GB5009.185-2016食品安全國家標準食品中展青霉素的測定.pdf

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準G B5 0 0 9.1 8 52 0 1 6食品安全國家標準食品中展青霉素的測定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會國 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B5 0 0 9.1 8 52 0 1 6 前 言 本標準代替G B/T5 0 0 9.1 8 52 0 0 3 蘋果和山楂制品中展青霉素的測定 、NY/T1 6 5 02 0 0 8 蘋果及山楂制品中展青霉素的測定 高效液相色譜法 、S N/T2 0 0 82 0 0 7 進出口果汁中棒曲霉毒素的檢測方法 高效液相色譜法 和S N/T2 5 3 42 0 1 0 進出口水果和蔬菜制品中展青霉素含量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法與高效液相色譜法 和S N/T1 8 5 92 0 0 7 飲料中棒曲霉素和5 -羥甲基糠醛的測定方法 液相色譜-質譜法和氣相色譜-質譜法 中展青霉素部分。本標準與G B/T5 0 0 9 .1 8 52 0 0 3相比, 主要變化如下: 標準名稱修改為“ 食品安全國家標準 食品中展青霉素的測定” ; 增加了同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質譜法; 增加了液相色譜法; 擴大了適用范圍; 刪除了薄層色譜法。G B5 0 0 9.1 8 52 0 1 61 食品安全國家標準食品中展青霉素的測定1 范圍本標準規(guī)定了食品中展青霉素的測定方法。本標準第一法為同位素稀釋-液相色譜串聯(lián)質譜法, 適用于蘋果和山楂為原料的水果及其制品、 果蔬汁類和酒類食品中展青霉素含量的測定。本標準第二法為高效液相色譜法, 適用于蘋果為原料的水果及其果蔬汁類和酒類食品中展青霉素含量的測定。第一法 同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質譜法2 原理樣品( 濁汁、 半流體及固體樣品用果膠酶酶解處理) 中的展青霉素經(jīng)溶劑提取, 展青霉素固相凈化柱或混合型陰離子交換柱凈化、 濃縮后, 經(jīng)反相液相色譜柱分離, 電噴霧離子源離子化, 多反應離子監(jiān)測檢測, 內標法定量。3 試劑和材料除非另有說明, 本方法使用的試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。3.1 試劑3.1.1 乙腈(CH3C N) : 色譜純。3.1.2 甲醇(CH3OH) : 色譜純。3.1.3 乙酸(CH3C OOH) : 色譜純。3.1.4 乙酸銨(CH3C OONH4) 。3.1.5 果膠酶( 液體) : 活性15 0 0U/g,28避光保存。3.2 試劑配制3.2.1 乙酸溶液: 取1 0m L乙酸加入2 5 0m L水, 混勻。3.2.2 乙酸銨溶液(5mm o l/L) : 稱取0.3 8g乙酸銨, 加10 0 0m L水溶解。3.3 標準品3.3.1 展青霉素標準品(C7H6O4,C A S號:1 4 9 - 2 9 - 1) : 純度9 9%, 或經(jīng)國家認證并授予標準物質證書的標準物質。3.3.2 1 3C7-展青霉素同位素內標:2 5g/m L, 或經(jīng)國家認證并授予標準物質證書的標準物質。G B5 0 0 9.1 8 52 0 1 62 3.4 標準溶液配制3.4.1 標準儲備溶液(1 0 0g/m L) : 用2m L乙腈溶解展青霉素標準品1.0m g后, 移入1 0m L的容量瓶, 乙腈定容至刻度。溶液轉移至試劑瓶中后, 在-2 0 下冷凍保存, 備用, 有效期6個月。展青霉素標準溶液濃度的標定參見附錄A。3.4.2 標準工作液(1g/m L) : 準確吸取1 0 0L經(jīng)標定過的展青霉素標準儲備溶液至1 0m L容量瓶中, 用乙酸溶液定容至刻度。溶液轉移至試劑瓶中后, 在4下避光保存, 有效期3個月。3.4.3 1 3C7-展青霉素同位素內標工作液(1g/m L) : 準確移取展青霉素同位素內標(2 5g/m L)0.4 0m L至1 0m L容量瓶中, 用乙酸溶液定容。在4下避光保存, 備用,3個月內有效。3.4.4 標準系列工作溶液: 分別準確移取標準工作液適量至1 0m L容量瓶中, 加入5 0 0L1.0g/m L的同位素內標工作液, 用乙酸溶液定容至刻度, 配制展青霉素濃度為5n g/m L、1 0n g/m L、2 5n g/m L、5 0n g/m L、1 0 0n g/m L、1 5 0n g/m L、2 0 0n g/m L、2 5 0n g/m L系列標準溶液。4 儀器和設備4.1 液相色譜-質譜聯(lián)用儀: 帶電噴霧離子源。4.2 勻漿機。4.3 高速粉碎機。4.4 組織搗碎機。4.5 渦旋振蕩器。4.6 p H計: 測量精度0.0 2。4.7 天平: 感量為0.0 1g和0.0 0 00 1g。4.8 5 0m L具塞P V C離心管。4.9 離心機: 轉速60 0 0r/m i n。4.1 0 展青霉素固相凈化柱( 以下簡稱凈化柱) : 混合填料凈化柱M y c o s e pTM2 2 8或相當者。4.1 1 混合型陰離子交換柱:N -乙烯吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物基質- CH2N(CH3)2C4H9+為填料的固相萃取柱(6m L,1 5 0m g) 或相當者。使用前分別用6m L甲醇和6m L水預淋洗并保持柱體濕潤。4.1 2 1 0 0m L梨形燒瓶。4.1 3 固相萃取裝置。4.1 4 旋轉蒸發(fā)儀。4.1 5 氮吹儀。5 分析步驟5.1 試樣制備5.1.1 液體樣品( 蘋果汁、 山楂汁等)樣品倒入勻漿機中混勻, 取其中任意的1 0 0g( 或m L) 樣品進行檢測。酒類樣品需超聲脫氣1h或4低溫條件下存放過夜脫氣。5.1.2 固體樣品( 山楂片、 果丹皮等)樣品用高速粉碎機將其粉碎, 混合均勻后取樣品1 0 0g用于檢測。果丹皮等高黏度樣品經(jīng)液氮凍干后立即用高速粉碎機將其粉碎, 混合均勻后取樣品1 0 0g用于檢測。G B5 0 0 9.1 8 52 0 1 63 5.1.3 半流體( 蘋果果泥、 蘋果果醬、 帶果粒果汁等)樣品在組織搗碎機中搗碎混勻后, 取1 0 0g用于檢測。5.2 試樣提取及凈化5.2.1 混合型陰離子交換柱法5.2.1.1 試樣提取5.2.1.1.1 澄清果汁稱取2g試樣( 準確至0.0 1g) , 加入5 0L同位素內標工作液混勻待凈化。5.2.1.1.2 蘋果酒稱取1g試樣( 準確至0.0 1g) , 加入5 0L同位素內標工作液, 加水至1 0m L混勻后待凈化。5.2.1.1.3 固體、 半流體試樣稱取1g試樣( 準確至0.0 1g) 于5 0m L離心管中, 加入5 0L同位素內標工作液, 靜置片刻后, 再加入1 0m L水與7 5L果膠酶混勻, 室溫下避光放置過夜后, 加入1 0.0m L乙酸乙酯, 渦旋混合5m i n,在60 0 0r/m i n下離心5m i n, 移取乙酸乙酯層至1 0 0m L梨形燒瓶。再用1 0.0m L乙酸乙酯提取一次,合并兩次乙酸乙酯提取液, 在4 0水浴中用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至干, 以5.0m L乙酸溶液溶解殘留物, 待凈化處理。5.2.1.2 凈化將待凈化液轉移至預先活化好的混合型陰離子交換柱中, 控制樣液以約3m L/m i n的速度穩(wěn)定過柱。上樣完畢后, 依次加入3m L的乙酸銨溶液、3m L水淋洗。抽干混合型陰離子交換柱, 加入4m L甲醇洗脫, 控制流速約3m L/m i n, 收集洗脫液。在洗脫液中加入2 0L乙酸, 置4 0下用氮氣緩緩吹至近干, 用乙酸溶液定容至1.0m L, 渦旋3 0s溶解殘留物,0.2 2m濾膜過濾, 收集濾液于進樣瓶中以備進樣。按同一操作方法做空白試驗。5.2.2 凈化柱法5.2.2.1 試樣提取5.2.2.1.1 液體試樣稱取4g試樣( 準確至0.0 1g) 于5 0m L離心管中, 加入2 5 0L同位素內標工作液, 加入2 1m L乙腈, 混合均勻, 在60 0 0r/m i n下離心5m i n, 待凈化。5.2.2.1.2 固體、 半流體試樣稱取1g試樣( 準確至0.0 1g) 于5 0m L離心管中, 加入1 0 0L同位素內標工作液, 混勻后靜置片刻, 再加入1 0m L水與1 5 0L果膠酶溶液混勻, 室溫下避光放置過夜后, 加入1 0.0m L乙酸乙酯, 渦旋混合5m i n, 在60 0 0r/m i n下離心5m i n, 移取乙酸乙酯層至梨形燒瓶。再用1 0.0m L乙酸乙酯提取一次, 合并兩次乙酸乙酯提取液, 在4 0水浴中用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至干, 以2.0m L乙酸溶液溶解殘留物,再加入8m L乙腈, 混勻后待凈化。G B5 0 0 9.1 8 52 0 1 64 5.2.2.2 凈化按照所使用凈化柱的說明書操作, 將提取液通過凈化柱凈化, 棄去初始的1m L凈化液, 收集后續(xù)部分。用吸量管準確吸取5.0m L凈化液, 加入2 0L乙酸, 在4 0下用氮氣緩緩地吹至近干, 加入乙酸溶液定容至1m L, 渦旋3 0s溶解殘渣, 過0.2 2m濾膜, 收集濾液于進樣瓶中以備進樣。按同一操作方法做空白試驗。注:上述方法的樣品提取和凈化部分, 包括混合型陰離子交換柱凈化和凈化柱凈化方法, 可根據(jù)實際情況, 選擇其中一種方法即可。5.3 儀器參考條件5.3.1 色譜參考條件a) 色譜柱:T3色譜柱, 柱長1 0 0mm, 內徑2.1mm, 粒徑1.8m, 或相當者;b) 流動相:A相: 水,B相: 乙腈;c) 梯度洗脫條件:5% B(0m i n 7m i n) ,1 0 0% B(7.2m i n 9m i n) ,5% B(9.2m i n 1 3m i n) ;d) 流速:0.3m L/m i n;e) 色譜柱柱溫:3 0;f) 進樣量:1 0L。5.3.2 質譜參考條件a) 檢測方式: 多離子反應監(jiān)測(MRM) ;b) 質譜參數(shù)及離子選擇參數(shù)參見表B.1;c) 子離子掃描圖參見圖B.1和圖B.2;d) 液相色譜-質譜圖見圖B.3。5.4 標準曲線的制作將標準系列工作溶液由低到高濃度進樣檢測, 以標準系列工作溶液中展青霉素的濃度為橫坐標, 以展青霉素色譜峰與內標色譜峰的峰面積比值為縱坐標, 繪制得到標準曲線。5.5 測定將試樣溶液注入液相色譜-質譜儀中, 測得相應的峰面積, 由標準曲線得到試樣溶液中展青霉素的濃度。5.6 定性試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與相應標準色譜峰的保留時間相比較, 變化范圍在2.5%之內。每種化合物的質譜定性離子必須出現(xiàn), 至少應包括一個母離子和兩個子離子, 而且同一檢測批次,對同一化合物, 樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當?shù)臉藴嗜芤合啾? 其允許偏差不超過表1規(guī)定的范圍。表1 定性時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度5 0%2 0%5 0%1 0%2 0%1 0%允許相對偏差2 0%2 5%3 0%5 0%G B5 0 0 9.1 8 52 0 1 65 6 分析結果的表述試樣中展青霉素的含量按式(1) 計算:X=Vmf(1) 式中:X 試樣中展青霉素的含量, 單位為微克每千克或微克每升(g/k g或g/L) ; 由標準曲線計算所得的試樣溶液中展青霉素的濃度, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;V 最終定容體積, 單位毫升(m L) ;m 試樣的稱樣量, 單位克(g) ;f 稀釋倍數(shù)。計算結果保留三位有效數(shù)字。7 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的1 5%。8 其他本方法的檢出限和定量限見表2。表2 不同試樣采用不同前處理方法的檢出限和定量限凈化方式澄清果汁蘋果酒固體、 半流體檢出限 / (g/k g)定量限 / (g/k g)檢出限 / (g/k g)定量限 / (g/k g)檢出限 / (g/k g)定量限 / (g/k g)混合型陰離子交換柱1.551.5531 0凈化柱法31 031 062 0第二法 高效液相色譜法9 原理樣品( 濁汁、 半流體及固體樣品用果膠酶酶解處理) 中的展青霉素經(jīng)提取, 展青霉素固相凈化柱凈化、 濃縮后, 液相色譜分離, 紫外檢測器檢測。外標法定量。1 0 試劑和材料除非另有說明, 本方法使用的試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。1 0.1 試劑1 0.1.1 乙腈(CH3C N) : 色譜純。G B5 0 0 9.1 8 52 0 1 66 1 0.1.2 甲醇(CH3OH) : 色譜純。1 0.1.3 乙酸(CH3C OOH) : 色譜純。1 0.1.4 乙酸乙酯(CH3C OO CH2CH3) 。1 0.1.5 乙酸銨(CH3C OONH4) 。1 0.1.6 果膠酶( 液體) : 活性不低于15 0 0U/g,28避光保存。1 0.2 試劑配制乙酸溶液: 取1 0m L乙酸加入2 5 0m L水, 混勻。1 0.3 標準品展青霉素標準品(C7H6O4,C A S號:1 4 9 - 2 9 - 1) : 純度9 9%, 或經(jīng)國家認證并授予標準物質證書的標準物質。1 0.4 標準溶液配制1 0.4.1 標準儲備溶液(1 0 0g/m L) : 用2m L乙腈溶解展青霉素標準品1.0m g后, 移入1 0m L的容量瓶, 乙腈定容至刻度。溶液轉移至試劑瓶中后, 在-2 0 下冷凍保存, 備用,6個月內有效。展青霉素標準溶液濃度的標定參見附錄A。1 0.4.2 標準工作液(1g/m L) : 移取1 0 0L經(jīng)標定過的展青霉素標準儲備溶液, 用乙酸溶液溶解并轉移至1 0m L容量瓶中, 定容至刻度。溶液轉移至試劑瓶中后, 在4下避光保存,3個月內有效。1 0.4.3 標準系列工作溶液: 分別準確移取標準工作液適量至5m L容量瓶中, 用乙酸溶液定容至刻度, 配制展青霉素濃度 為5n g/m L、1 0n g/m L、2 5n g/m L、5 0n g/m L、1 0 0n g/m L、1 5 0n g/m L、2 0 0n g/m L、2 5 0n g/m L系列標準溶液。1 1 儀器和設備1 1.1 液相色譜儀: 配紫外檢測器。1 1.2 勻漿機。1 1.3 高速粉碎機。1 1.4 組織搗碎機。1 1.5 渦旋振蕩器。1 1.6 p H計: 測量精度0.0 2。1 1.7 天平: 感量為0.0 1g和0.0 0 00 1g。1 1.8 5 0m L具塞P V C離心管。1 1.9 離心機: 轉速60 0 0r/m i n。1 1.1 0 展青霉素固相凈化柱: 混合填料凈化柱M y c o s e pTM2 2 8或相當者。1 1.1 1 1 0 0m L梨形燒瓶。1 1.1 2 固相萃取裝置。1 1.1 3 旋轉蒸發(fā)儀。1 1.1 4 氮吹儀。1 1.1 5 一次性水相微孔濾頭: 帶0.2 2m微孔濾膜。G B5 0 0 9.1 8 52 0 1 67 1 2 分析步驟1 2.1 試樣制備同5.1。1 2.2 試樣提取及凈化除不加同位素內標外, 試樣提取及凈化柱凈化操作同5.2.2。1 2.3 儀器參考條件a) 液相色譜柱:T3柱, 柱長1 5 0mm, 內徑4.6mm, 粒徑3.0m, 或相當者;b) 流動相:A相: 水,B相: 乙腈;c) 梯度洗脫條件:5% B(0m i n 1 3m i n) ,1 0 0% B(1 3m i n 1 5m i n) ,5% B(1 5m i n 2 0m i n) ;d) 流速:0.8m L/m i n;e) 色譜柱柱溫:4 0;f) 進樣量:1 0 0L;g) 紫外檢測器條件: 檢測波長為2 7 6n m。1 2.4 標準曲線的制作將標準系列溶液由低到高濃度依次進樣檢測, 以標準溶液的濃度為橫坐標, 以峰面積為縱坐標, 繪制標準曲線。1 2.5 測定將試樣溶液注入液相色譜-質譜儀中, 測得相應的峰面積, 由標準曲線得到試樣溶液中展青霉素的濃度。1 3 分析結果的表述試樣中展青霉素的含量按式(2) 計算:X=Vmf(2) 式中:X 試樣中展青霉素的含量, 單位為微克每千克或微克每升(g/k g或g/L) ; 由標準曲線得到的試樣溶液中展青霉素的濃度, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;V 最終定容體積, 單位毫升(m L) ;m 試樣的稱樣量, 單位克(g) ;f 稀釋倍數(shù)。計算結果保留三位有效數(shù)字。1 4 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的1 5%。G B5 0 0 9.1 8 52 0 1 68 1 5 其他液體試樣的檢出限為6g/k g, 定量限為2 0g/k g; 固體、 半流體試樣的檢出限為1 2g/k g, 定量限為4 0g/k g。G B5 0 0 9.1 8 52 0 1 69 附 錄 A展青霉素標準溶液濃度的標定A.1 儀器校正測定重鉻酸鉀溶液的摩爾消光系數(shù), 以求出使用儀器的校正因子。準確稱取7 4m g經(jīng)干燥的重鉻酸鉀, 用0.0 0 9m o l/L硫酸溶解后并準確稀釋至10 0 0m L, 相當于c(K2C r2O7)=0.2 5mm o l/L 。再吸取2 5m L此稀釋液于5 0m L容量瓶中, 加0.0 0 9m o l/L硫酸稀釋至刻度, 相當于0.1 2 5mm o l/L溶液。再吸 取2 5 m L此 稀 釋 液 于5 0 m L容 量 瓶 中, 加0. 0 0 9 m o l/L硫 酸 稀 釋 至 刻 度, 相 當 于0.0 6 25mm o l/L溶液。用1c m石英杯, 在最大吸收峰的波長(3 5 0n m處) 用0.0 0 9m o l/L硫酸作空白,測得以上三種不同濃度的溶液的吸光度, 以上三種濃度的摩爾消光系數(shù)按式(A.1) 計算:E=Ac(A.1) 式中:E 重鉻酸鉀溶液的摩爾消光系數(shù);A 測得重鉻酸鉀溶液的吸光度;c 重鉻酸鉀溶液的摩爾濃度。取三種濃度的摩爾消光系數(shù)的平均值E并與重鉻酸鉀的摩爾消光系數(shù)值31 6 0比較, 即求出使用儀器的校正因子, 按式(A.2) 進行計算:f=31 6 0E (A.2) 式中:f 使用儀器的校正因子;E 測得的重鉻酸鉀摩爾消光系數(shù)平均值。若f大于0.9 5或小于1.0 5, 則使用儀器的校正因子可略而不計。A.2 展青霉素標準溶液的制備取10 0 0L儲備液用氮氣吹干后, 立即用2 0m L乙醇溶解殘渣, 置于4冰箱保存。該標準溶液約為5g/m L。用紫外分光光度計以1c m石英比色皿測此標準溶液在2 5 0n m3 5 0n m處的最大吸收峰的波長及該波長