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和整體激活,由于研究次生代謝生物合成途徑存在難度,研究人員孤立了幾個一般的生物合成基因并修飾其啟動子序列,尤其是花青素的生物合成?;ㄇ嗨厣锖铣傻姆肿犹匦允且粋€成功的轉(zhuǎn)錄調(diào)控代謝產(chǎn)物的應用程序,也就是說,引進轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子- R和C1在一個異構系統(tǒng)中和最近激活標記方法所取得的成功顯示這些方法的高潛力和光明的未來。 ORCA的表達是由茉莉酸誘導。長春花細胞培養(yǎng)中ORCA3的異位表達增加了萜類生物堿合成中異胡豆苷合成酶、色氨酸脫

24、羧酶、P450細胞色素還原酶、長春花朵靈脫乙酰 4-O-羥化酶基因的表達,但不調(diào)控香葉醇 10-羥化酶和長春花朵靈脫乙酰 4-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因編碼。轉(zhuǎn)基因細胞ORCA3的過度表達顯著積累了色氨酸和色胺。然而,由于沒有檢測到萜吲哚生物堿,萜類分支的途徑仍然對萜類生物堿生產(chǎn)有限制。雖然ORCA3在調(diào)節(jié)萜吲哚生物堿生物合成中起著重要的作用,但是它沒有足夠的能力去調(diào)控整個代謝途徑。這表明其它的轉(zhuǎn)錄因素也參與其中。如上所述,整個代謝途徑調(diào)控會更復雜,因為新陳代謝的空間和發(fā)展一體化的需要。,4.3次生代謝物的定性控制和生物合成目的基因的隔離,為了植物細胞生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物能被成功的工業(yè)化應用,代謝產(chǎn)物的

25、數(shù)量和質(zhì)量都必須改進,那就是,控制代謝物的屬性是重要的。通過引入一個新基因來創(chuàng)建一個新的分支生產(chǎn)新型化合物是一種修改屬性的好方法。為了達到這個目的,至少有兩種可能的方法。一種是使用生物技術的方法來生產(chǎn)所需的化合物,也就是完整的設計一個在簡單和迅速增長的微生物系統(tǒng)或他們使用的生物轉(zhuǎn)化體系中的生物合成途徑的異源表達。重組酶將提供新的催化活動,而在完整的細胞中其活性低,往往使這種評價困難。微生物酶已被證明是有益的生物轉(zhuǎn)化化學品。植物酶更可能作為生物催化劑,雖然他們有相當高的底物特異性,例如,細胞色素P450,開鏈馬錢子甙合酶 。,另一種方法是在一個已經(jīng)存在的生物合成途徑中引入一個新的分支途徑。在一個

26、已經(jīng)存在的途徑中創(chuàng)建一個新的分支的重點是引進基質(zhì)親和力特異性酶。引進山茶花金黃紫堇堿 9-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的cDNA到花菱草細胞后,生物堿的屬性完全被改變。說明了山茶花金黃紫堇堿 9-O-甲基轉(zhuǎn)移酶優(yōu)于華菱草合酶。產(chǎn)物從生成血根堿變成生成非洲防己堿。然而,植物細胞并不總是天生顯示一個新的途徑,就是一個新引入的途徑可以為進一步的酶轉(zhuǎn)化提供底物,并產(chǎn)生了在野生型細胞中未檢測到的新化合物。這個結果清楚地表明在通路中引進一個新的分支途徑后植物細胞生產(chǎn)發(fā)散化學物質(zhì)的潛力。這一實驗結果也表明植物細胞如何使用預先存在的途徑得到一個代謝產(chǎn)物的分支途徑。這兩種情況對于新的功能基因的分離非常重要。,4.3.1特定基

27、因的分離,生物合成酶的可用性對于修改一個給定的合成途徑很重要。生物合成酶需要有足夠的底物和反應的特異性,或合理的蛋白質(zhì)工程,我們對這些知識的了解仍然是有限。因此,從特定的細胞中分離目的基因會更實用,雖然我們?nèi)绾潍@得可以分離所需酶,cDNA和基因的好材料值得懷疑。然而生物合成的基因通常集中在微生物中,但這種基因不催化次生代謝物的合成。以前選定的高代謝物生產(chǎn)細胞將是很好的分離這種基因和酶的候選人。例如,山茶花高黃連素生產(chǎn)細胞已經(jīng)被證明對分離這種生物合成基因非常有用,同樣油腺細胞也一樣。另外,如果我們能分離目標次生代謝的轉(zhuǎn)錄因子,那么使用轉(zhuǎn)基因的細胞為起始原料成為可能。其中一個例子是擬南芥過量表達P

28、AP1基因編碼一個MYB轉(zhuǎn)錄因子。這條線被用來確定一個新基因參與(使用代謝組學和轉(zhuǎn)錄的集成)黃酮類化合物的合成。蛋白質(zhì)組學方法對于通過雙向凝膠電泳和內(nèi)部肽序列檢查蛋白質(zhì)有用。,4.3.2代謝產(chǎn)物的質(zhì)量控制,簡單的代謝產(chǎn)物的組成,是理想的工業(yè)生產(chǎn)。生產(chǎn)所需的化合物最簡單的方法是在體外重建整個生物合成的過程,如上所述。到目前為止,有相當數(shù)量與生物堿生物合成有關的基因已被克隆,并在大腸桿菌或昆蟲細胞中表達。雖然微生物細胞儲存代謝產(chǎn)物的能力較低,但異種系統(tǒng)對生物轉(zhuǎn)化有用。 一個更有前途的做法是一個非必需途徑基因的表達下調(diào)。下調(diào)使用的反義材料和共抑制已被證明是有效的,因為被薄荷呋喃合成酶cDNA反義轉(zhuǎn)化

29、后的薄荷植物生產(chǎn)的非必需單萜油成分含量不到野生型的一半。,RNA干擾方法最近發(fā)展很迅速,使用雙鏈RNA誘導轉(zhuǎn)錄后或轉(zhuǎn)錄沉默是一種更有效的方法對于修改一個代謝途徑以致其關閉。雖然轉(zhuǎn)基因大腸桿菌細胞的反義黃連橋酶RNA在沒有中間體牛心果堿時失去生產(chǎn)生物堿的能力,黃連橋酶的雙鏈RNA表達載體的實驗明顯誘導了牛心果堿的積累并伴隨著終產(chǎn)物的減少。實驗結果清楚地說明了這種新的方法對于代謝工程很有用和即使代謝途徑已經(jīng)改變植物細胞也能夠存儲中間體。一個值得注意的問題是靶序列的選擇,因為短寡核苷酸基因序列的完全匹配可以有效地導致同源基因沉默。然而,不必要基因的沉默和消除某些特定蛋白質(zhì)也可以提供一種改變代謝途徑的方式。在含有COR(可待因酮還原酶 ) RNAi載體的轉(zhuǎn)基因罌粟中牛心果堿的積累可能會導致基因沉默的效應,而在合成牛心果堿后中斷嗎啡生物堿合成酶復合體可能參與牛心果堿的積累。,4.4次生代謝物的積累和存儲,由于在植物細胞中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,具有很高的生物活動,他們對于植物細胞本身而言有潛在的毒性。然而,代謝產(chǎn)物的細胞可以在沒有受到嚴重破壞的基本代謝過程中成長。生物堿積累的監(jiān)管機制

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論