DB33- 399.4-2006 無公害南美白對(duì)蝦 第4部分：苗種.doc

DB33/T 2002浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2006-11-10實(shí)施2006-10-10發(fā)布無公害南美白對(duì)蝦第4部分：苗種Non-environmental pollution Penaeus Vannamei Larva Part 4: LarvaDB33/ 399.4 -2006代替DB33/T 464-2004DB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS 65.150B 51-IDB33/ 399.4-2006前 言本部分第5章為強(qiáng)制性條款。DB33/ 399無公害南美白對(duì)蝦分為四個(gè)部分：第1部分：苗種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范；第2部分：養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范；第3部分：產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；第4部分：苗種。本部分為 DB33/T 399的第4部分。本部分代替DB33/T 4642004無公害南美白對(duì)蝦苗種,本部分與DB33/T 4642004相比主要變化如下：標(biāo)準(zhǔn)屬性由推薦性調(diào)整為強(qiáng)制性；質(zhì)量安全要求中增加了氯霉素殘留、呋喃西林代謝物和呋喃唑酮代謝物三個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目；調(diào)整了質(zhì)量安全要求中的部分技術(shù)參數(shù)指標(biāo)；增加了二個(gè)資料性附錄。本部分附錄A和附錄B為資料性附錄。本部分由浙江省水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)提出并歸口。本部分起草單位：浙江省水產(chǎn)引種育種中心。本部分主要起草人：徐曉林、杜建明、梅凱先、張海琪、黃家慶。本部分所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：DB33/T 4642004。I無公害南美白對(duì)蝦第4部分：苗種1 范圍本部分規(guī)定了無公害南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei Booen）苗種的術(shù)語和定義、感官要求、質(zhì)量安全要求、檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)規(guī)則。本部分適用于無公害南美白對(duì)蝦苗種質(zhì)量安全評(píng)定。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本部分的引用而成為本部分的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本部分，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本部分達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本部分。DB33/ 399.3 無公害南美白對(duì)蝦 第3部分: 產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DB33/T 599-2006 水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法FDA/ORA/DFS LIB4303 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析小龍蝦肉中的氯霉素3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本部分。3.1SPF蝦苗無特定病原的蝦苗。3.2淡化苗出苗池鹽度蝦苗淡化至出苗時(shí)育苗池水的鹽度。3.3淡化時(shí)間蝦苗從開始淡化至淡化到池水一定鹽度所需的時(shí)間。3.4規(guī)格合格率符合全長規(guī)格要求（0.7）的個(gè)體數(shù)占苗種總數(shù)的百分比。3.5附著性纖毛蟲帶病率患有附著性纖毛蟲的個(gè)體數(shù)占苗種總數(shù)的百分比。3.6死亡率死亡個(gè)體數(shù)占苗種總數(shù)的百分比。4 感官要求蝦苗個(gè)體大小均勻，體色透明，體表干凈，活力強(qiáng)，并符合DB33/ 399.3的規(guī)定。5 質(zhì)量安全要求苗種質(zhì)量安全要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。表1 無公害南美白對(duì)蝦苗種質(zhì)量安全指標(biāo)序號(hào)項(xiàng) 目要 求1蝦苗全長 cm 0.72 規(guī)格合格率 803 淡化苗淡化時(shí)間 d54淡化苗出苗池鹽度 37附著性纖毛蟲帶病率 18死亡率 0.29白斑病毒和桃拉病毒不得檢出8綠霉素殘留 g/kg不得檢出9呋喃西林代謝物 g/kg不得檢出10呋喃唑酮代謝物 g/kg不得檢出為低鹽度（3）和淡水地區(qū)養(yǎng)殖用苗時(shí)的質(zhì)量檢測要求。6 檢驗(yàn)方法和規(guī)則6.1 組批以待出售蝦苗的育苗池為一個(gè)檢驗(yàn)批，銷售前按批抽檢，抽檢率為同批待出售蝦苗育苗池?cái)?shù)量的10%20%。6.2 規(guī)格合格率蝦苗先用碘液殺死，在解剖鏡下或用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量。每次抽檢數(shù)量不少于50尾。6.3 淡化苗出苗池鹽度從苗池隨機(jī)取水樣三次，測量水樣的鹽度，以三次的算術(shù)平均值為其結(jié)果。6.4 死亡率從苗池的表、中、底三層各隨機(jī)取樣一次，每次抽檢數(shù)量不少于2000尾，直接觀察檢驗(yàn)，以三次的算術(shù)平均值為其結(jié)果。6.5 附著性纖毛蟲帶病率從苗池的表、中、底三層各隨機(jī)取樣一次，每次抽檢數(shù)量不少于2000尾，用肉眼或解剖鏡檢查，以三次的算術(shù)平均值為其結(jié)果。6.6 白斑病毒(WSSV)和桃拉病毒(TSV) 從苗池隨機(jī)取樣三次，每次抽檢數(shù)量為100尾200尾，用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法檢測（參見附錄A和附錄B）。6.7 氯霉素測定按FDA/ORA/DFS LIB4303的規(guī)定執(zhí)行。6.8 呋喃西林代謝物和呋喃唑酮代謝物的測定按DB33/T 599-2006的規(guī)定執(zhí)行。6.9 判定規(guī)則6.9.1 苗種質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果全部達(dá)到第五章規(guī)定的各項(xiàng)指標(biāo)要求，則判本批次苗種合格。6.9.2 檢驗(yàn)結(jié)果中有一項(xiàng)指標(biāo)要求不合格，允許加倍抽樣復(fù)檢此項(xiàng)指標(biāo)一次，復(fù)檢仍不合格的，則判本批次苗種不合格。檢驗(yàn)結(jié)果中有兩項(xiàng)及兩項(xiàng)以上指標(biāo)不合格，則判本批次苗種不合格。1附錄A（資料性附錄）對(duì)蝦白斑桿狀病毒（WSBV）PCR檢測方法A.1 試劑和儀器A.1.1 試劑對(duì)蝦白斑桿狀病毒（WSBV）-PCR檢測試劑盒（國家海洋局第三研究所開發(fā)）。其中，要求4冷藏保存的有：DNA提取裂解液1瓶，吸附液1支，洗滌液1瓶，電泳緩沖液1瓶，滅菌牙簽1包，瓊脂糖粉（含EB）1支；-20冷凍保存的有：含PCR混合液反應(yīng)管12支，WSBV-PCR穩(wěn)定液1支，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各1支，蒸餾水1支。注：瓊脂糖粉因含核酸染色劑溴化乙啶，有毒！制膠時(shí)帶手套操作，避免接觸皮膚。A.1.2 儀器及耗材A.1.2.1 PCR擴(kuò)增儀。A.1.2.2 臺(tái)式高速離心機(jī)。A.1.2.3 微型混合器。A.1.2.4 加樣槍。A.1.2.5 電泳儀。A.1.2.6 電泳槽。A.1.2.7 紫外檢測燈。A.1.2.8 0.5毫升離心管。A.1.2.9 200微升加樣槍頭。A.1.2.10 不銹鋼鑷子。A.1.2.11 一次性手套。A.1.3 檢測步驟A.1.3.1 樣品的選取取10毫克對(duì)蝦或其它蝦池生物組織。仔蝦或幼蝦可取整只，成蝦可用鑷了取其心臟、真皮、鰓、腸或消化腺等組織。A.1.3.2 樣品的處理a) 將取得的蝦組織置于0.5毫升規(guī)格小管內(nèi)，滴入10滴DNA提取裂解液，用滅菌牙簽搗絞1分鐘2分鐘。b) 將內(nèi)置搗碎后蝦組織的小管放入臺(tái)式高速離心機(jī)，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新管內(nèi)，加入20微升吸附液（內(nèi)含白色物質(zhì)，用前充分搖勻），混勻。室溫放置5分鐘，其間搖勻3次。c) 將混勻后的新管以10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，棄去上清液，再離心5秒，用加樣槍吸干殘余液體，滴入10滴洗滌液于沉淀中，用加樣槍頭輕輕攪動(dòng)使沉淀充分懸浮起來。d) 再以10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，棄去上清液，再離心5秒，用加樣槍吸干殘余液體，將沉淀置于PCR儀上60加熱3分鐘（打開離心管蓋）。e) 加20微升蒸餾水，充分懸浮沉淀。再以10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，吸取上清液2微升于反應(yīng)管中（內(nèi)含紅色反應(yīng)液），再補(bǔ)加WSBV-PCR穩(wěn)定液13微升，用混合器混勻，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，即可作PCR反應(yīng)。陽性及陰性對(duì)照組不需處理，直接取2微升于反應(yīng)管中再補(bǔ)加WSBV-PCR穩(wěn)定液13微升做PCR即可。A.1.3.3 PCR反應(yīng)A.1.3.3.1 PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置先952分鐘；然后9430秒/6860秒，共40個(gè)循環(huán)；最后68延伸2分鐘。A.1.3.3.2 電泳檢測PCR反應(yīng)完畢后，取下層紅色液體10微升作電泳檢測，時(shí)間20分鐘30分鐘。A.1.3.4 檢測結(jié)果判定將電泳完畢后的樣品，置于紫外燈下觀察，陽性對(duì)照泳道應(yīng)有一條300bp的清晰亮帶；陰性對(duì)照組在此平行位置無帶；對(duì)樣品如在此平行位置有一條帶，則表明該樣品含有病毒，若在此平行位置無帶則該樣品不含病毒。A.1.4 注意事項(xiàng)a） 試劑盒中含有液體的離心管使用前先在離心機(jī)上離心幾秒鐘，將液體離心到管底；b） 塑料滴瓶在使用前先搖勻，旋下蓋子，輕輕擠壓瓶子，正確滴下所需的滴數(shù)；c） 加樣槍頭和牙簽均一次性使用，以防止交叉污染；d） 電泳緩沖液用前請(qǐng)稀釋50倍。瓊脂糖粉加入25毫升稀釋的電泳緩沖液，置于三角燒瓶中，煮沸2次3次，瓊脂糖粉溶解變清即可用制膠板制凝膠，也可以用微波爐加熱溶解制膠。e） 本試劑盒在-20保存時(shí)，有效期為一年。 附錄B（資料性附錄）對(duì)蝦桃拉病毒（TSV）PCR檢測方法B.1 試劑和儀器B.1.1 試劑對(duì)蝦桃拉病毒（TSV）-PCR檢測試劑盒（國家海洋局第三研究所開發(fā)）。其中，要求4冷藏保存的有：DNA提取裂解液1瓶，吸附液1支，洗滌液1瓶，電泳緩沖液1瓶，滅菌牙簽1包，瓊脂糖粉（含EB）1支；-20冷凍保存的有：含RT混合液反應(yīng)管12支，TSV-PCR穩(wěn)定液1支，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各1支，蒸餾水1支，紅色反應(yīng)液1支。注：瓊脂糖粉因含核酸染色劑溴化乙啶，有毒！制膠時(shí)帶手套操作，避免接觸皮膚。B.1.2 儀器及耗材B.1.2.1 PCR擴(kuò)增儀。B.1.2.2 臺(tái)式高速離心機(jī)。B.1.2.3 微型混合器。B.1.2.4 加樣槍。B.1.2.5 電泳儀。B.1.2.6 電泳槽。B.1.2.7 紫外檢測燈。B.1.2.8 0.5毫升離心管。B.1.2.9 200微升加樣槍頭。B.1.2.10 不銹鋼鑷子。B.1.2.11 一次性手套。B.1.3 檢測步驟B.1.3.1 樣品的選取取10毫克對(duì)蝦或其它蝦池生物組織。仔蝦或幼蝦可取整只，成蝦可用鑷了取其心臟、真皮、鰓、腸或消化腺等組織。B.1.3.2 樣品的處理a） 將取得的蝦組織置于0.5毫升規(guī)格小管內(nèi)，滴入10滴DNA提取裂解液，用滅菌牙簽搗絞1分鐘2分鐘。b） 將內(nèi)置搗碎后蝦組織的小管放入臺(tái)式高速離心機(jī)，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新管內(nèi)，加入20微升吸附液（內(nèi)含白色物質(zhì)，用前充分搖勻），混勻。室溫放置5分鐘，其間搖勻3次。c） 將混勻后的新管以10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，棄去上清液，再離心5秒，用加樣槍吸干殘余液體，滴入10滴洗滌液于沉淀中，用加樣槍頭輕輕攪動(dòng)使沉淀充分懸浮起來。d） 再以10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，棄去上清液，再離心5秒，用加樣槍吸干殘余液體，將沉淀置于PCR儀上60加熱3分鐘（打開離心管蓋）。e） 加20微升蒸餾水，充分懸浮沉淀。再以10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒，吸取上清液2微升于反應(yīng)管中（內(nèi)含紅色反應(yīng)液），用混合器混勻，于42保溫半小時(shí)，再補(bǔ)加紅色反應(yīng)液5微升及TSV-PCR穩(wěn)定液15微升， 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心3秒，即可作PCR反應(yīng)。陽性對(duì)照及陰性對(duì)照組不需處理，直接取2微升于反應(yīng)管中于42保溫半小時(shí)，再補(bǔ)加紅色反應(yīng)液5微升及TSV-PCR穩(wěn)定液15微升做PCR即可。B.1.3.3 PCR反應(yīng)B.1.3.3.1 PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置先952分鐘；然后9430秒/6860秒，共40個(gè)循環(huán)；最后68延伸2分鐘。B.1.3.3.2 電泳檢測PCR反應(yīng)完畢后，取下層紅色液體10微升作電泳檢測，時(shí)間20分鐘30分鐘。B.1.3.4 檢測結(jié)果判定將電泳完畢后的樣品，置于紫外燈下觀察，陽性對(duì)照泳道應(yīng)有一條210bp的清晰亮帶；陰性對(duì)照組在此平行位置應(yīng)無帶；對(duì)樣品如在此平行位置有一條帶，則表明該樣品