【畢業(yè)學位論文】(Word原稿)茄科尖孢鐮刀菌綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及其定殖特性的研究_第1頁
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福建農(nóng)林大學碩士學位論文 茄科 尖孢鐮刀菌綠色熒光蛋白 基因轉(zhuǎn) 化 體系的優(yōu)化 及其定殖特性的研究 學 科 門 類:理學 一級學科名稱:微生物學 二級學科名稱:微生物學 研 究 方 向:應用微生物學與基因工程 研 究 生:朱磊 指 導 教 師:劉波 研究員、博士 完 成 時 間:二 0一一年四月 s he on of o 2011 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明,所呈交的學位(畢業(yè))論文,是本人在指導教師的指導下獨立完成的研究成果,并且是自己撰寫的。盡我所知,除了文中作了標注和致謝中已作了答謝的地方外,論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同對本研究做出貢獻的同志,都在論文中作了明確的說明并表示了謝意,如被查有侵犯他人知識產(chǎn)權(quán)的行為,由本人承擔應有的責任。 學位(畢業(yè))論文作者親筆簽名: 日期: 論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解福建農(nóng)林大學有關(guān)保留、使用學位(畢業(yè))論文的規(guī)定,即學校有權(quán)送交論文的復印件, 允許論文被查閱和借閱,學??梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容,可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文。 保密,在 年后解密可適用本授權(quán)書。 不保密,本論文屬于不保密。 學位(畢業(yè))論文作者親筆簽名: 日期: 指導教師親筆簽名: 日期: 福建農(nóng)林大學碩士學位論文 目 錄 中文摘要 . i . 一章 前言 . 1 1. 茄科枯萎病的發(fā)生與危害 . 1 科枯萎病的分布 . 1 生原因 . 1 播危害 . 1 病規(guī)律 . 2 2. 茄科枯萎病的病原菌 . 3 3. 茄科枯萎病的防治 . 3 4. 其在絲狀真菌中的研究概況 . 4 礎(chǔ)理論研究概況 . 4 為標記物所具有的優(yōu)點 . 5 絲狀真菌研究中的應用 . 5 5. 本研究的目的及意義 . 6 第二章 茄科作物枯萎病原菌的分離與鑒定 . 8 1 材料與方法 . 8 料 . 8 法 . 8 2 結(jié)果與分析 . 9 科作物枯萎病害調(diào)查及其發(fā)病癥狀 . 9 科枯萎病菌的分離與鑒定 . 10 原菌的分子鑒定 . 12 病性測定結(jié)果 . 14 3 討論 . 14 第三章 番茄尖孢鐮刀菌 化體系的優(yōu)化 . 15 1 材料與方法 . 15 料 . 15 法 . 16 2 結(jié)果與分析 . 17 孢鐮刀菌的原生質(zhì)體制備 . 17 2.2 因的轉(zhuǎn)化 . 17 化子的穩(wěn)定性篩選 . 18 3 討論 . 19 第四章 番茄尖孢鐮刀菌 化子的生物學特性 . 20 1 材料與方法 . 20 料 . 20 法 . 20 2 結(jié)果與分析 . 21 化子的菌體形態(tài)及生長速度 . 21 同 轉(zhuǎn)化子生長的影響 . 22 福建農(nóng)林大學碩士學位論文 化子對潮霉素的抗性水平分析 . 22 3 討論 . 23 第五章 番茄尖孢鐮刀菌在植株體內(nèi)的侵染定殖 . 24 1 材料與方法 . 24 料 . 24 法 . 24 2 結(jié)果與分析 . 24 株及組織發(fā)病癥狀觀察 . 24 聚焦激光掃描顯微鏡檢測標記菌 . 25 3 討論 . 29 第六章 番茄尖孢鐮刀菌在土壤中的定殖特性 . 31 1 材料與 方法 . 31 料 . 31 法 . 31 2 結(jié)果與分析 . 32 同土壤中轉(zhuǎn) 因鐮刀菌的數(shù)量動態(tài)變化 . 32 同土壤中轉(zhuǎn) 因鐮刀菌的熒光觀察 . 32 3 討論 . 34 第七章 番茄尖孢鐮刀菌對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響 . 35 1 材料與方法 . 35 料 . 35 法 . 35 2 結(jié)果與分析 . 36 分析轉(zhuǎn) 因鐮刀菌對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響 . 36 3 討論 . 39 第八章 結(jié)論與展望 . 41 1 結(jié)論 . 41 2 展望 . 41 參考文獻 . 42 福建農(nóng)林大學碩士學位論文 i 中文摘要 茄科 枯萎病是由尖孢鐮刀菌 ( 引起的毀滅性病害,嚴重 制約了 我國 茄科作物的生產(chǎn) 。 本文從福建省各地區(qū)采集了 番茄、茄子及辣椒 枯萎病植株 ,分離與 鑒定 了其病原菌;并對 一株 番茄枯萎病菌進行 綠色熒光蛋白( 基因轉(zhuǎn)化, 篩選獲得 了 熒光強度和 遺傳 性狀穩(wěn)定 的轉(zhuǎn)化子 ,同時利用綠色熒光蛋 白標記的 轉(zhuǎn)化子 研究了番茄枯萎病原菌 在植株 體內(nèi) 及根際土內(nèi)的定殖特性 , 主要研究結(jié)果如下: 1. 從 福建省 的 漳州、 福州 、廈門 等茄科作物主產(chǎn)區(qū) 采集了番茄、辣椒、茄子 表現(xiàn)枯萎病癥狀的植株進行分離鑒定,獲得 40株鐮刀菌,其中 35株為尖孢鐮刀菌,進一步的致病性確定了尖孢鐮刀菌是這 3種茄科作物枯萎病的致病菌株。 2 采取 導的方法 ,優(yōu)化番茄 尖孢鐮刀菌的 綠色熒光蛋白( 轉(zhuǎn)化體系 。轉(zhuǎn)化的最適條件: 培養(yǎng) 12h 的新鮮菌絲 在 4 解液( 20 mg/潰酶 , 10 mg/壁酶 ) 中 , 28 , 70 r/件下 , 酶解 h。對所得轉(zhuǎn)化子 的 生物學特性研究 表明 ,標記后的菌株在菌絲形態(tài)、生長速度 、 等 條件下的生長 特性與野生型菌株基本相同。 通過穩(wěn)定性篩選獲得 了 熒光強度、 遺傳 性狀穩(wěn)定 的轉(zhuǎn)化子 。 3利用 激光共聚焦掃描顯微鏡跟蹤觀察 了綠色熒光蛋白標記 菌株在番茄植株內(nèi)的侵染 特性 , 結(jié)果表明, 處理后的第 3 d、第 6 d 時,可見分子孢子萌發(fā)后從植株的根系侵入,此時植株的地上部無明顯變化; 第 10 d 時,菌絲體已到達植株的根系及莖基部維管束組織 ,植株的 根及 莖 基部 出現(xiàn)褐變現(xiàn)象 ;第 17 d 時,植株莖基部的菌 絲量增多, 番茄植株個別枝條萎焉,且莖基部出現(xiàn)了明顯的褐變 。 4. 跟蹤觀察了 因標記菌株在不同 性質(zhì) 土壤中的 32 天的 定殖 情況 ,結(jié)果表明,標記菌株能夠在不同性質(zhì)的土壤內(nèi) 至少 定殖 1 個月 ,隨著時間的延長其定殖密度逐漸下降。 其中在水稻田土里存活能力最好,在沙土里存活能力最差。 關(guān)鍵詞: 茄科;尖孢鐮刀菌;綠色熒光蛋白; 侵染; 定殖 福建農(nóng)林大學碩士學位論文 of is of to be of . to of by as as 1. 40 of 35 F. by 2. To . of . as 8 C 2h 20 r/ mL of an 0 mg/0 mg/8 C 70 r/, h. pH of as 3. of . in in 7 by -6 or of to At 0 in of 7 of in 4. . in to of of 2 . at in in in 1 第一章 前言 1. 茄科枯萎病的發(fā)生與危害 科枯萎病的分布 全世界茄科植物大約 80 屬 3000 種,分布范圍廣泛,遍及溫 帶及熱帶地區(qū);我國共有 24 屬 105種 35 變種 1。包括枸杞屬、天仙子屬、曼陀羅屬、煙草屬、番茄屬、辣椒屬等。茄科蔬菜包括茄子、辣椒、番茄、馬鈴薯等,在蔬菜中占有重要地位,是百姓生活中必不可少的蔬菜美食,因此培育優(yōu)良的茄科蔬菜品種對于滿足社會生產(chǎn)、生活等方面的需要,具有重大的理論和實踐意義 2。 由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病,對茄科作物危害最大,防治困難,作物受害面積大,給農(nóng)民生產(chǎn)增收帶來很大困難,造成重大經(jīng)濟損失,成為影響茄科蔬菜生產(chǎn)的一個重要病害 3。 尖孢鐮刀菌( 是 一種世界性分布的病原真菌,存在于 各種土壤中, 甚至在極端環(huán)境 也可分離到 4。例如,辣椒枯萎病在國外早有報道, 20世紀 50年代在我國由俞大紱首次報道 , 目前已廣泛分布于陜西、甘肅、廣西、四川、湖南、北京、浙江、山西等省 5。而番茄枯萎病在我國南方地區(qū)分布較多,影響較大,例如在廣西、廣東、福建等省,但是在北方寒冷地區(qū)如黑龍江省也逐漸流行開來 6。尖孢鐮刀菌的寄主范圍也 十分 廣泛,目前已報道的被尖鐮孢菌嚴重為害的作物有香蕉、番茄、辣椒、棉花、蘿卜、西瓜、黃瓜、草莓、鷹嘴豆、甘蔗 、 郁金香 等多種植物。 生原 因 近年來,隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整,同時為了適應人們對膳食結(jié)構(gòu)的調(diào)整及優(yōu)化,我國茄科作物的種植面積不斷擴大,在給廣大農(nóng)民帶來巨大的經(jīng)濟效益的同時,茄科作物病蟲害也越來越嚴重。 當前,國內(nèi)茄科作物的主要種植品種包括了辣椒、番茄、茄子、馬鈴薯等,為農(nóng)業(yè)主栽品種。這幾種作物常見病害有:灰霉病、黃萎病、枯萎病及青枯病等,主要病原菌有真菌、細菌,還有病毒導致的病害。但這些病害中,尤以枯萎病致病菌導致的病害最為廣泛、損失最為嚴重。一些種植戶由于管理不善或其他原因?qū)е铝丝菸〉陌l(fā)生與快速蔓延,造成了較大的經(jīng)濟損失。分析有 以下幾個主要原因: 連作致病,我國農(nóng)村大部分地區(qū)的茄科種植戶相對穩(wěn)定,連作通常在 3萎病菌在病殘體和土壤中腐生,連年繁殖積累導致病原不斷增加。而發(fā)病率也不斷攀升,有的田塊達到 80 %以上。 種子帶菌, 枯萎病原菌以菌絲體或厚垣孢子隨病殘體在土壤中或附著在種子上越冬。帶菌的種子和帶有病殘體的有機肥是無病區(qū)的初始感染源,病原菌從幼苗移栽傷口侵入到維管束內(nèi)并繁殖蔓延,引起作物萎蔫。 蟲害導致,部分田塊的土壤中存在有一定量的線蟲等地下害蟲,病原菌從害蟲危害后的傷口侵入根部從而導致感染。 肥水管理不當, 施肥水平較高的大棚其枯萎病發(fā)病率明顯高于施肥水平較低的大棚,原因是植株根系處于高肥水土壤環(huán)境中,生長緩慢,加之低地溫形成根腐傷口,病原菌隨水傳播。同時肥料結(jié)構(gòu)對該病的影響也較大,氮、磷肥施用過多,而鉀肥和有機肥的施用不足,造成營養(yǎng)生長過旺,植株機體的抗病性降低,雨天后放晴及氣溫升高,多方面因素導致了感病機率增加 7。 播危害 隨著生產(chǎn)集約化程度的提高,茄科作物保護地的種植面積逐年擴大且存在重茬,導致茄科病害日趨嚴重,其中枯萎病最為普遍,嚴重影響了蔬菜品質(zhì)及產(chǎn)量,直接影響了農(nóng)戶的經(jīng)濟收入。 自本世 紀初( 1905)發(fā)現(xiàn)番茄枯萎病以來,在世界上大部分國家均有發(fā)生 8。如今的番茄枯萎病福建農(nóng)林大學碩士學位論文 2 已成為其主要病害之一,發(fā)病規(guī)模越來越大,有的地方發(fā)病率達到 80 %,病株率在 10 %,減產(chǎn)10 %,給番茄生產(chǎn)帶來巨大威脅 9。辣椒枯萎病是由半知菌亞門尖孢鐮刀菌辣椒?;停?染引起的。在發(fā)病地區(qū),該病的發(fā)病率一般為 15 %,嚴重時可達70 %,有時甚至導致絕收,造成了嚴重的經(jīng)濟損失。該病在國外早有報道 10, 20世 紀 50年代在我國由俞大紱最早鑒定 11。以后,北京李明遠等( 1987) 12、浙江葛起新( 1991) 13等也有記述。目前陜西、甘肅、廣西、四川、湖南、北京、浙江、山西等地已相繼有此病的報道。保護地茄子的土傳病害較為嚴重,有些病害的病菌在土壤中存活時間可長達 3用化學藥劑很難控制,如枯萎病、黃萎病等非常頑固,難以防治。一旦條件適宜,可能會造成大流行。而老菜區(qū),發(fā)病率逐年提高,嚴重地塊發(fā)病率在 50 %,甚至絕收,給生產(chǎn)帶來巨大損失 14。 枯萎病是種土傳病害,主要危害植株維管束,一般 在作物花期或結(jié)果期開始發(fā)病,癥狀自下而上逐漸顯現(xiàn),該病傳染性強,但病程較為緩慢,一般 15同種蔬菜作物的具體表現(xiàn)癥狀有差異 :番茄枯萎病在開花結(jié)果期始發(fā),發(fā) 病初期僅莖的一側(cè)自下而上出現(xiàn)凹陷區(qū),致一側(cè)葉發(fā)黃,變褐后萎焉枯死;也有的從植株距地面近地葉序始發(fā),逐漸向上蔓延。剖開病莖,維管束變褐,濕度大時,病部產(chǎn)生粉紅色霉層,即病菌的分生孢子梗和分生孢子,無乳白色粘液流出,有別于青枯病 15,16;茄子枯萎病,病株葉片自上而下逐漸變黃枯萎,癥狀多表現(xiàn)在一、二層分支上,有的同一葉片僅半邊黃,另一半健 康如常,該病易于黃萎病混淆,需要 17;甜椒、辣椒枯萎病,發(fā)病初期根部或根頸處常發(fā)生水漬狀褐色斑點,嫩芽和嫩葉生長緩慢,色澤暗,發(fā)病輕的在晴天中午萎蔫,早晚和陰天恢復正常,可持續(xù) 2期根頸處及主根、側(cè)根基部皮層干裂,容易剝落,植株下部葉片大量脫落,莖基部皮層發(fā)生水漬狀腐爛,莖稈和葉片迅速凋萎。發(fā)病后期,病株側(cè)根很少,植株很容易被拔起。相對濕度較大時,病部長出豐茂的白色菌絲或藍綠色霉狀物。莖基部近地面段干腐或出現(xiàn)縱向枯死的長條斑。折斷莖稈可見根頸部維管束變褐,外部也常呈褐色。病株地下部 根系也呈水浸狀軟腐,皮層極易剝落,木質(zhì)部變成暗褐色至煤煙色 18 病規(guī)律 番茄枯萎病以菌絲體,厚垣孢子隨病殘體在土壤、糞肥或附著在種子上越冬番茄種子帶菌,成為下一年的初次侵染源,病菌主要從根部、根莖部的傷口侵入,然后在維管束中大量繁殖,阻塞導管并產(chǎn)生毒素。毒素在植株體內(nèi)上下擴散。植株在導管被阻和毒素的雙重作用下使整株枯死。帶病種子的調(diào)運是本病遠距離傳播的途徑。田間病菌的傳播主要靠流水和帶菌土壤。土壤潮濕,連作,耕作時傷根,生長勢弱,氮肥施用過量或缺少鉀肥的地塊均易發(fā)病。 而枯萎病株的空間分布格局亦是該病原菌種群的重要屬性之一,由物種的遺傳特性和生態(tài)環(huán)境條件決定。 番茄枯萎病喜高溫高濕。發(fā)病程度與土溫關(guān)系很大。發(fā)病最適土溫為 26 ,最高為 33 ,21 以下病害受抑制。暴雨過后,天氣晴朗,氣溫回升有利于病害的擴展蔓廷,特別在酸性較大的土壤,病害擴展更快。就番茄生育期看,發(fā)病高峰期出現(xiàn)于植株生長中后期;從季節(jié)看,夏植番茄和 911冬末初春播種移栽, 319。辣椒枯萎病由鐮刀菌引起,只危害辣椒和甜椒。病原菌主要以厚 垣孢子在土壤中越冬,在土壤中可進行較長時間的腐生生活,據(jù)報道,該病菌在土壤中存活年代為 6菌主要借助灌溉水或雨水傳播,也可隨病土借風吹到別處。辣椒枯萎病的發(fā)生的最適溫度為 24 ,高于 35 或低于 17 均不利于其發(fā)育。排水不良、畦面凹凸不平、干濕不均的地塊發(fā)病嚴重。在適宜發(fā)病條件下 2周即出現(xiàn)死株現(xiàn)象。潮濕或水漬田易發(fā)病,重茬地, 秧苗老化、土壤過酸、缺鉀肥或線蟲多的地方易加劇病害的發(fā)展 20。 茄子枯萎病多發(fā)生在成株期 , 病原菌以菌絲體或厚垣孢子隨病殘體在土壤中或附著在種子上越冬 。 在溫 度達 25 , 土壤潮濕時, 移栽中傷根時 極利于發(fā)病。 當 氣溫在21 以下或 33 以上 時 病害受到抑制 21。 福建農(nóng)林大學碩士學位論文 3 2. 茄科枯萎病的病原菌 枯萎病是一種世界性分布的土傳病害,由鐮刀菌屬真菌寄生引起 22。目前已知的鐮刀菌有:串珠鐮刀菌 ( F. ,串珠鐮刀菌膠胞變種 ( F. ,本色鐮刀菌 ( F. ,半裸鐮刀菌 ( F. ,銳頂鐮刀菌 ( F. ,燕麥鐮刀菌 ( F. ,木賊鐮刀菌 ( F. ,尖孢鐮刀菌 ( F. 禾谷鐮刀菌 ( F. ,網(wǎng)脈鐮刀菌 ( F. ,桑布鐮刀菌 ( F. ,黃色鐮刀菌 ( F. 茄病鐮刀菌 ( F. 等 23。茄科作物枯萎病國內(nèi)外早有報道,其中尖孢鐮刀菌 ( F. 是其主要致病菌,包括非致病菌、植物致病菌以及人類致病菌,除了草和大多數(shù)木本作物,大多數(shù)栽培作物都是致病菌的寄主 24, 尖孢鐮刀菌屬半知菌類 ( 梗孢目( 痤孢科( 鐮刀菌屬( 植株被尖孢鐮刀菌侵染后,發(fā)病癥狀多種多樣,一般導致維管束枯萎、植株枯黃、球莖和根腐爛,植株生長衰弱 22, 造成重大經(jīng)濟損失,成為影響茄科蔬菜生產(chǎn)的一個重要病害。 尖孢鐮刀菌 ( 的分類相當復雜,關(guān)于種的區(qū)分 也 比較含糊。尖鐮孢菌的形態(tài)學和生理學 特征 變異很大,一般只能達到種間分類的水平。威倫威伯等人 根據(jù)該菌的巨型和微型分生孢子的結(jié)構(gòu):包括它們的形狀 ,中隔膜的出現(xiàn)及數(shù)量,分生孢子的顏色,厚垣孢子的有無以及菌絲體培養(yǎng)物其它某些可測定的特征建成尖鐮孢的分類體系。而辛德和漢森則將威倫威伯的劃分體系加以簡化,根據(jù)它們的形態(tài)學將尖鐮孢劃分為種,而根據(jù)它們的分離株系或小種的致病力大小創(chuàng)立出各種形式的專化型 25。 不同?;驮诓煌貐^(qū)的分布又有所不同,這種差異反應了尖孢鐮刀菌對生長環(huán)境的選擇,表現(xiàn)在其對不同環(huán)境利用的生長特性上。朱育菁等對尖孢鐮刀菌的生長特性進行了深入研究 26。藍江林研究了溫度對尖孢鐮刀菌菌株生長的影響 27。 番茄枯萎病由尖孢鐮刀菌番茄專化型 引起,在 1895 年英國

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