反義RNA的原理及其應用.ppt

反義RNA的原理及其應用實例,制作人：余萍,反義RNA,反義RNAA( a n t i s e n s e R N A）：一種本身缺乏編 碼能力， 但能與特異靶 R N A( 主要是mR N A) 互補的 R NA分子， 它可通過配對堿基間氫鍵作用與靶 R N A的特定互補區(qū)域結合形成雙鏈復合物， 抑制靶 RNA的功能， 從而調控基因的正常表達 。,基本原理,反義 R N A技術的基本原理：利用自然存在的或人工合 成的反義 RNA， 通過基因重組技術反向插入到合適 的表達載體形成重組DN A， 然后轉染受體細胞， 則 這一反插入的序列就會隨細胞周期產(chǎn)生大量反義 R NA， 對基因的表達進行調控， 從而抑制、封閉或破壞靶基因的表達。,一、復制水平,DNA復制 中的作用 反義 R N A作為D N A復制的抑制因子， 與引物 R N A結合或作用于引物前體而抑制 D N A復制，從 而降低D N A的復制效率。E c o l i 的 c o l e 1 質粒復 制的前提是合成適當?shù)腞 N A( R N A) ， 它自動折疊 后與 D N A模板結合形成 D N A復制的引物， 從復制起始點上游一4 4 5 b p 處開始， 以另一 D N A為模板反 向轉錄的RN A I正好與 RNA1 I的結合， 阻止了正 常引物的產(chǎn)生， 從而干擾復制的進行。,作用機制,反義 R N A的作用機制主要表現(xiàn)在D N A復制、 轉錄 和翻譯 3個水平上。,二、轉錄水平,轉錄及轉錄后水平的作用 反義 R NA與 m RNA 5 末端互補結合， 阻斷帽 子結構形成； 作用于外顯子和內(nèi)含子的連接區(qū)， 阻礙前 m R N A剪接； 作用于 p o l y A形成位點， 阻礙 mRN A的成熟及其向胞漿轉運。在 c r p 基因的t i c R NA ( t r a n s c r i p t i o n i n h i b i t o r y c omp l e me n t a r y RNA) 負 向 自我調控中， t i c R N A與 e r p m R N A的 5 端結合， 形 成類似于R N A聚合酶識別的轉錄終止信號的二級 結構， 以反式作用對轉錄過程本身進行調控 J,三、翻譯水平,翻譯水平的作用 反義 R NA可直接與 m R N A的 S D序列( 含 R B S ) 或編碼區(qū)( 主要是 A U G) 結合， 從空間上直接 阻止核糖體的正常結合或可直接降解靶 mR N A。 反義R N A與 m R N A在 S D序列配對形成吻觸復合體或在互補區(qū)段結合形成 R N AR N A雙鏈結構，從而調控翻譯的進行。在真核生物細胞中有許多 R N A在翻譯水平上表現(xiàn)反義R N A的功能。如雞胚 胎肌漿中存在的富含 U的小分子 R N A稱為 t c RNA， 它們可以與肌球蛋白重鏈的 RN A的 p o l y A尾雜交而抑制正常的翻譯過程。A u d r e y等 J 的研究表明 F GFAS R NA在翻譯過程能有效地抑制F GF一2在哺乳動物細胞中的表達。,反義 RNA的重組 DNA中只有啟動子及終止子， 當轉染細胞后， 重組 D N A能 自動表達反義R N A， 并且重組 D NA自身可以整合到宿主的基因組 D NA中， 或作為“ 附加體” 長期存在。在原核細胞中， 反義 R N A以針對 S D序列效果最好， 而在真核細胞中以5 端非編碼區(qū)為標靶最有效。,反義RNA的應用,隨著基因組草圖的完成, 人們研究的重點已轉向對基因功能的研究, 反義核酸技術無疑為這項宏偉的工程提供了一種有力的工具。,抗病毒作用,病毒是 對人 和動植 物危 害極大 的病原體 ,然而對病毒引起 的疾病的治療 ,目前 尚無特效藥物與方法。反義 R N A 卻能特異性阻斷病毒基因表達 和抑制病毒的復制 ,從而激起許多科學工作者去探索反義 R N A 治療病毒性疾病的有效方法?？共《痉戳x R N A 技術是將特定的病毒基因反 向插人到表達險載體中,以構建反義 R N A 表達載體 ,再將重組體導人真核細胞(病毒宿主細胞)中表達特異性反義 R N A,從而抑制特異有 害基 因的表達或抑制病毒復制。文獻報道 ,運用反義 R N A技術 己經(jīng)成功地抑制疤病毒 、流感病毒 、人類免疫缺陷病毒 (H I V )等對培養(yǎng)的組織細胞的侵襲。用針對植物病 毒的反義 R N A 已培育出具有抗病毒能力 的植 物。,姚志強等針對不同靶位設計了1 0 段互補反義核酸( D NA片段) ， 經(jīng)模型篩選發(fā)現(xiàn)針對S基因起始區(qū)、 S P 2增強子帽區(qū)和 p o l y A信號編碼區(qū)的a s O Ns 作用最強， 揭示反調節(jié)基因轉錄/翻譯起始區(qū)的反義核酸具有明顯的抗病毒作用。 G a b o r 等( 1 9 9 8 ) 使用內(nèi)源性表達抗HI V一1po1 vif和 enr 基因，以及 3 L T R序列的反義 R N A方案， 構建了 Mu L V L T R啟動子逆轉錄病毒重組質粒， 轉錄 C D 4 淋巴細胞系， 結果表明反義 R N A能高效地穩(wěn)定表達， 反義 e n v R N A能夠最有效地抑制HI V一1 的復制， 并且反義 p o l R NA使P 2 4 抗原減少 了 1 0 01 0 0 0倍。 另外， 國內(nèi)外在應用反義R N A技術培育抗病( 如豬瘟、抗雞馬立克氏病等) 動物品系方面也取得比較明顯的進展。,反義 R N A 的抗腫瘤作用,腫瘤 的發(fā)生是多因素引起的,其中細胞癌基因或/和某些病毒癌基因的異常激活和過度表達是導致細胞惡變的原因之一。如何控制細胞有害基 因的表達而在基因水平上治療惡性腫瘤呢? 在目前基 因治療的眾多方案中,反義R N A 技術是 最具吸引力的手段之一?？梢栽O計出針對腫瘤細胞 的癌基因、突變基因 、非正常表達基因及某些腫瘤相關病毒的癌基因反義 R N A,以阻斷這些有害基因的表達 ,達到治療腫瘤的目的。許多證據(jù)表明,反義R N A 可使腫瘤 細胞的表型逆轉 ,形態(tài)變化 ,增殖速度減慢,生存期縮短,軟瓊脂中克隆能力下降及體內(nèi)成瘤能力減弱等,而不影響細 胞生存所必需的其它基因的表達。,Tr o j a n 等利用 E B 病毒游離體表達載體克隆胰島素樣生 長因子 ( I G F )反 義基因 ,將此重組體轉染 大鼠 C 6 細胞系,在大鼠模型上實現(xiàn)了膠質母 細胞瘤的基因治療和預防。 我國學者趙曉航等報道互補于 G r n yc基 因第二外顯子及其兩側序列的反義 R N A 能特異性誘發(fā)人食管癌細胞程序性死 亡。 黃 賢 明等利用 G e t s一2、G m y c和 N一r as三個癌基 因聯(lián)合反義 R N A 能使人肝 癌細 胞 株 S M M C 77 2 1 生長速率下降約70 %,軟瓊脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力顯著下降,提示針對多個癌基 因的聯(lián)合反義R N A 可能給腫瘤基因治療提供新的途徑。,反義 RNA技術還可用于腸道疾病( R o t b a r t e t a 1 ， 1 9 8 8 ) 、 心血管疾病、 B 一地中海貧血、 調節(jié)衰弱心臟中肌細胞的 C a2 泵體內(nèi)平衡u 、 G蛋白防止高血壓、 肝纖維化等多種疾病的研究。,參考文獻 1 張西鋒，沈偉,潘慶杰,白丁平，耿社 民反義 R NA技術原理及其在疾病治療中的應用 J .萊陽農(nóng)學院