綜述—試論述噬菌體溶菌機制的研究進展

試論述噬菌體溶菌機制的研究進展 姓名：caohaichuan 學號： 專業(yè)：微生物學 摘 要：噬菌體（bacteriophage，簡稱 phage）主要通過抑制宿主 細胞細胞壁的合成導(dǎo)致宿主菌溶解及通過溶解酶作用破壞宿主細胞 壁，以大腸桿菌單鏈 RNA 噬菌體 Q，真菌線狀單鏈 DNA（ssDNA） 微小病毒 X174 噬菌體和單鏈 DNA 噬菌體 MS2 及大腸桿菌 噬菌 體為例，分別論述噬菌體的兩種溶菌機制。 噬菌體 S 和 R 基因分 別編碼穿孔素（holin）和內(nèi)溶素（endolysin），形成穿孔素-內(nèi)溶 素（holin-endolysin）系統(tǒng)達到溶解宿主菌的目的。進一步揭示該 系統(tǒng)溶解基因的協(xié)調(diào)作用及相關(guān)基因的調(diào)控機制。 關(guān)鍵詞：噬菌體；溶解酶；細胞壁；穿孔素；內(nèi)溶素 噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的 總稱，因部分能引起宿主菌裂解，故稱為噬菌體。它在宿主菌內(nèi)可 高效復(fù)制,迅速地形成數(shù)百個子代噬菌體顆粒,每一個子代顆粒具備 相同的侵襲、繁殖能力,重復(fù)4個感染周期后,一個噬菌體顆?？蓺?數(shù)10 億個細菌,這是噬菌體極具特色的一種生物學特性。其溶菌機 制主要包括兩個方面，一個是通過抑制宿主細胞細胞壁的合成導(dǎo)致 宿主菌溶解；另外一個方面是通過溶解酶作用導(dǎo)致宿主細胞壁的破 壞。這兩個方面都能夠有效的進行破壞宿主菌細胞壁的合成，從而 達到溶菌的目的。基于噬菌體溶菌機制，在治療細菌感染、消毒以 及反生物武器等領(lǐng)域具有良好應(yīng)用前景，本文從以下幾個方面綜述 其最新研究進展。 1. 噬菌體溶菌機制的研究 噬菌體包括兩種類型，溫和噬菌體和烈性噬菌體。其中具有溶 菌作用的是烈性噬菌體，亦稱毒性噬菌體。噬菌體對其宿主菌的溶 解是由專一溶解基因編碼的特異性蛋白或噬菌體自身蛋白介導(dǎo)的溶 解系統(tǒng)統(tǒng)一完成的，這一溶解系統(tǒng)具有一套完整、精密的調(diào)節(jié)機制 和控制體系，而且其作用基質(zhì)多集中宿主菌的細胞壁上，噬菌體蛋 白通過不同的途徑影響和破壞宿主菌胞壁質(zhì)的生物合成及正常結(jié)構(gòu)， 從而導(dǎo)致噬菌體宿主菌細胞損傷、死亡。烈性噬菌體成功吸附宿主 菌后，就開始穿入溶菌過程，因其結(jié)構(gòu)和基因控制的不同而顯示出 不同的溶菌機制。 1.1. 通過抑制宿主細胞細胞壁的合成導(dǎo)致宿主菌溶解 該機制實際上是小基因組噬菌體的溶菌機制。缺乏溶壁酶的小 基因組噬菌體利用多肽在不同階段抑制宿主菌的胞壁質(zhì)合成酶，從 而在不同階段溶解宿主菌。例如大腸桿菌單鏈RNA噬菌體Q沒有獨 立的溶解基因，主要利用衣殼蛋白A2參與宿主菌的溶解。A2蛋白是一 種多功能的單拷貝蛋白質(zhì), 有吸附性菌毛、保護噬菌體RNA抵抗外部 核糖核酸酶( RNA酶)、溶解宿主菌的作用。A2蛋白抑制宿主菌胞壁 質(zhì)生物合成關(guān)鍵步驟的催化劑MurA，通過靶向正常細胞胞壁生物合 成途徑中的不同階段的酶而導(dǎo)致新合成的肽聚糖降解，從而逐漸使 宿主細胞溶解。 此外，真菌線狀單鏈DNA（ssDNA）微小病毒X174噬菌體只含 有10個基因，其溶菌機制是產(chǎn)生單一的溶解蛋白E。蛋白E由必須基 因D編碼，有91個包含在+1區(qū)的密碼子讀框中，可有效抑制肽聚糖合 成酶Mra Y1，Mra Y是介導(dǎo)肽聚糖合成中最初的脂質(zhì)聯(lián)合的催化劑。 研究表明，E蛋白還可以抑制特殊的肽聚糖前體物質(zhì)二氨基庚酸進入 細胞壁2，從而抑制真菌細胞壁的合成，可代替抗生素抑制真菌細 胞。類似的還有單鏈DNA噬菌體MS2，該噬菌體只含有4個基因，其中 溶解基因L重疊在宿主菌表膜，而且在+1區(qū)復(fù)制，編碼一個75個氨基 酸的膜蛋白介導(dǎo)宿主菌的溶解。 1.2. 通過溶解酶作用導(dǎo)致宿主細胞壁的破壞 除了絲狀噬菌體以外(絲狀噬菌體并不裂解宿主菌,而是以分泌 形式擴增噬菌體病毒顆粒) ,幾乎所有的噬菌體都是通過引起宿主細 胞溶解來結(jié)束它們的感染周期的3。其中雙鏈DNA噬菌體的溶菌方式 就是利用溶壁酶溶解、破壞其宿主菌的細胞壁而達到裂解細菌的目 的。溶壁酶可以打開細胞壁上各種分子的共價鍵使細胞壁水解,從而 殺死細菌。通過對大腸桿菌的噬菌體研究發(fā)現(xiàn),噬菌體具有4個 溶解基因，包括S、R、RZ和RZ1 ,它們積聚在單一晚期基因啟動子 pR溶解片夾下游的重疊簇中4。然而，噬菌體的4個溶解基因中 只有S和R是宿主細胞溶解所必需的,S和R編碼的穿孔素和內(nèi)溶素兩種 蛋白能夠直接導(dǎo)致宿主菌的溶解5。而RZ和RZ1只有當外膜被毫克分 子濃度的二價陽離子固定后才具溶解作用。 基因S編碼的產(chǎn)物為穿孔素，其作用是在細胞膜脂質(zhì)雙分子層上 形成跨膜“孔洞”，使基因R產(chǎn)生的酶可以穿過細胞膜，到達細胞壁， 達到降解細胞壁的目的6。基因R編碼產(chǎn)物為內(nèi)溶素，是一種可溶解 的細胞質(zhì)糖基轉(zhuǎn)移酶，也是一種能夠水解細胞壁的溶壁酶，這種可 溶性蛋白能破壞3類不同的肽聚糖多聚體的共價鍵，具有溶壁活性7。 在宿主菌內(nèi)，S或R單一作用時，對宿主菌無明顯溶菌功效，只有基 因S和基因R協(xié)同作用時，才能夠作用于肽聚糖，破壞細胞壁，是宿 主菌溶解，即穿孔素-內(nèi)溶素系統(tǒng)。噬菌體就是利用穿孔素-內(nèi)溶 素系統(tǒng)溶解宿主菌的。 2. 穿孔素-內(nèi)溶素系統(tǒng) 穿孔素-內(nèi)溶素系統(tǒng)能夠破壞宿主菌細胞壁，達到溶菌目的，但 是，由于內(nèi)溶素缺少一個單一序列，因此內(nèi)溶素必須與S基因協(xié)同作 用，才能作用于肽聚糖3。穿孔素-內(nèi)溶素系統(tǒng)溶菌機制主要是從宿 主菌內(nèi)部發(fā)揮溶菌作用，噬菌體進侵入細菌體內(nèi)，依賴宿主菌的蛋 白質(zhì)等物質(zhì)合成大量的子代噬菌體，同時釋放大量的穿孔素和內(nèi)溶 素。然而大部分內(nèi)溶素因缺少信號肽序列，從而無法穿過細胞膜， 所以內(nèi)溶素需要依靠穿孔素，才能穿過細胞膜，到達細胞壁。但是， 在革蘭氏陽性菌中，由于其細胞壁肽聚糖層沒有外膜的保護，內(nèi)溶 素可以從外部直接作用于細胞壁的肽聚糖層，從而不依賴穿孔素， 就能直接溶解細菌。 2.1. 穿孔素 穿孔素是由基因S編碼的，基因S是由一個含有107個密碼子組成 的開放閱讀框（open reading frame,0RF），其顯著特征就是具有 雙起始基序特征，能夠編碼2個具有對抗功能的內(nèi)膜蛋白，S105和 S1078。S105含有105個氨基酸，具有跨膜結(jié)構(gòu)，并發(fā)揮穿孔素作 用，在脂質(zhì)雙分子層上形成“孔洞”，以便保證內(nèi)溶素能夠順利通 過細胞膜，作用于細胞壁。S107是一種抗穿孔素，可特異性抑制穿 孔素的功能4。當穿孔素作用于細胞膜時，S107能夠調(diào)節(jié)S105功能， 防止過早形成跨膜“孔洞”。 2.2. 內(nèi)溶素 所有的雙鏈DNA噬菌體編碼至少一種胞壁水解酶，即內(nèi)溶素，在 噬菌體中，內(nèi)溶素是R基因編碼的產(chǎn)物。研究證明，內(nèi)溶素具有兩 個功能域，細胞壁結(jié)合域（CBDs）和酶活性域（EADs）10。內(nèi)溶素 緊緊的結(jié)合到細胞壁的肽聚糖層上的殘基上，使細胞溶解。然而， 酶活性域依靠酶的催化機制裂解細菌肽聚糖層的特定位點，破壞肽 聚糖層結(jié)構(gòu)。來自Mathias Schmelcher等人10的研究，發(fā)現(xiàn)兩種假 單胞菌噬菌體溶菌素KZ144和EL188對革蘭氏陰性菌具有溶解作用， 并具有一個N-端CBD和一個C-端EAD的結(jié)構(gòu)元件。其中，KZ144的N-端 可以非常緊密的結(jié)合到綠膿假單胞菌的細胞壁上并且能夠識別其他 革蘭氏陰性菌的肽聚糖，破壞肽聚糖層，裂解細胞壁。然而，最近 幾年的研究主要來是針對酶的活性域進行的，來進一步揭示內(nèi)溶素 的溶菌機制。 噬菌體內(nèi)溶素至少有4種不同的胞壁水解酶活性，包括糖苷轉(zhuǎn)移 酶，溶菌酶，酰胺酶和肽鏈內(nèi)切酶。內(nèi)溶素在穿孔素的協(xié)調(diào)下，沿 著跨膜“孔洞”穿過細胞膜作用于細胞壁，其中，糖苷轉(zhuǎn)移酶和溶 菌酶攻擊細胞壁上糖苷鍵連接的氨基糖；酰胺酶和肽鏈內(nèi)切酶攻擊 寡肽交聯(lián)鏈的氨基化合物和肽鍵11。從而破壞細胞壁，溶解宿主菌， 同時釋放大量的子代噬菌體顆粒。在革蘭氏陽性菌中，由于其細胞 壁肽聚糖層沒有外膜包裹，當內(nèi)溶素從外部作用時，其能夠進入到 肽聚糖層并破壞這些微生物體。因此，噬菌體產(chǎn)生的內(nèi)溶素具有與 抗生素一樣的效果，很大程度上避免了耐藥性。然而，在革蘭氏陰 性菌中，由于肽聚糖層有一層外膜保護，內(nèi)溶素無法自行穿過外膜 到達細胞壁。因此，對于革蘭氏陰性菌來說，內(nèi)溶素的溶菌機制是 較為復(fù)雜的。 3. 小結(jié) 大腸桿菌單鏈RNA噬菌體Q，真菌線狀單鏈DNA（ssDNA）微小 病毒X174噬菌體，單鏈DNA噬菌體MS2及大腸桿菌噬菌體通過不 同的溶菌機制特異性識別不同的宿主菌，作用于肽聚糖，從而破壞 宿主菌細胞壁，達到溶菌目的。噬菌體對宿主菌的溶解是由專一的 溶解基因編碼的特異性蛋白或噬菌體自身蛋白介導(dǎo)的溶解系統(tǒng)共同 完成的，調(diào)控機制通過協(xié)調(diào)作用，有效、準確地完成溶菌過程。噬 菌體具有嚴格的宿主專一性，這就使得其在特異性殺傷宿主菌方面 具有很大優(yōu)勢。在疾病治療上，噬菌體與抗生素相比較，噬菌體不 僅能夠有效地控制疾病發(fā)生，而且還能有效避免病原體的耐藥性， 這是抗生素所不能比擬的。 噬菌體通過抑制細胞壁的合成或者通過溶壁酶作用來達到溶菌 目的，從分子水平上進行研究，主要是由一些溶菌基因編碼的特異 性蛋白協(xié)同作用，這些溶解基因編碼的蛋白可以通過某一特定機制 作用于細胞膜和細胞壁上，在文章前面提到的兩種溶解基因S和R就 是如此的，基因S編碼的蛋白穿孔素通過作用于細胞膜使其形成跨膜 “孔洞”，從而使內(nèi)溶素（基因R編碼的蛋白）能夠更好的穿過細胞 膜并作用于細胞壁的肽聚糖層，最終溶解宿主菌?；騍編碼兩個具 有對抗作用的內(nèi)膜蛋白，S105和S107,S105蛋白的作用是引導(dǎo)內(nèi)溶素 穿過細胞膜，而S107的作用則是調(diào)節(jié)S105蛋白出現(xiàn)的時間，防止穿 孔素過早的形成跨膜“孔洞”，保證精確地調(diào)節(jié)穿孔素-內(nèi)溶素系統(tǒng)， 并有效溶解宿主菌。 由于噬菌體具有嚴格的宿主專一性，只能對特定的病原體產(chǎn)生 作用，噬菌譜較窄。隨著對噬菌體分子結(jié)構(gòu)和基因功能的深入了解， 對其溶菌機制的認識將會更加深入和明確，以便解決噬菌體噬菌譜 較窄以及探索噬菌體溶菌機制的共同途徑等問題。為了實現(xiàn)噬菌體 在抗治療細菌感染、消毒和反生物武器及解決抗生素耐藥性等方面 的廣泛應(yīng)用，我們必須探索一種新型的，噬菌譜較廣的溶菌機制。 噬菌體溶菌機制的深入研究具有重大意義及廣闊的應(yīng)用前景，更是 我們今后研究的方向。 參考文獻 1F. 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