現(xiàn)代生物技術(shù)在植物育種上的應(yīng)用.ppt

生物技術(shù)在植物育種中的應(yīng)用,主要內(nèi)容,生物技術(shù)的概念和范圍 細(xì)胞工程與育種 基因工程與育種 分子標(biāo)記輔助育種,生物技術(shù),生物技術(shù)也稱生物工程，是指以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)，發(fā)行生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需的產(chǎn)品或達(dá)到某種目的的一門新興、綜合性學(xué)科。,生物技術(shù)是在分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代工程學(xué)的方法和原理而發(fā)展起來的一門綜合性科學(xué)技術(shù) 應(yīng)用范圍廣泛：醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)林牧漁、輕工、食品、化 工和能源等領(lǐng)域。,植物方面：產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病蟲、抗逆性等， 以細(xì)胞工程、基因工程、分子標(biāo)記輔助育種為核心的生物技術(shù)在植物育種中已得到廣泛應(yīng)用。,主要涉及： 組織與細(xì)胞培養(yǎng)、體細(xì)胞突變體篩選、原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交、單倍體細(xì)胞培養(yǎng)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生與生物反應(yīng)器、基因分離和轉(zhuǎn)移和分子標(biāo)記輔助選擇育種等技術(shù),生物技術(shù)應(yīng)用于育種的必要性,1、人類21世紀(jì)面臨的三大問題 （人口、資源、環(huán)境） 2、傳統(tǒng)育種方法的局限 3、生物技術(shù)的創(chuàng)造性 （1）打破自然生殖隔離，生物可共享一個(gè)基因庫(kù) （2）有目的地進(jìn)行基因重組，克服不良連鎖 （3）有效克服環(huán)境影響，選擇更可靠,生物技術(shù)在植物育種中應(yīng)用的重要意義,生物技術(shù)應(yīng)用于植物育種，可以解決傳統(tǒng)育種的一些特殊困難，擴(kuò)大育種的基因來源，提高鑒定和擺地?cái)偟目煽啃裕涌煊N進(jìn)程，加速繁殖，提高育種效率等，對(duì)于解決人口與食物問題以及生物能源問題，具有十分重要意義。,組織與器官培養(yǎng)的類別 組織與器官培養(yǎng)的應(yīng)用,第一節(jié) 細(xì)胞工程與育種,第一節(jié) 細(xì)胞工程與育種,一、組織與器官培養(yǎng),莖尖和分生組織培養(yǎng) 胚培養(yǎng) 胚珠和子房培養(yǎng) 胚乳培養(yǎng) 離體葉的培養(yǎng),相關(guān)的專業(yè)術(shù)語,細(xì)胞全能性： 外植體： 愈傷組織 胚狀體 繼代培養(yǎng),組織與器官培養(yǎng)過程可分四個(gè)階段,各階段在培養(yǎng)基、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比和濃度、培養(yǎng)方式和環(huán)境上都有不同的要求,組織和器官培養(yǎng)在育種中的作用,加快植物新品種和育種繁殖速度 培養(yǎng)無病毒苗木 誘發(fā)和離體篩選突變體 進(jìn)行種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸 獲得倍性不同的植株 克服種子和萌發(fā)中的障礙 克服遠(yuǎn)緣雜交困難 提供育種中間材料,1. 加快植物新品種和育種繁殖速度,2. 培養(yǎng)無病毒苗木,3. 誘發(fā)和離體篩選突變體,4. 獲得倍性不同的植株,二倍體（左）多倍體（右）水稻,5. 克服種子和萌發(fā)中的障礙,種子萌發(fā)全過程,6. 克服遠(yuǎn)緣雜交困難,7. 提供育種中間材料,二、花藥和花粉培養(yǎng),花藥培養(yǎng)：其外植體為植物雄性器官的一部分，就培養(yǎng)方法和技術(shù)來講于器官培養(yǎng)的范疇 花粉培養(yǎng)：將處于一定發(fā)育階段的花粉從花藥中分離，再加以離體培養(yǎng)，有時(shí)花粉培養(yǎng)也稱為小孢子培養(yǎng)，從培養(yǎng)方法和技術(shù)方面講，屬于細(xì)胞培養(yǎng)的范圍,花藥培養(yǎng)的基本程序,花粉發(fā)育時(shí)期,四分體,小孢子,單核花粉,雙核花粉,最適期,花粉及小孢子培養(yǎng),1、取材時(shí)期的確定,花藥培養(yǎng)與小孢子培養(yǎng)的目的一樣，為獲得單倍體。 單倍體（haploid):指具有配子體染色體數(shù)的孢子體（植物個(gè)體）,單倍體在育種中的作用：,加倍后可迅速獲得純合型材料，縮短育種年限 獲得育種中間材料 與誘變育種相結(jié)合可以提高誘變頻率，使育種途徑更具有實(shí)際應(yīng)用意義，無籽三倍體的獲得 作為遺傳工程受體更為有效 用于基礎(chǔ)遺傳學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域 獲得超雄植株（YY） 可獲得異源體附加系，代換系和易位系 節(jié)省田間試驗(yàn)的土地和勞力 克服遠(yuǎn)緣雜交不育性與分離的困難 提高選擇的正確性和效率,蘆筍性染色體（XY） 超雄植株：有性染色體的純合體,三、原生質(zhì)體培養(yǎng),原生質(zhì)體培養(yǎng)：protoplast culture 體細(xì)胞雜交 Somatic hybridization 原生質(zhì)體融合 Protoplast fusion,相關(guān)概念,原生質(zhì)體：指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。 亞原生質(zhì)體：在原生質(zhì)體分離過程中，有時(shí)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)含物的斷裂而形成一些較小的原生質(zhì)體?？梢跃哂屑?xì)胞核或沒有細(xì)胞核 核質(zhì)體：由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體，即微小原生技擊體 胞質(zhì)體：不含細(xì)胞核而僅含有部分細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體,原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng),無菌試管苗葉片 上胚軸和子葉 愈傷組織 培養(yǎng)細(xì)胞,酶解,纖維素酶和果膠酶,原生質(zhì)體,原生質(zhì)體培養(yǎng),培養(yǎng)基,液體淺層培養(yǎng) 固體平板培養(yǎng) 固液雙層培養(yǎng) 瓊脂糖珠培養(yǎng),培養(yǎng)方法,四、體細(xì)胞雜交,定義：將兩個(gè)不同親本的原生質(zhì)體，經(jīng)人工誘導(dǎo)融合并培養(yǎng)成植株的過程，統(tǒng)稱為體細(xì)胞雜交（A+B） 幾種不同的表述： 體細(xì)胞雜交：somatic hybridization 細(xì)胞融合:Cell fusion 無性雜交: asexual hybridization 原生質(zhì)體融合：Protoplast fusion 超性雜交: Parasexual hybridization 超性融合: Parasexual hybridization 細(xì)胞工程: Cell engineering,1960年，Kocking用酶法制備高等植物原生質(zhì)體首次獲得成功 1971年，Takebe首次從離體煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)中獲得再生完整植株 1972年，Carlson首次獲得粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的細(xì)胞雜種，是第一個(gè)植物細(xì)胞雜種 1974年，Kao將聚已二醇誘導(dǎo)融合法應(yīng)用于植物細(xì)胞融合并取得了相應(yīng)的融合技術(shù) 1978年，Melchers獲得第一個(gè)屬間細(xì)胞雜交（馬鈴薯+蕃茄） 1981年，Zimmerman發(fā)明電融合儀，并首次年出電融合概念 1987年，Schweiger建立單對(duì)原生質(zhì)體電融合技術(shù)程序,體細(xì)胞和有性雜交的比較,理論上，任何細(xì)胞都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源，這對(duì)種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)意義 融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑 體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng),原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交的應(yīng)用,獲得新品種 創(chuàng)造新種質(zhì) 轉(zhuǎn)移有利性狀和克服遠(yuǎn)緣雜交的障礙 作為基因工程的良好受體及進(jìn)行突變體篩選的優(yōu)良原始材料,五、植物細(xì)胞突變體的離休篩選,基因組突變：染色體數(shù)目的改變或細(xì)胞質(zhì)基因組的增減 染色體突變：染色體較大范圍的結(jié)構(gòu)變化，涉及多個(gè)基因 基因突變：指范圍在一個(gè)基因以內(nèi)的分子結(jié)構(gòu)的改變，按DNA改變方式有堿基置換、稱雄突變、缺失突變和插入突變,（一）突變體的產(chǎn)生,在離體培養(yǎng)條件下，誘發(fā)突變的突變型和自發(fā)突變沒有本質(zhì)上的差別，一般有三個(gè)水平的突變：,（二）突變細(xì)胞的篩選方法,直接選擇法,正選擇/負(fù)選擇,間接選擇法,正選擇,用一種含有特定物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上只有突變細(xì)胞能夠生長(zhǎng)，非突變細(xì)胞不能生長(zhǎng)，從而直接篩選出突變體。如除草劑、抗鹽堿突變體的篩選，均可直接在培養(yǎng)基中加入一定濃度的除草劑或增加滲透壓的物質(zhì)。目前采用這一途徑已從多種植物中篩選出可利用的體細(xì)胞變異體。,負(fù)選擇,一種借助于與突變表現(xiàn)型有關(guān)的性狀作為選擇指標(biāo)的篩選方法 Dorffling等以Pro類似物羥脯氨酸（HYP)為選擇劑，獲得了耐HYP的體細(xì)胞變異系，其抗寒性比供體親本增強(qiáng)，且能穩(wěn)定遺傳 林定波等將錦橙株心細(xì)胞愈傷組織的懸浮細(xì)胞經(jīng)射線照射，然后在高濃度散打脯氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選，獲得了抗寒體細(xì)胞變異愈傷組織，并再生植株。鑒定顯示，抗寒愈傷組織及其再生植株的抗寒性分別比供體提高1.4度和2.4度，突變系體內(nèi)的Pro含量比供體增加了一倍,（三）突變性狀遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定,遺傳基礎(chǔ),穩(wěn)定性,突變性狀的遺傳學(xué)基礎(chǔ),體細(xì)胞變異，除發(fā)生在染色體水平外，更多的是基因水平上的變異 從利用體細(xì)胞變異的角度，染色體變異大多是一些畸型變異，真正可利用的染色體變異十分有限 基因水平上的變異大多只是個(gè)別性狀的改變，不會(huì)影響再生植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育。因此，從再生植株的 這些變異中有可能篩選有益的變異。 基因水平的變異從根本上講是DNA大項(xiàng)突變或修飾狀態(tài)的改變,突變性狀的穩(wěn)定性,對(duì)于單基因控制的遺傳性狀，大多數(shù)堿基突變可以穩(wěn)定遺傳而且符合孟德爾遺傳分離規(guī)律，這一點(diǎn)已在水稻、煙草和玉米的體細(xì)胞變異中得以證實(shí)。 植物的許多性狀特別是經(jīng)濟(jì)性狀均由多基因控制，對(duì)于多基因控制性狀的堿基突變可能由于技術(shù)上的復(fù)雜性，目前還沒有關(guān)于多基因控制性狀的堿基突變報(bào)道。,第二節(jié) 基因工程與育種,Genetic Engineering and Breeding,植物基因工程：指以類似工程設(shè)計(jì)的方法，按照人們的意志，通過一定的程序，將具有遺傳信息的DNA片段，在離休條件下，用工具酶加以剪切、組合和拼接，再將人工重組的基因引物適當(dāng)?shù)闹参锸荏w中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。 轉(zhuǎn)基因植物（transgenic plants) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenic technique),基因工程,基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化示意圖,基因工程基本操作步驟,目的基因的分離與鑒定 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 植物的遺傳轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選及轉(zhuǎn)基因植物的鑒定,植物基因轉(zhuǎn)移的過程,基因工程在植物育種中的應(yīng)用,改良品質(zhì) 提高抗病蟲能力 改良抗逆性 提高光合作用和固氮效率 創(chuàng)建雄性不育材料 延遲成熟與保鮮 選育抗除草劑品種,1. 提高抗病能力,抗真菌基因工程途徑,抗細(xì)菌基因工程途徑,克隆并導(dǎo)入幾丁質(zhì)酶基因和-1，3-葡聚糖酶基因 克隆并導(dǎo)入抗毒素,過量表達(dá)法 克隆轉(zhuǎn)化溶菌酶基因或殺菌肽基因,過量表達(dá)來自番茄PR蛋白的甜橙抗腳腐病,馬鈴薯抗菌肽基因工程,2.抗病毒基因工程,向植物中導(dǎo)入病毒外殼蛋白（CP) 轉(zhuǎn)移病毒的反義RNA，衛(wèi)星RNA，病毒復(fù)制酶基因和核酶基因等,抗病毒番木瓜,3. 提高抗蟲能力,導(dǎo)入Bt毒蛋白基因 導(dǎo)入蛋白酶抑制基因 利用一些昆蟲毒素基因（如蜘蛛殺蟲肽基因，和蝎毒素基因等）,4. 改善抗逆性,向植物中導(dǎo)入熱休克基因，可提高其擴(kuò)，抗熱性 將深海魚美洲擬鰈的抗凍基因通過柱頭導(dǎo)入番茄，獲得可耐受-4 -5的轉(zhuǎn)基因番茄 導(dǎo)入脯氨酸或甜菜堿合成有關(guān)的酶的基因 如甜菜堿醛脫氫酶（BADH)基因?qū)霟煵?，草莓和水稻后，轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性明顯提高,深海魚美洲擬鰈,轉(zhuǎn)深海魚美洲擬鰈的抗凍基因草莓,5. 選育抗除草劑品種,把除草劑作用的靶酶或靶蛋白質(zhì)的基因?qū)胫参?現(xiàn)已在矮牽牛、煙草、番茄、馬鈴薯、大豆、油菜、楊樹等植物上獲得抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植株。 轉(zhuǎn)移一種能以除草劑為底物的酶的基因 如bar基因編碼PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶，導(dǎo)入煙草，番茄和馬鈴薯等植物后，使作物獲得抗除草劑PPT的能力,6. 延遲成熟與保鮮,改變果實(shí)細(xì)胞壁降解酶活性 抑制成熟激素乙烯的生成,乙烯生成減少70% 需更長(zhǎng)時(shí)間軟化 硬度：高于CK 比CK耐貯藏,轉(zhuǎn)基因蘋果,轉(zhuǎn)基因耐貯藏番茄,7. 提高產(chǎn)量,目前已克降出許多種參與光合作用的基因和導(dǎo)致植物雄性不育的基因 Worral等報(bào)道用編碼-1，3-葡聚糖水解酶基因轉(zhuǎn)化煙草，矮牽牛獲得雄性不育植株,提高光合作用效率和固氮效率 克隆與雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)的植物雄性不育有關(guān)的基因,8. 改良品質(zhì),將人工合成的