課件：金黃色葡萄球菌檢驗與計數(shù).ppt

金黃色葡萄球菌檢驗與計數(shù),概況,葡萄球菌屬微球菌科，本菌有19個菌種，從人體上可檢出12個種。 葡萄球菌屬主要與皮膚腺體和溫血動物的粘膜相關系，有些種是人及動物的條件致病菌。 金黃色葡萄球菌對人類有致病性，通常被稱為病原性球菌。金黃色葡萄球菌可引起化膿性炎癥，又稱為化膿性球菌。,金黃色葡萄球菌的生物學特性,形態(tài)與染色： 金黃色葡萄球菌的典型形態(tài)呈球形，直徑0.41.2m，大小不一，平均直徑約為0.8m。 革蘭氏染色陽性，呈葡萄串狀排列。無鞭毛、無芽胞。在陳舊培養(yǎng)物中，衰老的菌體常轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性。,培養(yǎng)特性： 易培養(yǎng)，對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基中生長良好。 需氧或兼性厭氧。 最適生長溫度37C，最適生長pH 7.4。耐鹽性強，在含1015%的氯化鈉培養(yǎng)基中仍能生長，可用于篩選菌種。 在普通營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)1824，可形成圓形、表面光滑、不透明的菌落?？僧a(chǎn)生金黃色色素，色素為脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落內(nèi)，不滲至培養(yǎng)中。,在血平板上可形成明顯透明的溶血環(huán)。為型溶血。 可產(chǎn)生卵磷脂，在卵黃高鹽培養(yǎng)基上形成周圍有白色沉淀環(huán)的菌落。 大多數(shù)菌株分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅試驗、 VP試驗多為陽性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)。觸酶陽性。,金黃色葡萄球菌的酶,金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生血漿凝固酶和耐熱DNA酶。這兩種酶均與金黃色葡萄球菌的致病性有關。 血漿凝固酶：與金黃色葡萄球菌的致病力密切相關。一般認為，血漿凝固陽性的金黃色葡萄球菌菌株有致病力。否則為無致病力的菌株。血漿凝固酶對熱穩(wěn)定，能抵抗6030min甚至10030min后，仍能保存大部分活性。 耐熱DNA酶作為除血漿凝固酶外鑒定金黃色葡萄球菌致病力的指標之一。該酶的最適pH為9.0。,金黃色葡萄球菌腸毒素：是金黃色葡萄球菌一種重要的致病物質(zhì)。本菌引起的食物中毒是因為食品污染了金黃葡萄球菌后，由細菌產(chǎn)生大量腸毒素而導致的。 近年報導表明，50%以上的金黃色葡萄球菌菌株在實驗室條件下可產(chǎn)生腸毒素，并且1個菌株能產(chǎn)生兩種或兩種以上的腸毒素。 腸毒素是一種可溶性蛋白質(zhì)，由單個無分枝的肽鏈組成。分子量約為3000左右。易溶于水，難溶于有機溶劑。,金黃色葡萄球菌的腸毒素,耐熱，經(jīng)100煮沸30min不被破壞，也不受胰蛋白酶的影響。食物中的腸毒素耐熱性更強，一般烹調(diào)溫度不能將其破壞。218248 的油中需30min才能被破壞?？梢鸺毙晕改c炎。 根據(jù)腸毒素的血清型，可分A、B、C（C1、C2）、D、E 5 個型。A型腸毒素引起的食物中毒較多，約占50%左右。其他依次為D、C、B和E型。也有AD、AB、AC、BC等。,A型腸毒素毒力較強，攝入1g即可引起中毒；B型毒力較弱攝入25g，才引起中毒。一般認為引起人中毒的最小劑量是1.07.2g/kg。,金黃色葡萄球菌檢驗,金黃色葡萄球菌的檢測程序,檢樣25g(mL) 225mL生理鹽水或磷酸鹽緩沖液,7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯,361,Baird-Parker平板，血平板,涂片染色,觀察溶血,血漿凝固酶試驗,報告,血平板1824h， Baird-Parker平板1824h或4548h。,BHI肉湯和營養(yǎng)瓊脂小斜面,361,1824h,增菌培養(yǎng)基,7.5%氯化鈉肉湯：為葡萄球菌選擇性增菌培養(yǎng)基，因金黃色葡萄球有耐受高鹽的特性，因而能在此增菌液中生長，除某些嗜高鹽的海洋菌外，大多數(shù)細菌都被增菌液中的高鹽所抑制。 胰酪胨大豆肉湯：含氯化鈉達10%，以胰酪胨替代牛肉浸粉，并加入少量磷酸氫二鉀和葡萄糖促進葡萄球菌的生長。,樣品的稀釋,固體和半固體樣品：稱取25g樣品至盛有225 mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min10000 r/min均質(zhì)1min2min，或放入盛有225 mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2min，制成1:10的樣品勻液。 液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。,增菌與分離培養(yǎng),增菌培養(yǎng)：吸取5mL上述樣品勻液，接種于50mL 7.5%氯化鈉肉湯或10%胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，361培養(yǎng)18h24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長，污染嚴重時在10%胰酪胨大豆肉湯內(nèi)呈混濁生長。 將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板361培養(yǎng)18h24h。Baird-Parker平板361培養(yǎng)18h24h或45h48h。,分離培養(yǎng)基,Baird-Parker瓊脂：培養(yǎng)基中含有卵黃亞碲酸鉀，能抑制大多數(shù)細菌的繁殖，并能促進金黃色葡萄球菌的生長使其產(chǎn)生黑色和暈圈。培養(yǎng)基中的丙酮酸鈉和甘氨酸也能促進金黃色葡萄球菌的生長。 金黃色葡萄球菌的菌落形態(tài)：圓形、光滑凸起、濕潤，直徑約23mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶而可見無混濁帶和透明圈的非典型菌落。,長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。,金黃色葡萄球菌,空白培養(yǎng)基,分離培養(yǎng)基,血瓊脂：是一種基礎培養(yǎng)基，含有5%的脫纖維血(羊血或兔血)。用于觀察金黃色葡萄球菌的溶血現(xiàn)象。金黃色葡萄球菌在血瓊脂平板上呈溶血。 金黃色葡萄球菌的菌落形態(tài)：呈金黃色，有時也呈白色，大而突起，圓形、不透明、表面光滑，周圍有透明的溶血環(huán)。,金黃色葡萄球菌的重要鑒定- 血漿凝固酶試驗,試驗原理：致病性的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，附著于細菌表面 ，產(chǎn)生凝固。 金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶：一種是與細胞壁結合的凝固酶，為結合凝固酶；另一種是菌細胞釋放于培養(yǎng)基中，為游離凝固酶。二者的抗原性不同。,血漿凝固酶試驗,挑取BairdParker平板或血平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mL BHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，361培養(yǎng)18 h24 h。 取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入可疑菌落的BHI培養(yǎng)物0.2mL0.3mL，振蕩搖勻，置361溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，判定為陽性結果。,同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。 結果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mL BHI，361培養(yǎng)18h48h，重復實驗。,結果報告,如血漿凝固酶試驗陽性，可判定為金黃色葡萄球菌 。 報告在25g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。,影響血漿凝固酶試驗的因素,血漿：血漿凝固酶試驗可選用人血漿或兔血漿。用人血漿出現(xiàn)凝固的時間短，約93.6%的陽性菌在1h內(nèi)出現(xiàn)凝固。用兔血漿1h內(nèi)出現(xiàn)凝固的陽性菌株僅達86%，大部分菌株可在6h內(nèi)出現(xiàn)凝固。 若被檢菌為陳舊的培養(yǎng)物（超過1824h），或生長不良，可能造成凝固酶活性低，出現(xiàn)假陰性。,不能使用甘露醇氯化鈉瓊脂上的菌落做血漿凝固酶的實驗，因所有高鹽培養(yǎng)基都可以抑制A蛋白的產(chǎn)生，造成假陰性結果。 不要用力振搖試管，以免凝塊振碎。 實驗必需設陽性(標準金黃色葡萄球菌)、陰性(白色葡萄球菌)、空白(肉湯)對照。 玻片法只能檢測結合凝固酶，而試管法可檢測兩種凝固酶。因此，兩種試驗所得結果可完全不同。 玻片法只用于篩選。,金黃色葡萄球菌計數(shù),第一法 Baird Parker 平板法 第二法MPN法 第三法PetrifilmTM測試片法,第一法:平板計數(shù)法,檢驗程序,檢樣25g(mL) 225mL生理鹽水或磷酸鹽緩沖液,10倍稀釋,選擇三個連續(xù)的適宜濃度的樣品勻液，接種Baird-Parker平板,計數(shù)及血漿酶試驗,報告,361,4548h,樣品的接種、培養(yǎng)與典型菌落的確認,根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇23個適宜稀釋度的的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，每個稀釋度分別吸取1ml，以0.3，0.3，0.4ml接種量，分別加入三塊Baird-Parker平板，用L棒涂布整個平板，(注意不要觸及平板的邊緣)。 接種前應注意保持平板的干燥(可在2050的培養(yǎng)箱中干燥)，通常情況下涂布后，將平板靜置10min，如樣液不易吸收，可將平板置361培養(yǎng)1h后，再反轉(zhuǎn)平板，倒置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 培養(yǎng)溫度與時間：361，4548h。 典型菌落確認：從典型菌落中任選五個菌落（小于五個全選），分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，361培養(yǎng)1824h后進行血漿凝固酶試驗。,典型菌落計數(shù)與計算公式的應用,計數(shù)范圍要求：選擇合計菌落數(shù)在20200的平板，計數(shù)典型菌落。,公式一的使用范圍： -最低稀釋度平板的菌落小于20 cfu，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落； -某一稀釋度平板的菌落大于200 cfu且有典型菌落，但上一稀釋度平板上沒有典型菌落，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落； -某一稀釋度平板的菌落大于200 cfu且有典型菌落，且上一稀釋度平板上有典型菌落，其平板上的菌落數(shù)不在20 cfu200 cfu之間，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；,公式一,T=AB/Cd T:樣品中金黃色葡萄球菌落數(shù)； A:某一稀釋度典型菌落的總數(shù) ； B:某一稀釋度血漿凝固酶陽性的菌落數(shù) ； C:某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗的菌落數(shù)； d:某一稀釋度。,公式應用例一,公式一： T=AB/Cd T=65450.1=520,高、低稀釋度平板均有典型菌落，但其中高稀釋度二平板的菌落數(shù)均不在20200之間，選擇低稀釋度的平板進行計數(shù)。,N=T/1.1d T：兩個稀釋度平板上確認的金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)之和； d：稀釋因子(第一稀釋度)。 公式二的使用范圍：平板菌落數(shù)均在20 cfu200 cfu之間。 公式引用于ISO 6888-1:1999(E),公式二,公式應用例二,公式二： N=T/1.1d T1=18335=110 T2=2145=17 T= T1+ T2=110+17=127 N=T/1.1d=1271.10.1=1200,所有稀釋度平板合計菌落數(shù)均在20200間：,結果報告,單位：cfu/g或者cfu/mL；若T或者N為0，報告1d-1 cfu/mL(g)。,第二法 MPN法,MPN檢驗程序,25g(mL)檢樣+225mL稀釋液， 勻質(zhì),10倍系列稀釋,選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液，吸1mL樣液，每稀釋度各接種3管胰酪胨大豆肉湯，樣品的最高稀釋度，能達到獲得陰性終點,361,4548h,接種Baird-Parker平板,血漿凝固酶試驗,4548h,361,查MPN表,報告結果,接種和培養(yǎng),根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇23個適宜稀釋度的的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，每個稀釋度分別吸取1ml接種到胰酪大豆肉湯管，每稀釋度接種3管。361培養(yǎng)4548h。 用接種環(huán)從有細菌生長的各管中，移取1環(huán)分別接種于Baird-Parker平板361培養(yǎng)4548h。 確認典型菌落，并從典型菌落中至少挑取1個菌落做血漿凝固酶試驗。,結果報告,計算血漿凝固酶試驗陽性菌落對應的管數(shù)，查MPN檢索表。 結果報告： MPN/g或MPN /mL,注意要點,MPN法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品。 “樣品的最高稀釋度，能達到獲得陰性終點”的理解： -盡可能避免1100MPN/g或ml的出現(xiàn)。 -方便MPN表的查找。,第三法PetrifilmTM測試片法,適用范圍,PetrifilmTM測試片法適用于肉及其制品，奶制品等。,PetrifilmTM測試片法檢驗程序,檢樣25g(mL)+225mL稀釋，勻質(zhì)，10倍系列稀釋,選擇適宜稀釋度的樣品勻液，各取1mL分別加入紙片,361,242h,判讀,沒有菌落,只有典型紫紅色菌落,將所有紫紅色菌落計數(shù)為金黃色葡萄球菌,除典型紫紅色菌落外其他顏色的菌落,加入確認反應片， 361，培養(yǎng)13h,有粉紅色菌暈的菌落計數(shù)為金黃色葡萄球菌,報告,第三法 PetrifilmTM測試片法,金黃色葡萄球菌PetrifilmTM測試片，含具有顯色功能、經(jīng)改良的Baird-Parker培養(yǎng)基，對金黃色葡萄球菌的生長有很強的選擇。金黃色葡萄球菌在測試片上生成為暗紫紅色的菌落，可以直接完成鑒定和計數(shù)。,金黃色葡萄球菌PetrifilmTM確認反應片,金黃色葡萄球菌PetrifilmTM確認反應片含有顯色劑和耐熱去氧核糖核酸(DNA)，金黃色葡萄球菌可生產(chǎn)耐熱DNA酶，此酶與反應片上的顯色劑反應，形成粉紅色環(huán)。而其他細菌因不產(chǎn)生耐熱DNA酶沒有該反應。但在葡萄球菌屬中，豬葡萄球菌、中間葡萄球菌也會產(chǎn)生陽性反應。,計數(shù)與結果報告,菌落計數(shù): 到培養(yǎng)時間應立即計數(shù)，可目視、或用放大鏡輔助計數(shù)； 選取菌落數(shù)在15150之間的測試片作為計數(shù)標準。 選擇菌落數(shù)在15150之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之； 如果所有稀釋度測試片上的菌落數(shù)都小于15， 則計數(shù)稀釋度最低的測試片上的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之；,如果所有稀釋度的測試片上均無菌落生長，則以()1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之； 如果最高稀釋度的菌落數(shù)大于150個時，計數(shù)最高稀釋度的測試片上的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之，計數(shù)菌落數(shù)大于150個的測試片時，可計數(shù)一個或兩個具有代表性的方格內(nèi)的菌落數(shù)，換算成單個方格內(nèi)的菌落數(shù)后乘以30即為測試片上估算的金黃色葡萄球菌數(shù) (圓形生長面積為30 cm2)。 最終菌落濃度的單位以”cfu/g (mL