【精品論文】慢性乙型肝炎患者肝組織中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化.doc

精品論文慢性乙型肝炎患者肝組織中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的研究劉峰1，武楠1，趙景民2，馬慧1，饒慧瑛1，王燁1，魏來(lái)15（1. 北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京大學(xué)肝病研究所，北京市丙型肝炎和肝病免疫治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 室，北京 100044；2. 北京 302 醫(yī)院病理科，北京 100039） 摘要：目的：研究慢性乙型肝炎患者肝組織內(nèi)何種細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。方法：收集 54 例慢性乙型肝炎患者的肝組織標(biāo)本，對(duì)其分別做細(xì)胞角蛋白 7（cytokeratin 7，ck7）/s100a4，10ck7/-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin，-sma），e-鈣粘素（e-cadherin）/vimentin， e-鈣粘素（e-cadherin）/-sma 的檢測(cè)，觀察肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞和肝干細(xì)胞（hepatic progenitor cells，hpcs）是否同時(shí)表達(dá)上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞表型。結(jié)果：患者肝組織中觀察到匯管區(qū)周?chē)哪懝芊磻?yīng)細(xì)胞、小膽管和中膽管細(xì)胞共表達(dá)上皮細(xì)胞表型（ck7 和 e-cadherin）和間質(zhì)細(xì)胞表型（s100a4），并且雙陽(yáng)細(xì)胞與肝纖維化分期有一定的相關(guān)性（p0.05）。e-cadherin15陽(yáng)性的肝細(xì)胞、ck7 陽(yáng)性的 hpcs 未發(fā)現(xiàn)表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表型（s100a4）。-sma 陽(yáng)性的成 纖維細(xì)胞與 hpcs 和膽管反應(yīng)鄰近分布，未觀察到 ck7/-sma 和 e-cadherin/-sma 雙染陽(yáng) 性的細(xì)胞。結(jié)論：慢性乙型肝炎患者膽管反應(yīng)細(xì)胞和膽管細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá)上皮細(xì)胞和纖維 細(xì)胞表型，提示其可能向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 關(guān)鍵詞：上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；慢性乙型肝炎；肝干細(xì)胞；肝細(xì)胞；膽管上皮細(xì)胞20中圖分類(lèi)號(hào)：r512.6+2the research of epithelial-mesenchymal transition inchronic hepatitis bliu feng1, wu nan1, zhao jingmin2, ma hui1, rao huiying1, wang ye1, wei lai125(1. peking university peoples hospital, peking university hepatology institute, beijing keylaboratory of hepatitis c and immunotherapy for liver diseases, beijing 100044;2. beijing 302 hospital,department of pathology, beijing 100039)abstract: objective to investigate whether emt occurs and contributes to fibrogenesis in chronic hepatitis b. methods liver tissue specimens from 54 cases of chronic hepatitis b were studied.30liver sections were immunostained to detect antigens associated with epithelial cells (cytokeratin7, and e-cadherin), epithelialmesenchymal transition (s100a4), myofibroblasts (-smooth muscle actin). results in liver tissure, ck-7 and e-cadherin positive ductular reactions, small andmedium ductular epithelial cells showed clear expression of s100a4 at the portal area, indicating the transition from epithelial cells to mesenchymal cells. these double positive epithelial cells also35correlated with fibrosis stage (p0.05). e-cadherin positive hepatocytes, ck7 positive hepatic progenitor cells (hpcs) had no expression of vimentin. double staining of ck7/-sma ande-cadherin/-sma was not observed. conclusions co-expression of vimentin and ck7 in ductular reactions and epithelial cells indicated the transition of these cells to mesenchymal cells. keywords: epithelial to mesenchymal transition; chronic hepatitis b; hepatic progenitor cells;40hepatocytes; ductular epithelial cells0引言肝纖維化不是一個(gè)獨(dú)立的疾病，而是許多慢性肝病共同的病理過(guò)程，是多種慢性肝臟疾基金項(xiàng)目：高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金(20090001110088)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2007cb512900）；北京大學(xué)人民醫(yī)院院內(nèi)基金（rdk2008-06）；中國(guó)肝炎防治基金會(huì)王寶恩基金（20080030）作者簡(jiǎn)介：劉峰，（1975-），女，副研究員，主要研究方向：干細(xì)胞在肝病中的應(yīng)用。通信聯(lián)系人：魏來(lái)，（1961-），男，教授，主要研究方向：肝病研究。e-mail: - 7 -病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段。肝纖維化發(fā)生時(shí)，肝內(nèi)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells, hsc）45和匯管區(qū)纖維細(xì)胞均參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)研究表明骨髓來(lái)源的 hsc 在肝纖維 化形成過(guò)程中發(fā)揮作用1,2。另外一種觀點(diǎn)認(rèn)為肝內(nèi)成纖維細(xì)胞的一種可能來(lái)源為肝內(nèi)上皮- 間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，emt)3-6。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成體肝細(xì)胞可在促 纖維化因子 tgf- 的誘導(dǎo)下發(fā)生 emt7,8。在原發(fā)性膽汁性肝硬化患者肝移植后復(fù)發(fā)早期， 膽管上皮細(xì)胞即可表達(dá) s100a4、波形蛋白（vimentin）等成纖維細(xì)胞表型9，rygiel 等1050對(duì)小樣本原發(fā)性膽汁性肝硬化（pbc）和酒精性肝硬化患者的研究也得出了相似結(jié)論。那么 在慢性乙型肝炎中，是否也有 emt 現(xiàn)象存在尚無(wú)報(bào)道。故本研究擬觀察不同纖維化分期的 慢性乙型肝炎患者肝組織中 emt 想象。1材料和方法1.1一般資料55研究 2006 年 4 月至 2006 年 10 月在解放軍第 302 醫(yī)院和北京大學(xué)人民醫(yī)院進(jìn)行肝穿刺 活檢的慢性乙型肝炎患者。其中男性 44 例，女性 10 例，年齡 3-58 歲。所有病例均為乙型 肝炎病毒表面抗原（hepatitis b surface antigen，hbsag）陽(yáng)性持續(xù)半年以上，抗-hcv（hepatitis c virus）和抗-hiv（human immunodeficiency virus）陰性，經(jīng)病史及其他臨床指標(biāo)排除酒精 性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病及其他系統(tǒng)疾病所致肝損害。所有患者均未進(jìn)行過(guò)抗60病毒治療。對(duì)全部患者肝活檢組織進(jìn)行組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)（hai）和纖維化程度評(píng)分11,12。3 例正常肝組織取自肝血管瘤旁的肝組織。每例肝臟標(biāo)本以 10%中性甲醛固定、石蠟包埋后 由病理科保存。polymer 雙染檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鼠抗人細(xì)胞 角蛋白 7（cytokeratin 7，ck7）、鼠抗人 e-鈣粘素（e-cadherin）單抗購(gòu)自 dako 公司、兔 抗人 s100a4 多抗購(gòu)自 abcam 公司， 鼠抗人-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin，65-sma）購(gòu)自 leica 公司，alexa fluor 488 標(biāo)記山羊抗小鼠 igg fab 和 alexa fluor 568 山羊 抗兔 igg fab 二抗購(gòu)自 moleculat probe 公司。1.2免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)雙染法按照 polymer 試劑盒說(shuō)明書(shū)。標(biāo)本連續(xù)切片厚 4m，經(jīng)脫水、脫蠟、 抗原修復(fù)、過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性酶，滴加 5bsa 封閉 10 min，傾去勿洗。滴加一抗 -sma70(鼠 igg，即用型)，4過(guò)夜，pbs 洗后，滴加辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠 igg，37c 30min，pbs 洗， dab 顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，染色后充分蒸餾水洗，pbs 洗，其后進(jìn)行第二種染色。 滴加 5bsa 封閉室溫 10 min 后，滴加第二種一抗 ck7 (鼠 igg，即用型)，3730 min，pbs 洗 2rain3 次，再滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠 igg，37c 30rain，pbs 洗，aec 顯色，鏡 下控制反應(yīng)時(shí)間，充分水洗。蘇木素輕度復(fù)染，流水清洗后滴加水溶性封片劑封固。dab75顯色呈棕黃色，aec 顯色呈紅棕色。1.3免疫熒光雙標(biāo)記石蠟切片脫蠟至水；高溫抗原修復(fù)，滴加 50l 10%山羊血清 37反應(yīng) 30min，封閉非 特異性結(jié)合位點(diǎn)。甩去封閉液，滴加 50l 混合均勻的一抗 ck7 單克隆抗體（即用型）和 兔抗 s100a4 多克隆抗體（1:200），4濕盒中孵育過(guò)夜。次日取出切片，pbs 洗滌 5min380次。滴加 alexa fluor 488 標(biāo)記山羊抗小鼠和 alexa fluor 568 山羊抗兔二抗，37濕盒中孵 育 30min。pbs 洗滌 5min3 次，滴加 dapi 封片劑封片，置于熒光共聚焦顯微鏡下觀察染精品論文色情況并拍照。用 pbs 代替一抗作陰性對(duì)照。其它抗體（e-cadherin 和 s100a4）的檢測(cè)方法同上。計(jì)數(shù) ck7+/s100a4+細(xì)胞占 ck7+細(xì)胞數(shù)的比例。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析85連續(xù)正態(tài)分布變量以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，比較兩組間差異采用 t 檢驗(yàn)，判斷相關(guān) 性采用 pearsons 相關(guān)分析。對(duì)于非正態(tài)分布變量，比較組間差異采用非參數(shù)檢驗(yàn)，判斷相 關(guān)性采用 spearmans 相關(guān)分析。采用 spss 12.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p0.05 時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。2結(jié)果902.1患者的臨床特征和組織學(xué)表現(xiàn)54 例患者年齡在 3-58 歲之間（平均 22.111.0 歲），其中 44 例（81.5%）為男性。各 纖維化分期病例數(shù)詳見(jiàn)表 1。h&e 染色可見(jiàn)在纖維化 0 期，匯管區(qū)和小葉內(nèi)炎癥較輕，伴 隨纖維化程度的增加，匯管炎、界面炎、小葉內(nèi)炎癥也呈加重趨勢(shì)。正常對(duì)照肝組織無(wú)脂肪 變、炎癥和纖維化表現(xiàn)。95表 1 54 例慢性乙型肝炎患者臨床和病理特征table1: clinical and pathologic features of patients with chronic hepatitis b參數(shù) 均數(shù)/病例數(shù) 病例總數(shù)，n54 年齡（歲）22.111.0 性別-男性，n（%）44（81.5%） 纖維化分期，n（%）0 期 101-2 期 153-4 期 215-6 期 81001051102.2s100a4 在各期纖維化組織中的表達(dá)在正常肝組織中，s100a4 在膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞中不表達(dá)，在門(mén)脈成纖維細(xì)胞（portal fibroblast）和肝竇周?chē)菭罴?xì)胞（hepatic stellate cell，hsc）中有少量表達(dá)。在慢性乙型肝 炎肝組織中，隨纖維化程度增加，s100a4 的表達(dá)也隨之增加。尤其在 3-4 期肝纖維化組織 中，可見(jiàn)大量 s100a4 陽(yáng)性的纖維細(xì)胞在匯管區(qū)聚集。此外，匯管區(qū)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞也可表 達(dá) s100a4。ck7 陽(yáng)性細(xì)胞主要見(jiàn)于膽管上皮細(xì)胞、膽管反應(yīng)細(xì)胞、中間型肝細(xì)胞和 hpcs。e-cadherin 陽(yáng)性細(xì)胞主要見(jiàn)于肝細(xì)胞和膽管上皮樣細(xì)胞。對(duì)慢性乙型肝炎肝組織分別做 ck7、e-cadherin 和 s100a4 雙標(biāo)記染色，發(fā)現(xiàn)不同纖維化分期的匯管區(qū)膽管反應(yīng)細(xì)胞和成熟小、中膽管上皮 細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá) ck7、e-cadherin 和 s100a4（圖 1，2 箭頭所示）。而在 5-6 期的患者肝 組織中發(fā)現(xiàn)膽管反應(yīng)細(xì)胞 s100a4/ck7 雙染陽(yáng)性細(xì)胞減少，同時(shí)中間型肝細(xì)胞在 5-6 期纖維 化患者中數(shù)量增多，可見(jiàn)較多的中間型肝細(xì)胞出現(xiàn)在雙染陽(yáng)性的膽管反應(yīng)周?chē)⑶叶鄶?shù) hpcs 和膽管反應(yīng)細(xì)胞與 s100a4 陽(yáng)性的纖維細(xì)胞伴隨分布。對(duì) ck7 和 s100a4 雙陽(yáng)細(xì)胞的 數(shù)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其與肝纖維化分期有一定的相關(guān)性（p0.05）（圖 3）。在各期肝纖維 化患者中，未觀察到表達(dá) s100a4 的 hpcs 和肝細(xì)胞。115120125圖 1：不同纖維化分期的慢性乙型肝炎患者肝組織中 ck7 和 s100a4 的表達(dá)。(a：正常肝組織；b：纖維化2 期肝組織；c：纖維化 4 期肝組織；d：纖維化 6 期肝組織；1：ck7，紅色；2：s100a4，綠色；3：dapi染核，藍(lán)色熒光；4：1-3 的重疊圖）fig.1 the expression of ck7 and s100a4 in different stages of fibrosis in chronic hepatitis b. (a: normal liver tissue; b: liver tissue from fibrosis stage 2; c: liver tissue from fibrosis stage 4; d: liver tissue from fibrosis stage 6;1: e-cadherin (red); 2: s100a4 (green); 3: nucleus (blue); 4: 1-3 overlap)圖 2：慢性乙型肝炎患者肝組織中 e-cadherin 和 s100a4 的表達(dá)。（a：e-cadherin，紅色熒光；b：s100a4， 綠色熒光；c：dapi 染核，藍(lán)色熒光；d：a-c 的重疊圖）fig.2 the expression of e-cadherin and s100a4 in different stages of fibrosis in chronic hepatitis b. (a: e-cadherin(red); b: s100a4 (green); c: nucleus (blue); d: a-c overlap)圖 3：不同纖維化分期的慢性乙型肝炎患者肝組織中 ck7/s100a4 雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/ck+單陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)fig.3. ck7+/s100a4+ cells/ ck7+ cells in different stages of fibrosis in chronic hepatitis b1301351402.3-sma 在各期纖維化組織中的表達(dá)在正常肝組織中，-sma 在門(mén)脈成纖維細(xì)胞中有少量表達(dá)，在膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、 和肝竇周?chē)菭罴?xì)胞（hepatic stellate cell，hsc）中不表達(dá)。在慢性乙型肝炎患者肝組織中， 星狀細(xì)胞激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞表達(dá) -sma。對(duì)患者肝組織做 -sma 與 ck7，e-caherin 的雙標(biāo)記染色。未發(fā)現(xiàn)膽管反應(yīng)細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞共同表達(dá) -sma 和 ck7（圖 4）,但是 激活的星狀細(xì)胞與 hpcs 和膽管反應(yīng)伴隨分布。也未發(fā)現(xiàn) -sma 和 e-caherein 雙染陽(yáng)性的 細(xì)胞。圖 4：慢性乙型肝炎患者肝組織中 ck7 和 -sma 的表達(dá)。（dab：-sma；aec：ck7，400） fig.4 the expression of ck7 and -sma in liver tissue of patients from chronic hepatitis b. （dab：-sma； aec：ck7，400）1453討論最近研究表明，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞可以通過(guò)上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial- mesenchymal transition，emt）參與肝纖維化形成3-9。emt 是肝內(nèi)上皮細(xì)胞的一種自我保 護(hù)機(jī)制，在致病因子作用下，肝內(nèi)受損傷的上皮細(xì)胞如膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞不發(fā)生壞死， 而是表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表型，并轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，以維持一定的細(xì)胞數(shù)量。該現(xiàn)象已經(jīng)在原發(fā)性 膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，pbc）和酒精性肝硬化的研究得到證實(shí)8,9。并且， sicklick 等13分離、培養(yǎng)動(dòng)物卵圓細(xì)胞系和人 hpcs，兩種細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá)上皮細(xì)胞（如 ck、上皮細(xì)胞粘附分子等）和間質(zhì)細(xì)胞表型（如 s100a4）。這些都提示在慢性乙型肝炎肝150155160165170175180185190組織內(nèi)可能存在 emt 的現(xiàn)象。我們對(duì) 54 例患者做纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞表型雙標(biāo)記染色，發(fā)現(xiàn)在不同纖維化分期的患 者肝組織的膽管上皮和膽管反應(yīng)中細(xì)胞均有 s100a4 和 ck7 及 e-cadherin 共表達(dá)，其周?chē)?s100a4 陽(yáng)性的纖維細(xì)胞包繞。提示肝組織中存在同時(shí)具有上皮和間質(zhì)特征的細(xì)胞，即共表 達(dá) s100a4 和 ck7 及 e-cadherin 的膽管反應(yīng)細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞可能向纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)渡 型細(xì)胞。在部分 0-2 期肝纖維化組織中，中間型肝細(xì)胞尚未出現(xiàn)，膽管反應(yīng)細(xì)胞即可表達(dá) s100a4， 同時(shí)可見(jiàn)膽管上皮細(xì)胞表達(dá) s100a4，提示在纖維化早期，膽管反應(yīng)細(xì)胞和膽管細(xì)胞可能通 過(guò) emt 在纖維化進(jìn)展中起作用。但是，在 5-6 期肝纖維化患者中，膽管反應(yīng)細(xì)胞和 s100a4/ck7 雙染陽(yáng)性細(xì)胞減少，同時(shí)中間型肝細(xì)胞在 5-6 期纖維化患者中數(shù)量增多，可見(jiàn) 較多的中間型肝細(xì)胞出現(xiàn)在雙染陽(yáng)性的膽管反應(yīng)周?chē)?。由此推測(cè)，在慢性乙型肝炎的纖維化 晚期，hpcs 以向肝細(xì)胞方向分化為主。另外，在慢性乙型肝炎肝組織中，-sma 陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞與膽管反應(yīng)鄰近分布， 未發(fā)現(xiàn) -sma 和 ck7 雙染陽(yáng)性的膽管反應(yīng)細(xì)胞、膽管細(xì)胞和肝細(xì)胞。提示在慢性乙型肝炎 患者中發(fā)生 emt 的主要是膽管反應(yīng)細(xì)胞或膽管細(xì)胞在向纖維細(xì)胞，先從膽管反應(yīng)或膽管中 遷移出來(lái)，然后其具有上皮特征的特征表達(dá)消失（如：ck7），同時(shí)具有間質(zhì)細(xì)胞特征的表 達(dá)出現(xiàn)（如：-sma）10。taura等14在20l0年的hepatology中公布了新的研究結(jié)果，使用三倍轉(zhuǎn)基因小鼠作為指 示，gfp陽(yáng)性的肝細(xì)胞不表達(dá)s100a4等間質(zhì)細(xì)胞特有的標(biāo)志物，認(rèn)為在肝纖維化的過(guò)程中 肝細(xì)胞沒(méi)有上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。該結(jié)論對(duì)既往肝纖維化中emt的發(fā)生提出了質(zhì)疑。scholten等15 研究也認(rèn)為在肝纖維化的過(guò)程中并不存在emt，從而掀起了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是否參與肝纖維 化的研究熱潮16-18。我們的研究只是初步觀察到肝纖維化組織中膽管反應(yīng)細(xì)胞和膽管上皮共 表達(dá)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的表型，提示與emt有關(guān)，今后不僅需要在更大樣本量進(jìn)一步驗(yàn) 證上述結(jié)論，更要從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)上進(jìn)一步驗(yàn)證，以便為肝纖維化發(fā)生發(fā)展機(jī)制的相 關(guān)研究補(bǔ)充理論基礎(chǔ)。4結(jié)論我們研究初步表明，慢性乙型肝炎患者膽管反應(yīng)細(xì)胞和膽管細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá)上皮細(xì)胞 和纖維細(xì)胞表型，提示其可能向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。參考文獻(xiàn) (references)1 forbes sj, russo fp, rey v, burra p, rugge m, wright na, alison mr. a significant proportion of myofibroblasts are of bone marrow origin in human liver fibrosisj. gastroenterology,2004,126(4):955-963.2 russo fp, alison mr, bigger bw, amofah e, florou a, amin f, bou-gharios g, jeffery r, iredale jp, forbessj. the bone marrowfunctionally contributes to liver fibrosisj. gastroenterology,2006,130(6):1807-1821.3 王慧，邢直直，賈繼東.上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)換或分化與肝纖維化發(fā)生的研究進(jìn)展j.中華肝臟病雜志，2011，19(3)：239-240.4 pinzani m. epithelial-mesenchymal transition in chronic liver disease: fibrogenesis or escape from death?j j hepatol,2011,55(2):459-465.5 choi ss, diehl am.epithelial-to-mesenchymal transitions in the liver j. hepatology, 2009, 50(6):2007-2013. 6 hendersonnc, iredalej p. liver fibrosis: cellular mechanisms of progression and 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