質(zhì)粒DNA的提取及濃度檢測(cè).ppt

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 任 課 教 師: 張淑平(62773628) 李英姿 (62781668) 助教博士生: 李穎華 (62773628) 黃 波 (62783845) 唐 穎 (62772214),課程基本情況簡(jiǎn)介/質(zhì)粒DNA提取,基本技術(shù),核酸 的分離純化(Isolation and Purification of DNA and RNA)； 電泳技術(shù)(Gel Electrophoresis)； 基因重組、亞克隆及表達(dá)（Gene Recombination, Subcloning and Expression)； PCR技術(shù) ( Polymerase Chain Reaction)； 分子雜交及互作(Molecular Hybridization and Interaction)； DNA測(cè)序技術(shù)(DNA Sequencing)； 基因功能的研究技術(shù)(Gene Function)； 基因的染色體定位（Localization of Gene to Chromosomes） 生物芯片技術(shù)（Bio-Chips or Bioarray) ,以完整、常用、重要為原則，經(jīng)典與先進(jìn)技術(shù)相結(jié)合，同時(shí)介紹相關(guān)知識(shí)，盡量讓學(xué)生在有限的學(xué)時(shí)內(nèi)掌握更多的分子生物學(xué)技術(shù)以及相關(guān)的知識(shí)。 我們的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)計(jì)從整體上可以說是一個(gè)完整的大實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樽允贾两K，各實(shí)驗(yàn)之間相互連貫，要求學(xué)生每一次實(shí)驗(yàn)既得到本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，同時(shí)也為下一次更深入的實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備（提供實(shí)驗(yàn)材料）。,課程基本情況：,實(shí)驗(yàn)安排與實(shí)驗(yàn)報(bào)告,注：實(shí)驗(yàn)報(bào)告分為12、3、4 (實(shí)驗(yàn)6的設(shè)計(jì)) 、45 、 6、7、89、10,(6)重組克隆的鑒定實(shí)驗(yàn)的幾點(diǎn)說明,手工提取質(zhì)粒方法將在“實(shí)驗(yàn)一”中講到，“實(shí)驗(yàn)六”上課時(shí)間將提前到下午1:00； 接種培養(yǎng)將在“重組克隆的鑒定”實(shí)驗(yàn)課的前一天的晚上進(jìn)行（7:30-9:00pm? 9:00-10:20?）； 助博將準(zhǔn)備好試管LB培養(yǎng)基，用前別忘了加你需要的抗生素; 提供的酶包括EcoRI, XhoI, BamHI, HindIII, XbaI。自己選擇正確的酶使用。 。,實(shí)驗(yàn)方案由學(xué)生自己設(shè)計(jì)！要提前進(jìn)行。 (目的意義、材料和方法、結(jié)果及討論),以下幾點(diǎn)請(qǐng)注意：,實(shí)驗(yàn)操作基本要求,認(rèn)真預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)； 按照操作規(guī)程使用儀器設(shè)備, 注意個(gè)人以及公共設(shè)施安全； 節(jié)約實(shí)驗(yàn)試劑及材料； 實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)器皿清洗干凈，并清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面； 按時(shí)、按質(zhì)、按量完成實(shí)驗(yàn)工作，不遲到，不早退； 實(shí)事求是、認(rèn)真而及時(shí)地寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。,評(píng)分考慮,平時(shí)實(shí)驗(yàn)課成績(jī) 70%； 綜合技術(shù)測(cè)驗(yàn) 30%。,實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及濃度檢測(cè),目的與要求 通過質(zhì)粒的一些特性、質(zhì)粒DNA的提取、測(cè)定，學(xué)習(xí)用堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法，了解用分光光度計(jì)測(cè)定DNA含量的方法。,2. 相關(guān)知識(shí)及原理,質(zhì)粒(Plasmid) ： 獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子。 存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。,DNA超螺旋結(jié)構(gòu),細(xì)菌質(zhì)粒: 細(xì)菌質(zhì)粒是用的最多的質(zhì)粒類群，其大小從1Kb-200Kb，它們復(fù)制時(shí)利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身基因組DNA的同一組酶系。,嚴(yán)謹(jǐn)型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個(gè)細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝； 松馳型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個(gè)細(xì)胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會(huì)使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。,質(zhì)粒類型：,載體(Vector)： 用于攜帶重組DNA，并且能夠使外源DNA一起復(fù)制與表達(dá)的質(zhì)粒(運(yùn)載工具)。,具備的條件： 易于鑒定； 在受體細(xì)胞中可以獨(dú)立復(fù)制； 易于篩選； 易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。,抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) 啟始復(fù)制子（ori, Origin of replication)； 多克隆位點(diǎn)(MSC, Multiple cloning site or polylinker)； 標(biāo)記基因(Marker gene, such as LacZ gene)。,載體的結(jié)構(gòu)：,DNA 是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致DNA的變性，如加熱、極端pH值、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使DNA復(fù)性。,原理：,SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDS處理細(xì)菌細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中同時(shí)釋放出來。釋放出來的DNA遇到強(qiáng)堿性（NaOH）環(huán)境，就會(huì)變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速?gòu)?fù)性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細(xì)胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細(xì)菌中提取出來。,細(xì)菌裂解的方法： 堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于質(zhì)粒大量提取。,測(cè)定DNA濃度的方法主要有兩種，即利用分光光度計(jì)法測(cè)定DNA的紫外光吸收值；第二種方法是測(cè)定樣品中溴化乙錠發(fā)射的熒光的強(qiáng)度來計(jì)算核酸的含量。另外還有一種用于粗略檢測(cè)DNA濃度的方法是通過凝膠電泳，與標(biāo)準(zhǔn)分子量相比較。,DNA濃度的測(cè)定：,紫外光吸收法： 因?yàn)榻M成核酸的堿基(G,A,T,C）在260nm處具有強(qiáng)吸收峰，所以通過測(cè)定260nm的吸收峰即可對(duì)DNA進(jìn)行定量。但有時(shí)也會(huì)因?yàn)樗幦芤旱膒H值不同而導(dǎo)致吸光系數(shù)的不同。因此，一般在中性pH值左右的環(huán)境中進(jìn)行測(cè)定。這種方法常用于測(cè)定比較純的樣品。,3. 材料與試劑 材料:含有質(zhì)粒pCMV-Myc-T10的大腸桿菌DH5。 pCMV-Myc是一種哺乳細(xì)胞表達(dá)載體，它含有一個(gè)N端c-Myc 尾，常用于免疫反應(yīng)的檢測(cè)和蛋白純化以及作為誘餌蛋白檢測(cè)酵母雙雜交結(jié)果。,Suitable host strains: DH5a, HB101, and other general purpose strains. Selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 mg/ml) to E. coli hosts. E. coli replication origin: pUC Copy number: 500,pCMV-Myc-T10,4. 步驟 質(zhì)粒DNA的提取 堿裂解法,溶液1GET緩沖液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。 溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3乙酸鉀溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O TE緩沖液或水（+ 20g/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70乙醇,注意： 用移液器操作時(shí)，每一步都要格外小心，特別是在加入溶液II 和III后，一定不要?jiǎng)×艺袷?，以免切碎DNA(包括質(zhì)粒DNA和基因組DNA)！,培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1216小時(shí); 取液體培養(yǎng)液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min離心1min，去掉上清液，加入100l溶液1(GET) ，充分混勻放置3-5分鐘; 加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（變性液），加蓋顛倒6-7次使之混勻，冰上放置5min;,質(zhì)粒小量提取的方法（手工提?。?加入150 l乙酸鉀溶液(溶液II)，加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置5min; 用臺(tái)式高速離心機(jī)，10000r/min離心7min，上清移入另一干凈離心管，并加1ml 100乙醇混勻，12000r/min離心5min，棄去上清液; 沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次， 12000r/min離心5min，棄去上清液，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥; 加入30-50l含有20g/ml RNase的滅菌蒸餾水或TE 緩沖液溶解提取物，室溫放置15-30min，使DNA充分溶解(有時(shí)需要酚:氯仿抽提); 將分離出的質(zhì)粒DNA置于-20保存?zhèn)溆谩?Biodev（博大泰克）質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校╬lasmid rapid isolation kit）,堿裂解法；離心柱結(jié)構(gòu)；特殊硅基質(zhì)吸附材料。,使用前按說明再溶液I中加入RNase；向洗脫液中按1:3的比例加入無水乙醇。,操作步驟,收集1.53ml菌液沉淀于1.5ml離心管中。加入100l溶液1，振蕩至徹底懸浮。 為了獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，培養(yǎng)細(xì)菌的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般為12小時(shí)； 細(xì)菌沉淀中加入溶液1后，一定要徹底懸浮，否則抽提質(zhì)粒DNA的純度及得率會(huì)大大降低 加入150l溶液2，立即輕柔顛倒離心管數(shù)次，使菌體充分裂解，裂解后的菌體變得清亮。隨后將離心管冰上放置12分鐘（時(shí)間勿超）。,加入150l溶液3，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，室溫放置5分鐘。12000rpm離心12分鐘。 要獲得更好得質(zhì)粒提取效果，請(qǐng)于步驟2和步驟3后，冰上放置。 將420l結(jié)合緩沖液加入離心柱中。然后將步驟3的上清加入離心吸附柱中（盡量去除雜質(zhì)），混勻。12000rpm離心30秒鐘。倒掉廢液收集管中得溶液。 加入750l洗滌緩沖液于離心吸附柱中，12000rpm離心1分鐘。,濃縮漂洗液配置成工作濃度時(shí)，一定要使用無水乙醇，否則，吸附于硅基質(zhì)材料上的DNA可能被洗脫下來，影響回收效率。 A.重復(fù)步驟5一次；B.隨后，再次于12000rpm空管離心2分鐘，盡量除去漂洗液。 洗涕時(shí)（即步驟5和6）一定要盡量除去漂洗液，否則，漂洗液中得乙醇會(huì)抑制后續(xù)得各種酶促反應(yīng)。必要時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或者用Tip頭吸凈。,如果含有較多得蛋白、鹽類等雜質(zhì)，可多洗滌幾次。 小心取出離心吸附柱，將其套入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中。加入50l洗脫緩沖液，室溫放置5分鐘后，12000rpm離心1分鐘。 洗脫緩沖液一定要加入離心吸附柱中硅基質(zhì)材料得正中，以確保被吸附在硅基質(zhì)材料中得DNA都能被洗脫下來。為提高回收效率，可適當(dāng)加大洗脫液體積及洗脫次數(shù)。,為了充分除盡RNA的污染，可在提取的質(zhì)粒中加入0.5lRNaseA（10mg/ml）。這并不影響其他后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所提取的質(zhì)粒的純度足以用來作為測(cè)序模板和其他酶促反應(yīng)。 若提取的質(zhì)粒大于10Kb，在加入洗脫緩沖液后，可在70水浴中放置35分鐘，以確保質(zhì)粒DNA的完全洗脫。,B. 用分光光度計(jì)法定量DNA 取2l提取的質(zhì)粒DNA，加入98l蒸餾水對(duì)待測(cè)DNA樣品做1:50(或更高倍數(shù)的稀釋); 蒸餾水作為空白,在波長(zhǎng)260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)讀數(shù)至零。,加入DNA稀釋液，測(cè)定260nm 及280nm的吸收值。260nm 讀數(shù)用于計(jì)算樣品中核酸的濃度，OD260值為1相當(dāng)于約50g /ml雙鏈DNA，33g /ml單鏈。可根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)的比值（OD260/OD280）估計(jì)核酸的純度。一般DNA的純品，其比值為1.8，低于此值說明有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染。,記錄OD值，通過計(jì)算確定DNA濃度或純度，公式如下: dsDNA=50(OD260) 稀釋倍數(shù) 以上濃度單位為g