雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理.ppt

雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)原理,接受抗原刺激后，能分泌針對(duì)該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。 B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時(shí)間后便會(huì)死亡短命細(xì)胞,一、雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的3個(gè)技術(shù)關(guān)鍵,1. B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性：,B淋巴細(xì)胞(B lymphocytes)：,骨髓瘤細(xì)胞 (myeloma cells):,惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營(yíng)養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活長(zhǎng)命細(xì)胞。 經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì)胞株沒有抗體分泌物。,2. 細(xì)胞融合技術(shù)：,長(zhǎng)命 不分泌抗體,分泌抗體 短命,分泌抗體 長(zhǎng)命,Khler和Milstein, 1975,1984年Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),3. 雜交瘤細(xì)胞的篩選 ：,HAT培養(yǎng)基篩選,H, 次黃嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶,A,(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 ( HGPRT ),胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase),B淋巴細(xì)胞： HGPRT+， TK+,骨髓瘤細(xì)胞： HGPRT-， TK-,存活,死亡,外源性途徑(旁路途徑),二、雜交瘤技術(shù)的操作流程,1. 動(dòng)物免疫：,目的： 在細(xì)胞融合后獲得盡可能多的分泌針對(duì)于該目標(biāo)抗原的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞.,特定目標(biāo)抗原,動(dòng)物,免疫,脾臟中B淋巴細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞大量增殖,刺激,能分泌針對(duì)于該抗原的特異性抗體,常規(guī)免疫法 脾內(nèi)一次性免疫法 短程免疫法 體外免疫法,常用免疫方法：,“穩(wěn)妥；優(yōu)勢(shì)克隆”,“省時(shí)；省抗原”,“省時(shí)”,“操作繁瑣”,常規(guī)免疫法：,第1次免疫：抗原+福氏完全佐劑,(皮下注射或靜脈注射),(皮下注射),(皮下注射),(靜脈注射),二、細(xì)胞融合及HAT篩選,病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合 PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合 電激融合,1、細(xì)胞融合方法：,細(xì)胞懸液的制備與融合,(1) 脾細(xì)胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備,(2) 骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備：于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期制備,(3) 細(xì)胞融合：50%PEG(10004000), pH8.0, 38oC, 1min,2、HAT培養(yǎng)基的篩選,三、抗體的檢測(cè),要求： 簡(jiǎn)便、快速、敏感; 在短時(shí)間內(nèi)能檢測(cè)大量樣品,常用方法：,酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence, IFA) 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA) 雙相擴(kuò)散法,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液,技術(shù)原理：,四、克隆化,常用克隆化方法：,有限稀釋法 軟瓊脂平板法 顯微操作法,80個(gè)細(xì)胞/96孔 飼養(yǎng)細(xì)胞(feeder cells),ELISA法檢測(cè)單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。,由單一克隆的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體，只針對(duì)于一個(gè)抗原決定簇單克隆抗體(monoclonal antibody, MAb