熒光定量PCR技術(shù)原理與結(jié)果分析

1、熒光定量PCR技術(shù)原理與結(jié)果分析,羅喜鵬,一、含義 二、優(yōu)越性 三、應(yīng)用 四、定量方法 五、熒光材料 六、結(jié)果分析,一、含義,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。,二、優(yōu)越性,特異性 熒光定量PCR具有引物和探針的雙重特異性，故與傳統(tǒng)的PCR相比，特異性大為提高。 敏感性 熒光定量PCR的敏感度通常達(dá)E2拷貝/ml，對數(shù)期分析，線性范圍很寬，為0-E11拷貝/ml。一般來講臨床標(biāo)本中病原體的數(shù)目為0-E10/拷貝，在此范圍內(nèi)熒光定量

2、PCR定量較為準(zhǔn)確，標(biāo)本不需稀釋。 重復(fù)性 熒光定量PCR結(jié)果相當(dāng)穩(wěn)定，因?yàn)橛蛑翟O(shè)置在指數(shù)擴(kuò)增期.在此階段，各反應(yīng)組分濃度相對穩(wěn)定，沒有副作用，CT與熒光信號的對數(shù)呈線性關(guān)系。與終點(diǎn)法相比CT值能更穩(wěn)定，更精確地反映起始模板的拷貝數(shù)。 自動化 無PCR后續(xù)操作步驟，降低產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)性。,三、應(yīng)用,用于核酸的定量如RNA、DNA的定量 用于核酸定性分析如SNP分析，基因型分析，RNA變異分析，溶解曲線分析等。,四、定量方法,1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法的絕對定量 2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對定量 3. 比較CT法的相對定量,五、熒光材料,熒光探針和熒光染料 SYBR green I 水解探針TaqMan 分子信

3、標(biāo) 雜交探針,SYBR green I,未結(jié)合的SYBR green I,水解探針TaqMan,分子信標(biāo),雜交探針,六、結(jié)果分析,基線（Baseline） 指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。 光域值threshold的設(shè)定 一般將PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。,CT值 表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小，反之亦然。,基線期,指數(shù)期,線性期,平臺期,熒光閾值線,CT值,融解曲線分析,融解溫度TM,非特異擴(kuò)增產(chǎn)物,目的基因產(chǎn)物,比較CT法的相對定量表達(dá)差異計(jì)算,假設(shè)目的基因與看家基因擴(kuò)增效率相同，數(shù)學(xué)推導(dǎo)得出 目的基因的量=2-Ct Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因