離心分離和沉淀分離.ppt

離 心 分 離,0 概述,固液分離的常用手段 分類：,離心沉降 離心過濾 超離心,1 離心沉降原理,球形粒子沉降,在離心力場中,1 離心沉降原理, 常速離心機 - 中速離心機 高速離心,離心機的種類與用途,按速度和離心力： 1、常速離心機 最大轉(zhuǎn)速8000rpm(r/min),相對離心力(RCF)104g以下,用于細胞、菌體和培養(yǎng)基殘渣等分離； 2、高速（冷凍）離心機 1104-2.5104rpm，相對離心力104105g,用于細胞碎片、較大細胞器、大分子沉淀物等分離； 3、超速離心機 轉(zhuǎn)速2.5-8104rpm，相對離心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白質(zhì)、細胞器、病毒分離純化；檢測純度；沉降系數(shù)和相對分子量測定等。,瓶式離心機,1）斜角式離心機 是一類結(jié)構最簡單的實驗室常用離心機， 指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子； 角度越大，沉降越結(jié)實，分離效果越好， 角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。 顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時， 先沿離心力方向撞向離心管， 然后再沿管壁滑向管底， 因此管的一側(cè)會出現(xiàn)顆粒沉積。,2）平拋式離心機 平拋式離心機一類結(jié)構簡單的實驗室常用的低中速離心機，轉(zhuǎn)速一般在 3000-6000rpm。 轉(zhuǎn)子活動管套內(nèi)的離心管，靜止時垂直掛在轉(zhuǎn)頭上，旋轉(zhuǎn)時隨著轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動，從垂直懸吊上升到水平位置（約200800rpm）。 顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子軸向移動。 樣品便于收集 受振動和變速攪亂后對流現(xiàn)象小， 但轉(zhuǎn)頭結(jié)構復雜，最高轉(zhuǎn)速相對要低 容量也小一些。,平拋式離心機轉(zhuǎn)子,2 離心沉降設備,瓶式離心機,也稱平拋式離心機 結(jié)構最簡單的實驗室常用的低，中速離心機， 轉(zhuǎn)速一般在 3000-6000rpm。,2 離心沉降設備,管式離心機,液-液分離；液-固分離 結(jié)構簡單 轉(zhuǎn)速很高 可連續(xù)操作（液-液）,2 離心沉降設備,碟式離心機,固體的沉降距離極短，分離效果較好。 碟片間的距離一般為0.52.5mm,與被分離物料的性質(zhì)有關。 液-液分離；液-固分離 連續(xù)操作,2 離心沉降設備,多室式離心機,增加了沉降面積，減少了沉降距離 同時還有粒度篩分的作用 常用于抗菌素液液萃取分離 間歇式生產(chǎn),管式離心機,3 離心沉降的計算,r,z,管壁,沉 淀 分 離,概述,沉淀（定義） 是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程。 沉淀具有選擇性 有選擇地沉淀雜質(zhì) 有選擇地沉淀所需成分,優(yōu)點：操作簡單、經(jīng)濟、濃縮倍數(shù)高 缺點：針對復雜體系而言，分離度不高、選擇性不強,概述,沉淀操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心（除去不溶性雜質(zhì)及細胞碎片）以后進行。 操作方式可分連續(xù)法或間歇法兩種，規(guī)模較小時，常采用間歇法。不管哪一種方式操作步驟通常按三步進行：,蛋白質(zhì)的溶解特性,蛋白質(zhì)是兩性高分子電解質(zhì) 在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內(nèi)部折疊的趨勢，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性強。 親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構的外表面。 蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構成。,蛋白質(zhì)分子表面的憎水區(qū)域和荷電區(qū)域,概述,沉淀法操步驟 ：,沉淀劑,粒子生長,收集沉淀物,過濾,離心,概述,沉淀法,（1）鹽析法； （2）等電點沉淀法； （3）有機溶劑沉淀法； （4）非離子型聚合物沉淀法； （5）聚電解質(zhì)沉淀法； （6）高價金屬離子沉淀法等。,除第（3）種有機溶劑沉淀法也能適用于抗生素等小分子外，其他各種方法只適用蛋白質(zhì)等大分子。,分類,蛋白質(zhì)鹽析,因此，可通過降低蛋白質(zhì)周圍的水化層和雙電層厚度（電位）降低蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀。,蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素,水化層,雙電層,使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液,靜電排斥作用,蛋白質(zhì)鹽析,中性鹽,蛋白質(zhì)脫水,中和電荷,沉淀,鹽析法機理,（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集， 將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子有很強的水化力，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質(zhì)分子因熱運動碰撞聚集。 （2）破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域，由于憎水區(qū)域間作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越易沉淀。 （3）中和電荷，減少靜電斥力， 中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力降低，導致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。,蛋白質(zhì)鹽析,鹽析用鹽的選擇,鹽析作用要強 鹽析用鹽需有較大的溶解度 鹽析用鹽必須是惰性的 來源豐富、經(jīng)濟,鹽析操作,蛋白質(zhì)鹽析,直接加入固體(NH4)2SO4 粉末，工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應分批加入，并充分攪拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高； 是加入硫酸銨飽和溶液，在實驗室和小規(guī)模生產(chǎn)中，或(NH4)2SO4 濃度不需太高時，可采用這種方式，它可防止溶液局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。,蛋白質(zhì)鹽析,陰離子： 檸檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3- 陽離子： NH4+ K+Na+ 高價陽離子 硫酸銨： （1） 價廉 ；（2） 溶解度大，穩(wěn)定蛋白質(zhì) ；（3）水解變酸；（4）高pH 釋氨，腐蝕；（5）殘留產(chǎn)品有影響。,鹽析效果,影響因素,蛋白質(zhì)鹽析,pH 變化,溫度變化,等電點附近有極小值,隨溫度升高減小，熱促失水膜,lgS,蛋白質(zhì)鹽析,鹽析注意事項：,(1) 穩(wěn)定pH 用磷酸緩沖液 （2）硫酸銨加入后體積變大 （3）選擇飽和度 （4）分步鹽析 （5）初始蛋白濃度, S=-s S蛋白質(zhì)的溶解度，g/L; I離子強度， I=1/2mizi2 mi離子 i的摩爾濃度； Zi所帶電荷 常數(shù)，圖中截距 Ks鹽析常數(shù)，圖中直線斜率,Cohn經(jīng)驗式 蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關系,等電點沉淀法,原理：,調(diào)pH至等電點，使蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相互吸引，形成沉淀。,適用于疏水性較強的蛋白質(zhì),pH=pI,等電點沉淀法,（1）適用于疏水性強的蛋白質(zhì) （2）中性鹽濃度增大時，等電點向偏 酸方向移動，同時最低溶解度會有所增大。 （3）無機酸通常價格便宜，無毒 （4）蛋白質(zhì)對低pH 敏感，易失活,操作注意事項,等電點沉淀實例,從豬胰臟中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI8.9，可先于pH 3.0左右進行等電點沉淀，除去共存的許多酸性蛋白質(zhì)(pI=3O)。 工業(yè)生產(chǎn)胰島素(pI5.3)時：先調(diào)pH至8.0除去堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)pH至3.0除去酸性蛋白質(zhì)(同時加入一定濃度的有機溶劑以提高沉淀效果)。,等電點沉淀法,細胞色素C洗脫液（離交）+ 硫酸胺（飽和度86%） 低溫離心 上清液調(diào) pH4.8- 5.1 產(chǎn)物 沉淀（雜蛋白）,有機溶劑沉淀法,概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。,優(yōu)點在于：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)等只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀；2）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易； 缺點是1）對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，2）操作要求在低溫下進行。3）成本高,A 降低溶劑介電常數(shù). B 破壞水化膜： C 相反力：,有機溶劑沉淀法機理,減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，,從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞水化層,疏水基團暴露并有機溶劑疏水基團結(jié)合形成疏水層,降低介電常數(shù) 破壞水化膜,常用的有機溶劑沉析劑,選擇依據(jù)： 水溶性要好 介電常數(shù)要小 致變性作用要?。状迹?毒性要小、揮發(fā)性適中 容易獲取 沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀劑 乙醇：沉析作用強，揮發(fā)性適中，無毒，常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣；,溫度 使用有機溶劑沉淀時，操作必須在低溫下進行，,有機溶劑沉淀法的影響因素,pH值： pH多控制在待沉蛋白質(zhì)的等電點附近。,舉例：固體發(fā)酵生產(chǎn)-淀粉酶的提取工藝研究 -淀粉酶（米曲霉）菌體