GB5413.10-2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中維生素K1的測定.pdf

中華人民共和國國家標準中華人民共和國國家標準GB 5413.102010中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實施食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素 K1的測定 National food safety standard Determination of vitamin K1 in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.102010 I 前 言 本標準等同采用國際分析家學會（AOAC）AOAC 999.15 Vitamin K in Milk and Infant Formulas Liquid Chromatographic Method。 本標準代替GB/T 5413.10-1997嬰幼兒配方食品和乳粉 維生素K1的測定。 本標準與GB/T 5413.10-1997相比，主要變化如下： 標準名稱改為嬰幼兒食品和乳品中維生素K1的測定； 試樣處理改為試樣經(jīng)酶水解后，用NaOH皂化，用正己烷萃?。?測定改為用高效液相色譜柱后還原熒光法定量測定維生素 K1； 儀器中將“高壓液相色譜儀帶紫外檢測器”修改為“高效液相色譜儀，帶熒光檢測器”。 本標準附錄 A、附錄 B 和附錄 C 均為資料性附錄。 本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為： GB 5413-1985、GB/T 5413.10-1997。 GB 5413.102010 1 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素 K1的測定 1 范圍 本標準規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中維生素 K1的測定方法。 本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中維生素 K1的測定。 2 規(guī)范性引用文件 本標準中引用的文件對于本標準的應用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。 3 原理 用脂肪酶降解試樣中的脂肪和不飽和脂肪酸， 對于含淀粉試樣需先用淀粉酶降解試樣中的淀粉， 經(jīng)堿皂化后，用正己烷提取維生素 K1。通過液相色譜法分離，柱后還原維生素 K1，熒光檢測器檢測，外標法定量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。 4.1 氫氧化鈉溶液（10 mol/L）：臨用前配制。 4.2 95 %乙醇。 4.3 飽和氯化鈉溶液。 4.4 正己烷：色譜純。 4.5 無水硫酸鈉。 4.6 甲醇：色譜純。 4.7 二氯甲烷：色譜純。 4.8 冰醋酸。 4.9 氯化鋅。 4.10 無水乙酸鈉。 4.11 流動相：甲醇（4.6）900 mL，二氯甲烷（4.7）100 mL，冰醋酸（4.8）0.3 mL，氯化鋅（4.9）1.5 g，無水乙酸鈉（4.10）0.5 g，溶解后用 0.45 m 濾膜過濾。 4.12 淀粉酶：酶活力1.5 U/mg。 GB 5413.102010 2 4.13 脂肪酶：酶活力700 U/mg。 4.14 鋅粉：粒度 50 m70 m。 4.15 維生素 K1標準溶液：標準溶液濃度校正方法參見附錄 A。 4.15.1 維生素 K1標準儲備液（2 mg/mL）：稱取 0.05 g 維生素 K1標準品（精確到 0.1 mg），于 25 mL容量瓶中，用正己烷溶解定容。 4.15.2 維生素 K1標準中間液（20 g/mL）：取標準儲備液（4.15.1）1 mL 加正己烷定容至 100 mL。 5 儀器和設備 5.1 高效液相色譜儀，帶有熒光檢測器。 5.2 天平：感量為 0.1 mg。 5.3 分液漏斗：250 mL。 5.4 旋轉蒸發(fā)器。 5.5 恒溫空氣浴振蕩器。 5.6 離心機：轉速3000 轉/分鐘。 5.7 氮吹儀。 6 分析步驟 6.1 試樣處理 6.1.1 含淀粉的試樣 稱取混合均勻的固體試樣約 2.5 g 或液體試樣約 10 g（精確到 0.1 mg）于三角瓶中，加入 0.5 g 淀粉酶（4.12），用 30 mL 溫水溶解。 6.1.2 不含淀粉的試樣 稱取混合均勻的固體試樣約2.5 g或液體試樣約10 g（精確到0.1 mg）于三角瓶中，用30 mL溫水溶解。 6.2 測定液的制備 向上述處理過的試樣溶液中加入 1 g 脂肪酶（4.13），于 37 5 恒溫空氣浴振蕩器中振蕩過夜，使其充分酶解。取出酶解好的試樣，加入 2 mL 氫氧化鈉溶液（4.1），用 50 mL 乙醇（4.2）將溶液轉入 250 mL 的分液漏斗中， 充分混勻 （必要時加少量飽和氯化鈉溶液 （4.3） ） 。 加入 50 mL 正己烷 （4.4） 。充分振搖 2 min，靜置分層。放出下層水相于另一個 250 mL 分液漏斗中，留下有機相。 向水相中再次加入 50 mL 正己烷再次萃取。 合并有機相。 用適量蒸餾水洗有機相兩次。 將有機相通過無水硫酸鈉 （4.5）脫水過濾到一個 500 mL 的燒瓶中，在旋轉蒸發(fā)器上于 40 2 下蒸發(fā)至近干。用正己烷（4.4）轉移殘留物到一個 10 mL 試管中，置氮吹儀上于 40 2 下吹干，準確加入 1 mL 正己烷（4.4），充分振蕩溶解殘留物。將試管放入冰箱中在 0 以下冷凍 1 h 備用。 6.3 測定 6.3.1 色譜參考條件 GB 5413.102010 3 色譜柱：C18色譜柱，150 mm 4.6 mm，5 m，或具同等性能的色譜柱； 鋅還原柱： 4.6 mm 50 mm（參見附錄 B） ； 檢測波長： 激發(fā)波長為 243 nm，發(fā)射波長為 430 nm； 流動相：甲醇（4.6）900 mL，二氯甲烷（4.7）100 mL，冰醋酸（4.8）0.3 mL，氯化鋅（4.9）1.5 g，無水乙酸鈉（4.10）0.5 g，溶解后用 0.45 m 濾膜過濾； 流速：1 mL/min； 進樣量：10 L。 6.3.2 維生素 K1標準曲線繪制 分別準確吸取標準中間液（4.15.2）0.0 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL加正己烷定容至25 mL，此標準系列工作液維生素K1濃度分別為0.00 g/mL，0.40 g/mL，0.80 g/mL，1.20 g/mL，1.60 g/mL，2.00 g/mL。 將系列標準維生素K1工作液分別注入高效液相色譜儀中，測定相應的峰面積或峰高，以峰面積或峰高為縱坐標，以標準測定液濃度為橫坐標繪制標準曲線。 6.3.3 測定液的測定 將制備好的測定液（6.2）在暗處放至室溫，于離心機中在 3000 轉/分鐘下離心 5 min，吸取上清液注入高效液相色譜儀中，測定相應的峰面積或峰高（標準色譜圖參見附錄 C） 。從標準曲線上查得試樣溶液中維生素 K1的濃度或通過回歸方程計算出試樣溶液中維生素 K1的濃度（g/mL） 。 7 分析結果的表述 試樣中維生素 K1的含量按式（1）計算： 100=iiimnVCX（1） 式中： X維生素 K1的含量，單位為微克每百克（g/100 g） ； Ci試樣溶液的濃度，單位為微克每毫升（g/mL） ； Vi試樣溶液的體積，單位為毫升（mL） ； mi試樣的質量，單位為克（g）； n 樣液稀釋倍數(shù)。 以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留到小數(shù)點后一位。 8 精密度 在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10 %。 9 其他 9.1 由于維生素 K1遇光易分解，整個操作應避光。 9.2 本標準檢出限為 1 g/100 g。 GB 5413.102010 4 附錄 A （資料性附錄） 標準溶液濃度校正方法 標準溶液配制后需要對所配制的標準溶液進行校正，具體操作如下： 維生素K1標準濃度的標定：取維生素K1標準工作溶液，按給定波長測定各維生素的吸光值，用比吸光系數(shù)計算出該維生素K1的濃度。測定條件見表A.1。 表A.1 維生素K1吸光值的測定條件 標準 比吸光系數(shù) %1cmE 波長 （nm） 維生素K1 422 248 濃度按式(2)計算： C1=1001EA(2) 式中： C1維生素K1濃度，單位為克每毫升（g/mL）； A維生素K1的平均紫外吸光值； E維生素K1 1 %比色光系數(shù)。 GB 5413.102010 5 附錄 B （資料性附錄） 鋅還原柱填裝方法 將鋅粉（4.14）密集裝入還原柱（4.6 mm 50 mm，不銹鋼材質）中。裝柱時，應連續(xù)少量多次將鋅粉裝入柱中，邊裝邊輕輕拍打，以使裝入的鋅粉緊密。 GB 5413.102010 6 附錄 C