植物離體細(xì)胞發(fā)育的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ).ppt

第三章 植物離體細(xì)胞發(fā)育的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ),3-1 植物細(xì)胞的離體發(fā)育,一.花粉小孢子離體發(fā)育途徑,花粉孢子體的發(fā)育途徑可主要?dú)w納為為a,b,c三條 (sunderland ，1974)： （一）a 途徑(a route)： 特點(diǎn)：小孢子第一次有絲分裂仍按配子體方式 進(jìn)行：即非均等有絲分裂，形成一個(gè)營養(yǎng)核（v） 和一個(gè)生殖核（g） ，并經(jīng)不同分裂形成多細(xì)胞花 粉粒和多細(xì)胞團(tuán)。,a-v 途徑：營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育成單倍性胚狀體，生殖細(xì)胞退化消失。在煙草、顛茄、大麥、黑麥、小麥、水稻、玉米等中存在。 a-g 途徑：生殖細(xì)胞發(fā)育成單倍性胚狀體，營養(yǎng)細(xì)胞退化消失。在天仙子中發(fā)現(xiàn)此途徑。,（二）c 途徑(c route)：,生殖細(xì)胞和營養(yǎng)細(xì)胞先融合后分裂，共同形成多 細(xì)胞花粉，產(chǎn)生非單倍體植株。在此途徑中，常會(huì) 發(fā)生生殖核的核內(nèi)復(fù)制（endoreduplication of generator）。在毛葉蔓陀羅和小麥中發(fā)現(xiàn)此途 徑。,（三）b 途徑（b route ）,特點(diǎn)：花粉單核小孢子第一次核內(nèi)有絲分裂為 均等分裂。即小孢子分裂成兩個(gè)大致相等、類似分生 細(xì)胞的營養(yǎng)型細(xì)胞，并連續(xù)不同分裂，形成不同倍性 的多細(xì)胞花粉。 其典型作物是毛葉曼陀羅，在小麥、小黑麥、水 稻、橡膠、楊樹、玉米等植物中已見到這種發(fā)育途 徑。大概有三種方式：, b-1 形成的兩個(gè)營養(yǎng)型細(xì)胞在以后的幾次分裂中是同步的，則大多數(shù)以胚狀體的形式形成花粉胚。 b-2 形成的兩個(gè)營養(yǎng)型細(xì)胞在以后的幾次分裂中是不同步的，其中一個(gè)停止分裂，或快或慢分裂，并存在于花粉的一側(cè)。另一個(gè)經(jīng)過相當(dāng)長時(shí)間的持續(xù)分裂，則形成愈傷組織。 b-3 形成的兩個(gè)營養(yǎng)型細(xì)胞在不同時(shí)期發(fā)生核融合或核內(nèi)復(fù)制，結(jié)果產(chǎn)生不同倍性的花粉胚。,（四）e 途徑（e route）,特點(diǎn)：花粉內(nèi)的營養(yǎng)核和生殖核獨(dú)立分裂，形成 兩類細(xì)胞群，各群的子細(xì)胞都類似于其母細(xì)胞。,近年來在蔓陀羅、水稻、玉米中發(fā)現(xiàn)了此途徑。,研究花粉發(fā)育途徑的意義:,研究花粉孢子體啟動(dòng)第一次分裂的條件，揭示小 孢子發(fā)育過程中各種誘導(dǎo)因子對(duì)離體花藥(花粉)培養(yǎng) 的必要性。 如2,4-d對(duì)對(duì)愈傷組織的形成是必需的，而胚狀體 的形成不是必需的； 有利于研究花粉氈絨層細(xì)胞等其他花藥組織細(xì)胞 的作用，研制大幅度提高花粉胚誘導(dǎo)頻率的新技術(shù)：,如nitsch曾經(jīng)計(jì)算過煙草一個(gè)花藥具有產(chǎn)生1440 棵植株的潛力，而實(shí)際上只能形成30多個(gè)植物體； 了解不同倍性花粉植株的來源，為雜交育種提 供原始材料：只有純合二倍體植株，才是育種的最 理想的和需要的； 研究細(xì)胞分化和胚胎發(fā)生規(guī)律。花粉發(fā)育是從 單細(xì)胞開始的，追蹤研究從單細(xì)胞到完整植物體的 全過程，有利于研究胚胎發(fā)育中的調(diào)控機(jī)理。,二. 胚珠和雌核的發(fā)育途徑,大孢子母細(xì)胞 (胚囊母細(xì)胞),單倍性的四分體,減數(shù)分裂,只有遠(yuǎn)離珠孔端的一個(gè)細(xì)胞發(fā)育,胚囊細(xì)胞,8細(xì)胞胚囊,3次有絲分裂,1. 雌核發(fā)育,由單核至成熟胚囊時(shí)期均能誘導(dǎo)雌配子體的細(xì)胞 發(fā)育成愈傷組織。但直到形成成熟胚囊時(shí)，才啟動(dòng) 向愈傷組織發(fā)育。 2.子房和胚珠培養(yǎng)中的胚胎發(fā)生 在子房和胚珠培養(yǎng)中，除胚囊細(xì)胞發(fā)形成再生植 株外，胚囊以外的珠柄、珠被和子房壁細(xì)胞均有可 能發(fā)育形成不定胚而產(chǎn)生二倍體再生株。,由未授粉的胚囊形成愈傷組織大致有兩種可能： 孤雌生殖：由未授精的卵細(xì)胞 單倍體無融合生殖 形成單倍體胚 （減數(shù)的胚囊） 無胚子生殖：由助細(xì)胞、反足 細(xì)胞發(fā)育成單倍體胚 二倍體無融合生殖：由胚囊中未經(jīng)減數(shù)分裂的孢 原細(xì)胞形成二倍體胚。,水稻未授粉子房培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，再生的單倍體小植株來自于助細(xì)胞無胚子生殖(周嫦等，1981；黃群飛等，1982)。 大米胚囊中的卵細(xì)胞、反足細(xì)胞、助細(xì)胞都可能產(chǎn)生胚，并認(rèn)為,卵細(xì)胞和反足細(xì)胞起源的原胚再生植株較好，助細(xì)胞僅產(chǎn)生愈傷組織。,3-2 體細(xì)胞離體再生的基本類型及特點(diǎn),一. 不定芽型(adventitous bud type) 芽外植體 不定芽 再生植株。 特點(diǎn): 利用外植體原有的芽，不僅繁殖率高,而且能保持該植物和的遺傳穩(wěn)定性。,芽-芽型,大蒜莖尖培養(yǎng),二.直胚型（embryo）,特點(diǎn)：遺傳性一致，但繁殖率低。,種子或胚 芽（帶芽原球莖) 植株。,桃幼胚培養(yǎng),直胚型（embryo）,桃兒七幼胚培養(yǎng),三.器官型(organ type),器官外植體 不定芽 再生植株。 如石龍芮、煙草、水仙、百合、風(fēng)信子、貝母的 鱗片培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽等； 特點(diǎn)：遺傳性較穩(wěn)定，繁殖速度較快。,非芽-芽型,石龍芮下胚軸胚狀體的發(fā)生 a、培養(yǎng)一個(gè)月的幼苗，下胚軸上產(chǎn)生許多胚狀體；b、下胚軸部分放大；c、兩個(gè)表皮細(xì)胞；dg 原胚發(fā)生過程；j、心形胚狀體；h、i 已分化子葉、胚根及原維管束的胚狀體。,器官外植體 愈傷組織 分化再生植株。 特點(diǎn)：繁殖速度快，但遺傳性不穩(wěn)定。,四.器官發(fā)生型（organogenesis),葉片、花藥 莖尖、根,五.類胚體發(fā)生型(embryogenesis),植物器官、組織和細(xì)胞 胚狀體 再 生成苗。 特點(diǎn)：遺傳性一致，有些植物繁殖率較高。如 胡蘿卜1 l培養(yǎng)基有10萬個(gè)以上的胚狀體。,未授粉 胚珠,植株,3-3 離體細(xì)胞胚胎發(fā)育的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ),一. 體細(xì)胞胚發(fā)生的細(xì)胞胚胎學(xué)過程,(一）單子葉植物的胚胎發(fā)生,1.合子胚發(fā)生的基本特點(diǎn) 植物有性繁殖中,卵細(xì)胞受精后稱為合子(zygote),它經(jīng)預(yù) 定的發(fā)育方式產(chǎn)生胚(embryo),故胚的發(fā)育是從合子開始。在 胚發(fā)育早期,從二細(xì)胞胚至器官分化之前的胚胎發(fā)育階段稱為 原胚(proembryo)時(shí)期。合子的第一次分裂為不均等分裂。,2.體細(xì)胞胚發(fā)生的基本特點(diǎn),1）發(fā)生過程與合子相似: 在離體條件下誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生與相應(yīng)的合子 胚發(fā)生過程大同小異：,2、體細(xì)胞胚的第一次分裂雖多為不均等分裂，但也有近似的均等分裂。,3、 胚性細(xì)胞發(fā)生具有不同步性,胚性細(xì)胞的繼續(xù)分裂形成多細(xì)胞原胚。由于胚性 細(xì)胞分裂是不同步的,因此在同一張切片上既可看到 單個(gè)的胚性細(xì)胞,又可見到二細(xì)胞,三細(xì)胞和四細(xì)胞， 以致多細(xì)胞原胚并存的多樣化原胚細(xì)胞群體。, 不同步產(chǎn)生的原因：,從脫分化形成愈傷組織后,再轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)分化胚性細(xì)胞時(shí),細(xì)胞狀態(tài)和啟動(dòng)分裂的不一致,而存在多樣化的原胚細(xì)胞群。 在某些條件下,體細(xì)胞胚發(fā)生是有先后或反復(fù)進(jìn)行的,新的胚胎發(fā)生中心有可能從原胚細(xì)胞群中或從胚體中產(chǎn)生。,克服不同步的可能方法,提高接種物的均勻性： 在培養(yǎng)基中加入dna合成抑制劑 轉(zhuǎn)移培養(yǎng) 時(shí)過篩分離； 通過在含2%蔗糖的16%ficoll溶液中離 心過濾 將分離物轉(zhuǎn)至無激素培養(yǎng)基上即可同步； 抑制額外或次生胚的產(chǎn)生： 使用aba。有實(shí)驗(yàn)證明，aba在控制“重復(fù)胚胎發(fā) 生”或“畸形胚”的形成是有效的。,（二）雙子葉植物的胚胎發(fā)生,1.合子胚的發(fā)生特點(diǎn) 雙子葉植物與單子葉植物之間有相似的發(fā)育形態(tài)： 成熟胚都包含一個(gè)具子葉的胚軸(embryonal axis)， 分為上胚軸(epicotyl),和下胚軸(hypocotyl)。最 下端產(chǎn)生胚根(radicle)。被子植物中單子葉植物一 片子葉, 雙子葉植物兩片子葉。,雙子葉植物胚胎發(fā)生的細(xì)胞學(xué)特征（擬南芥） 不同線條表示胚胎與幼苗之間結(jié)構(gòu)上的對(duì)應(yīng)關(guān)系,2.體細(xì)胞胚發(fā)生的基本特點(diǎn),與合子胚相似，仍存在不同步問題等。 胚性細(xì)胞多由愈傷組織表層或近表層的薄壁細(xì)胞 分化而來：其核大，位于細(xì)胞中央，質(zhì)濃，第一次 有絲分裂既可不均等分裂，也可為均等分裂：,二. 體細(xì)胞胚發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)與生物化學(xué),（一）胚性細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 1、核增大，細(xì)胞器數(shù)量增多： 特別是線粒體 (mitochondrion) 數(shù)量明顯增加。,愈傷組織圓形薄壁細(xì)胞的核增大,核仁著色深,一般具 有兩個(gè)以上的核仁，大液泡消失，細(xì)胞質(zhì)電子密度明顯加強(qiáng)，質(zhì)體plastid),核糖體(ribosome)，特別是線 粒體 (mitochondrion) 數(shù) 量明顯增加,同時(shí)核糖體不僅數(shù)量增加,而且聚集成多聚核糖體(polyri-bosome or polysome)。,2. 廣泛存在著胞間連絲(plasmodesmata)：,早期胚性細(xì)胞與周圍細(xì)胞間還存在廣泛的胞間連絲通過胞間連絲傳遞物質(zhì)和信號(hào)，為胚性細(xì)胞的進(jìn)一步分化與發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。,3. 細(xì)胞膜上有分泌泡的形成：,其內(nèi)含一些被消化的細(xì)胞器和殘?jiān)?4.細(xì)胞拉長，核偏移,細(xì)胞壁加厚，細(xì)胞器持續(xù)增加：,隨著胚性細(xì)胞的發(fā)育,細(xì)胞拉長，核偏移,細(xì)胞壁加厚，線粒體（m）數(shù)目進(jìn)一步增加,常連片分布于細(xì)胞質(zhì)中,既有大量游離核糖體,又有多聚核糖體存在,并出現(xiàn)高爾基體(golgibody)和微管(microtu- bule)等。,小麥體細(xì)胞胚微結(jié)構(gòu)的變化,小結(jié),體細(xì)胞胚胎發(fā)生的脫分化與再分化。 體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程與合子胚類似，第一次分裂多為不均等分裂，也有近似的均等分裂。但胚性細(xì)胞發(fā)生具有明顯的不同步性。 胚性細(xì)胞核增大，偏移,細(xì)胞器數(shù)量增多，特別是線粒體 數(shù)量明顯增加。細(xì)胞壁加厚，且存在著胞間連絲。,（二）體細(xì)胞胚發(fā)生的生物化學(xué),1、atpase增高并逐漸 由質(zhì)膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),推測：胚性細(xì)胞是通過外 源激素的誘導(dǎo)而啟動(dòng)的。因 為外源激素作用的部位是質(zhì) 膜，首先誘導(dǎo)膜蛋白的合 成，于是導(dǎo)致膜atp酶活性 提高。,后期：atp酶活性從細(xì) 胞質(zhì)膜逐漸轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)， 并在細(xì)胞壁的加厚處也出 現(xiàn)atp酶活性反應(yīng)的沉積 物。,推測：處于“生理隔離”晚期的胚性細(xì)胞或胚性細(xì)胞團(tuán)一直處于一個(gè)厚壁包圍之中，與其周圍細(xì)胞之間的胞間連絲也消失。atp酶的廣泛存在和保持較高活性為胚性細(xì)胞或原胚的一系列代謝提供了能量保證。,2. 蛋白質(zhì)含量升高,胚性愈傷組織蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)高于非胚性愈傷組織； 體細(xì)胞胚的可溶性蛋白質(zhì)含量高于胚性愈傷組織； 體細(xì)胞胚發(fā)育過程中，蛋白質(zhì)含量高低依次為：（ g ） 以成熟胚為單位,可溶性蛋白質(zhì)含量隨胚體的增加而升高。,3.淀粉含量有所增加,淀 粉 粒 初期 發(fā)育中的 二細(xì)胞 多細(xì)胞 球形胚 成熟胚 胚性細(xì)胞 胚性細(xì)胞 原胚 原胚,小麥體細(xì)胞胚發(fā)生過程中淀粉粒消長動(dòng)態(tài)與小麥合子胚基本一致； 單子葉與雙子葉植物體細(xì)胞胚發(fā)生過程中淀粉粒消長動(dòng)態(tài)趨勢相似；,4.dna含量增加明顯,應(yīng)用3h-胸苷(3h- dt)標(biāo)記,放射自顯影方法研究表明:愈傷組織轉(zhuǎn)入“胚發(fā)生培養(yǎng)”4h后，標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)和標(biāo)記量逐漸增加，到“球形胚”時(shí)dna合成速率達(dá)到最高峰.,隨著體細(xì)胞胚的發(fā)育,dna合成明顯增加:,8 8 2 2,5.內(nèi)源激素含量升高,(1) 胚性愈傷組織(ec)的內(nèi)源激素含量遠(yuǎn)高于非胚性愈傷組織 (nec)； (2)胚性細(xì)胞中內(nèi)源ga水平較低，非胚性細(xì)胞中較高。ga可能對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生有負(fù)作用；,(3) aba/iaa和aba/ga的比值一直是ec高于nec，顯然豐富的內(nèi)源激素含量，可能是體細(xì)胞脫分化并形成胚性細(xì)胞和保持胚胎發(fā)生能力不可缺少的因素； (4) 補(bǔ)加適量的外源aba（4moll-1），可明顯提高體細(xì)胞胚發(fā)生的頻率與質(zhì)量（促進(jìn)發(fā)生和抑制畸形胚）。 (5) aba合成抑制劑不僅降低內(nèi)源aba 含量,而且抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生。,3-4 體細(xì)胞胚的起源與遺傳穩(wěn)定性,一. 體細(xì)胞胚的起源 1. 絕大多數(shù)體細(xì)胞胚是起源于單細(xì)胞，證據(jù)： 從多種植物中都觀察到單個(gè)的胚性細(xì)胞、均等分裂的和不均等分裂的二細(xì)胞原胚； 在一塊愈傷組織中或一張切片上可觀察到多個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的體細(xì)胞胚。,在紅豆草單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中也觀察到單個(gè)胚性細(xì)胞具有明顯極性，第一次分裂多為不等分裂，頂細(xì)胞繼續(xù)分裂形成多細(xì)胞原胚，基細(xì)胞進(jìn)行少數(shù)幾次分裂形成胚柄。 在石防風(fēng)懸浮培養(yǎng)的體細(xì)胞中也觀察到無絲分裂，其中多為縊縮分裂，形成兩個(gè)細(xì)胞核；,3h-胸苷(3h-dt)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明,開始是愈傷組織外層少數(shù)細(xì)胞被標(biāo)記。接著另一些薄壁細(xì)胞被標(biāo)記，這部分的細(xì)胞從形態(tài)上相繼轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞。,2.關(guān)于來源于多細(xì)胞的問題,用同位素脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)可以證明，一些形成的胚性 細(xì)胞團(tuán)也是由一個(gè)單細(xì)胞連續(xù)分裂而形成的。當(dāng)然也 不排除有些植物的體細(xì)胞胚的確是起源于多細(xì)胞的， 有待深入研究。,3. 體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚性細(xì)胞的漸變理論,即一個(gè)細(xì)胞系的發(fā)生與形成是一個(gè)特定基因組中 基因活化的結(jié)果： 一是預(yù)定階段，即細(xì)胞在脫分化時(shí)基因所處的 特殊狀態(tài)（預(yù)定性）； 二是表達(dá)階段，在適合的 誘導(dǎo)條件下,預(yù)定的細(xì)胞發(fā)生一系列的生理生化和形 態(tài)上的變化,表現(xiàn)出分化的特性。這一特性是不穩(wěn)定 的。,通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分、激素組成與配比繼續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo),二.極性與生理隔離,1.體細(xì)胞胚胎發(fā)生的“雙極性(double polarity)”： 垂周分裂和平周分裂 極性分化的誘導(dǎo)因素：植物激素和外界刺激引起 不均等分裂和基因表達(dá)產(chǎn)物的不均勻分布： 合子在休眠期中，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都集中在一端, 形態(tài)發(fā)生顯著的變化。,小麥的胚性細(xì)胞的細(xì)胞核和質(zhì)向一端偏移, 細(xì)胞器、核糖體和質(zhì)體等都有區(qū)域性集中分布現(xiàn)象,并和細(xì)胞核偏移的方向一致。 紅豆草體細(xì)胞胚、胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)生中，dna和rna的合成同樣具有極性化集中區(qū)域。,2.生理隔離(physiological isolation)：,即胚性細(xì)胞與周圍細(xì)胞或組織形成明顯界限的現(xiàn)象。 “細(xì)胞生理隔離”與“組織生理隔離”？ 合子胚： 被子植物的胚囊減數(shù)分裂后,形成的大孢子是與周圍細(xì)胞處于分開的狀態(tài)。 在小孢子發(fā)生時(shí),小孢子母細(xì)胞在減數(shù)分裂前期也與絨氈層的細(xì)胞間沒有聯(lián)系。,體細(xì)胞胚：, steward從胡蘿卜體細(xì)胞胚胎發(fā)生中同樣觀察到與母體組織或外植體的維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)系，處于相對(duì)獨(dú)立的狀態(tài)。 多種植物中都觀察到,早期的胚性細(xì)胞與周圍細(xì)胞還存在胞間連絲,但隨著胚性細(xì)胞的發(fā)育,細(xì)胞壁加厚,胞間連絲消失或被堵塞。胚性細(xì)胞開始分裂,從二細(xì)胞原胚到多細(xì)胞原胚始終被厚壁所包圍,與周圍細(xì)胞形成明顯的界限。,3.發(fā)育竟?fàn)幀F(xiàn)象,胚性細(xì)胞形成后，并不是所有的都能進(jìn)一步發(fā)育 成體細(xì)胞胚，這里除了培養(yǎng)誘導(dǎo)條件外，細(xì)胞間的 相互作用與競爭是重要的因素。 只有那些從周圍細(xì)胞獲得能量、物質(zhì)的那些胚性 細(xì)胞才可繼續(xù)分裂和分化：,證據(jù)： 在這些胚胎迅速發(fā)育過程中，相鄰細(xì)胞逐漸處于 解體狀態(tài)，以致在體細(xì)胞胚周圍出現(xiàn)較大的縫隙， 與其鄰近細(xì)胞隔離開處于相對(duì)獨(dú)立的情況。 因而如何改善條件,減少細(xì)胞間相互競爭作用是提 高體細(xì)胞胚發(fā)生頻率的重要途徑。,由此推測,在胚性細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)育過程中處于相對(duì)獨(dú)立狀態(tài),有利于胚胎發(fā)生潛力的表達(dá)。但生理隔離也只是相對(duì)的,并不意味著它們與周圍組織在生理上完全隔離開,在體細(xì)胞胚發(fā)生與發(fā)育過程中,必須從周圍細(xì)胞中取得營養(yǎng)、能量和激素等,不僅有相互依存關(guān)系,而且有相互競爭的關(guān)系。生理隔離可能是營養(yǎng)競爭的結(jié)果。,三.遺傳穩(wěn)定性與變異性,1.遺傳穩(wěn)定性： 一般認(rèn)為,通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑形成再生植株是 相對(duì)穩(wěn)定的。理論依據(jù)是： 只有那些未經(jīng)過畸變的細(xì)胞才有可能形成體細(xì)胞胚。 人工種子的制作,優(yōu)良種質(zhì)的保存和無性系繁殖等,正是基于體細(xì)胞胚的基因型與原親本的相同性。,2. 變異性發(fā)生的普遍性,小麥幼胚作為外植體,通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑建立體細(xì)胞無性系,在其后代中出現(xiàn)廣泛的變異,包括單基因控制的質(zhì)量性狀變異,如粒色、蠟性和穎色變異;多基因控制的數(shù)量性狀變異,如株高、抽穗期變異等。 寧夏枸杞葉片離體培養(yǎng)形成的再生植株根尖細(xì)胞染色體發(fā)生明顯變異。,60.64,64.30, 無性系的變異是極其廣泛的：,五種不同愈傷組織的染色體變異 愈傷組織來源 觀察細(xì)胞數(shù) 變異細(xì)胞數(shù) 變異頻率(%) 變異范圍 煙草葉片(n=24) 127 98 77.2 896 枸杞葉片(2n=24) 126 81 64.3 648 伊貝母鱗莖(2n=24) 64 39 60.9 1360 白蘭瓜子葉(2n=24) 217 166 76.5 8162 山黧豆胚根(2n=14) 211 155 73.5 6140,3.染色體數(shù)量與結(jié)構(gòu)變異的原因：,數(shù)量變異：如核融合、核內(nèi)有絲分裂、核內(nèi)染色體復(fù)制等產(chǎn)生整倍多倍體；一些不正常的有絲分裂則導(dǎo)致產(chǎn)生非整倍體，如多極分裂、落后染色體、染色體后期橋等； 結(jié)構(gòu)變異：分裂過程中染色體的重復(fù)、缺失、易位和倒位等。,易位,2n14,4.外源植物激素在染色體變異中的作用,激素成分對(duì)貝母鱗莖離體培養(yǎng)中染色體變異的影響 激素組合 觀察細(xì)胞數(shù) 變異細(xì)胞數(shù) 變異頻率(%) 變異范圍 2,4-d 55 19 34.5 1242 iaa 63 17 27.4 541 naa 51 12 23.5 738 2.4-d + kt 64 39 60.9 2260 iaa+kt 69 36 52.2 2148 naa+kt 73 23 31.5 1241 2,4-d、iaa、naa各lmg/l 2,4-d + kt,iaa+kt和naa+kt,kt的濃度均為0.1 mg /l， 20天后進(jìn)行檢查。,5.繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞染色體變異的影響,愈傷組織繼代培養(yǎng)的次數(shù)與細(xì)胞染色體變異的頻率呈正相 關(guān)，即細(xì)胞倍性混亂程度增大，異形核細(xì)胞比 例增加。,伊貝母愈傷組織繼代培養(yǎng)對(duì)染色體變異的影響 繼代 培養(yǎng) 觀 察 變異 變異頻率 非整倍體 非整倍體 次數(shù) 天數(shù) 細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞數(shù) (%) 細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞頻率(%) 1 43 82 52 63.4 50 61.0 3 122 112 74 66.1 74 66.1 5 203 77 53 68.8 51 66.2 7 279 85 69 81.2 66 77.6 9 427 71 63 88.7 63 88.7,3-5 離體培養(yǎng)器官發(fā)生的調(diào)控機(jī)制,在合適的培養(yǎng)條件下，離體的組織或細(xì)胞可以脫分化、再分化形成任何我們所需的芽、根、葉、花，并逐步發(fā)育成完整的植株。 植物器官再生的種類受內(nèi)、外兩種因素控制，即外植體的來源和所處生理狀態(tài)與培養(yǎng)時(shí)使用的激素種類和濃度。,一.離體培養(yǎng)過程中的發(fā)育事件,感受（competence）： 某些細(xì)胞對(duì)激素的誘導(dǎo)產(chǎn)生反應(yīng)。 應(yīng)答（commtiment）： 產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞發(fā)生特異的細(xì)胞分裂，向形成器 官原基發(fā)育。 發(fā)育（development）： 發(fā)生特異分裂的細(xì)胞進(jìn)入不定芽再生的發(fā)育路徑。,經(jīng)歷第一、第二個(gè)階段后，一些細(xì)胞己經(jīng)獲得了某種“決定”(determination)，沿著這一決定了的特定路線進(jìn)入確定發(fā)育路徑。 現(xiàn)有的研究主要集中在兩個(gè)方面:一是從解剖學(xué)角度說明其形態(tài)發(fā)生過程；另一個(gè)是尋找參與調(diào)控器官原基發(fā)生和表達(dá)的基因與蛋白。,二.離體培養(yǎng)中芽的起源及參與其發(fā)生的基因,（一）關(guān)于芽的起源： 源于莖尖分生組織（shoot apical meristem, sam）的一部分細(xì)胞并始終保持其自主性的“detached meristem”理論（馬鈴薯）。 源于莖尖分生組織中的某些新細(xì)胞，即“de novol cells”理論（擬南芥）。,（二）調(diào)控腋芽和莖尖分生組織發(fā)育的基因,1.通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)激素的分布和時(shí)間來影響腋芽 和莖尖分生組織發(fā)育的時(shí)間和腋芽形成數(shù)目的基因: axr（auxin-insensitive）, tb1(teosinte branched 1), sps(supershoot)。,2.直接影響（促進(jìn)或抑制）腋芽分生組織及其后的發(fā)生發(fā)育過程的基因 與生長素、細(xì)胞分裂素或獨(dú)角金內(nèi)酯信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的因子: pin、cre1、ahks、max1等； 與細(xì)胞分裂相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶cdks（cyclin dependentkinase）； 與莖尖分生組織發(fā)育相關(guān)基因：knox、wus、moc1、ls、clv1、clv3等；,三.knox基因與莖尖組織發(fā)育,knox（knotted-like homeobox genes）家族是植物中 的4個(gè)同源異型盒基因家族（knox、wox、bell、hd-zip） 之一，幾乎存在于所有的單子葉和雙子葉植物中。 （一）knox基因家族： 1.knox亞家族： 主要在植物分生組織中表達(dá)，是分生組織發(fā)生與維持所必 須的關(guān)鍵基因，調(diào)控與器官發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞分化，最終影響側(cè) 生器官的形態(tài)建成。,2.knox亞家族： 在所有植物組織中均表達(dá)，由于表達(dá)廣泛且缺乏 響應(yīng)的突變體，目前對(duì)其研究較少。,莖尖形態(tài)結(jié)構(gòu)（morphology of shoot apex）,（二）knox基因在莖尖中的時(shí)空表達(dá),1.莖尖分生組織的結(jié)構(gòu),周圍區(qū)的細(xì)胞通常較小,細(xì)胞分裂速度較快,位于sam的側(cè)翼邊緣,發(fā)育過程中分化為葉、側(cè)芽和莖外層組織。肋區(qū)促成莖的伸長。,以擬南芥為例,擬南芥中有4個(gè)knox基因: stm,bp,knat2和 knat6。這些基因共同參與維持莖尖分生組織活力與結(jié)構(gòu)，確 定側(cè)生器官邊界等功能。,擬南芥根離體培養(yǎng)過程中和莖（芽）形成相關(guān)基因的表達(dá)順序,自體調(diào)節(jié)/反饋調(diào)節(jié),出生側(cè)枝,擬南芥胚胎發(fā)育過程中典型基因的表達(dá)模式,ga,stm (knox),ck,arr,wus,胚胎發(fā)育過程中典型基因的表達(dá)模式,3-6 體細(xì)胞胚發(fā)生中基因表達(dá)與調(diào)控,調(diào)控,1、順式作用元件及其鑒出:啟動(dòng)子、增強(qiáng)子 2、反式作用因子,3.體細(xì)胞胚發(fā)生中基因表達(dá)的激素調(diào)節(jié)； iaa、ctk、aba、2，4-d 4.蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達(dá) 5. dna的甲基化對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用,一.體細(xì)胞胚發(fā)生中特定遺傳信息的表達(dá),1.mrna的合成： mrna在細(xì)胞中的含量很低(占總rna的1%5%), 每種特異 mrna的含量則更少。 植物細(xì)胞中mrna合成的知識(shí)主要來自于對(duì)幾種能產(chǎn)生高豐 度mrna的基因的研究。 mrna分子的合成過程大致分為三步：,m7g5ppp5npnp,2.胚性蛋白質(zhì)的形成,在有胚胎發(fā)生的體細(xì)胞培養(yǎng)中均有特異性蛋白表達(dá) 苜蓿體細(xì)胞胚發(fā)生中,在誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天的胚性細(xì)胞中有50kd的特異性蛋白表達(dá)； 在胡蘿卜、水稻、玉米、豌豆等的胚性愈傷組織中存在45 55kd的相關(guān)性蛋白； 在小麥和枸杞體細(xì)胞胚發(fā)生早期分別檢測到49kd和35 kd相關(guān)性蛋白。,二.體細(xì)胞胚發(fā)生中基因表達(dá)常用鑒定方法,1.轉(zhuǎn)錄水平上的鑒定 (1) northern雜交： 通過細(xì)胞總rna或ploy(a) mrna與探針的雜交 來分析基因轉(zhuǎn)錄水平的方法，稱northern 雜交。 程序：植物總rna的提取；探針的制備；印跡 及雜交。,斑點(diǎn)雜交與印跡雜交的區(qū)別：,斑點(diǎn)雜交只需要將rna樣品點(diǎn)在固相膜上直接與 探針雜交。此法只能鑒定基因是否轉(zhuǎn)錄； 印跡雜交則需要先將提取的總rna或mrna樣品進(jìn) 行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到固相膜上，再與探針雜 交。此法可對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行較詳細(xì)的分析， 如rna轉(zhuǎn)錄的大小及豐度等。,（2）mrna差別顯示技術(shù),在生物體發(fā)育的不同階段，或是在不同組織或細(xì)胞 中發(fā)生的不同基因，按時(shí)間、空間進(jìn)行有序的表達(dá)方 式，叫基因的差異表達(dá)（differential expression）。 ddrt-pcr技術(shù)的基本原理: 合成兩組引物,通過隨機(jī)組合,使1500種自由mrna 均有擴(kuò)增機(jī)會(huì),并顯示出清晰的電泳條帶：,ddrt-pcr反應(yīng)的基本程序,a 從一對(duì)不同組織或器官中分離總rna，分別為a、b兩組： b 5-nmaaaaaaaaaaa aa a(a)3n nmttttttttt tt 3 5 反轉(zhuǎn)錄酶 3端錨定引物(5-t11mn-3) 5-nmaaaaaaaaaaa aa a(a)3n nmttttttttt tt 3 5 a b 5端隨機(jī)引物 c nmttttttttt tt 3端錨定引物(5-t11mn-3) pcr 5隨機(jī)引物 放射性標(biāo)記dntps nmttttttttt tt d,cdna,優(yōu)點(diǎn)：,可以同時(shí)比較多個(gè)樣品間基因表達(dá)的差異； 可以同時(shí)檢測到“上游”及“下游”基因； 檢測靈敏度高,所需樣品少,經(jīng)過pcr擴(kuò)增一些 低豐度的mrna也可以被檢測出來； 結(jié)合使用了pcr和序列膠電泳分析兩項(xiàng)技術(shù),使 本法具有高效性。,(3) mrna的體外翻譯,rna的體外翻譯技術(shù)： 從細(xì)胞中提取的自由mrna 或總rna，在無細(xì)胞提取液 的環(huán)境中被翻譯合成蛋白質(zhì) 的技術(shù)。 優(yōu)點(diǎn)：可以探討體內(nèi)翻譯后產(chǎn)生蛋白質(zhì)的修飾、加工過程,以及蛋白質(zhì)活性問題。體外翻譯所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)無進(jìn)一步的修飾加工過程,它所具有的一切特性都是編碼它的基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的修飾、加工所提供的。,從細(xì)胞中提取rna 體外翻譯系統(tǒng) + 除met外的19 種氨基酸+mgac2+kac+35s-met 30溫浴 蛋白質(zhì) 免疫沉淀或sds聚丙烯酰胺 凝膠電泳進(jìn)行分析,2.翻譯水平上的鑒定,(1)蛋白質(zhì)的雙向電泳 雙向電泳是將等電聚焦ief 和 sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合 起來,依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量來分辨蛋白質(zhì)有關(guān)信息的 技術(shù)。 特點(diǎn): ief/sds-page雙向電泳技術(shù)既能提高多肽的分辨率, 又能提供有關(guān)多肽的分子量、氨基酸組成及在某些場合下翻譯 后修飾作用的信息。,利用該技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿體細(xì)胞胚發(fā)生中的特異蛋白質(zhì)50kd蛋白質(zhì)，是等電點(diǎn)不同而分子量相同的三種蛋白質(zhì),在非胚性愈傷組織中缺乏這種蛋白質(zhì)； 在胡蘿卜的體細(xì)胞胚發(fā)生研究中得到了伴隨2,4-d的加入而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。 發(fā)現(xiàn)枸杞胚性愈傷組織中有70kd, 56kd，32kd和一系列較小分子量(2026kd)的特異蛋白質(zhì)表達(dá)。,(2)western雜交,westem雜交是將蛋白質(zhì) 電泳、印跡、免疫測定融為 一體，用來檢測表達(dá)的產(chǎn)物 不具酶活性的特異蛋白質(zhì)表 達(dá)的技術(shù)?？梢詮闹参锛?xì)胞 總蛋白中檢出50 ng的特異 性蛋白質(zhì)，若是提純的蛋白 質(zhì),可檢至15ng，具有很 高的靈敏度。 根據(jù)檢出結(jié)果,可得知被檢植物細(xì)胞內(nèi)目的蛋白表達(dá)與否,濃度高低及大致的分子量。,從植物細(xì)胞中提取總蛋白或目的蛋白 溶解于含去污劑和還原劑的溶液中 經(jīng)sds聚丙烯酸膠凝膠電泳，使蛋白質(zhì) 按分子量大小分離 將分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相 膜上,膜在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育, 以封閉非特異性位點(diǎn) 然后加入特異抗體(一抗),印跡上的目的 蛋白(抗原)與-l抗結(jié)合 加入能與一抗專一結(jié)合的標(biāo)記的二抗 通過二抗上標(biāo)記化合物的性質(zhì)進(jìn)行檢出,(3) ellsa檢測技術(shù)(酶聯(lián)免疫吸附法),elisa是一種利用免疫學(xué)原理檢測抗原、抗體的技術(shù)。其測定的靈敏度極高和具有較強(qiáng)特異性，是研究基因表達(dá)十分有效的方法。 elisa檢測程序分三個(gè)階段:抗體的制備;抗體或抗原的包被；免疫反應(yīng)及檢出。其中酶-抗體偶聯(lián)物的制備是該技術(shù)的基礎(chǔ)。 elisa使用的酶應(yīng)具有特異性強(qiáng)、純度及比活高、室溫下穩(wěn)定、來源方便、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。目前主要使用辣根過氧化物酶(hrp)和堿性磷酸酶(akp)。,三.體細(xì)胞胚發(fā)生中基因表達(dá)的調(diào)控,1.順式作用元件及其鑒出 順式作用元件(cis-acting element)： 是指基因5端上游區(qū)中那些與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的 dna序列，包括一般基因都有的tata box與caatbox 和一些重要的調(diào)控元件。由于這些序列均與基因處于 順式位置，即在同一條dna鏈上,故冠以順式之名。,啟動(dòng)子(promotor)是指rna聚合酶識(shí)別并與之 結(jié)合,從而起始轉(zhuǎn)錄的一段特異性dna序列,包括 tata盒（控制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的準(zhǔn)確性）與cat盒（調(diào)控 轉(zhuǎn)錄的起始頻率）兩部分序列。 增強(qiáng)子(enhancer)是能夠增強(qiáng)與之相連鎖的基 因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控序列。增強(qiáng)子的結(jié)構(gòu)與啟動(dòng)子非 常相似, 其功能是結(jié)合特定的轉(zhuǎn)錄因子或影響dna 構(gòu)象。, 順式作用元件(cis-acting element)的鑒出,構(gòu)建融合基因(從轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開始的5上游區(qū)一定長度的dna片段與報(bào)告基因 編碼區(qū)及3末端區(qū)相連接) 用exo外切核酸酶處理 得到5端各有不同缺失長度的融合基因 轉(zhuǎn)化植物 獲得含有上述不同缺失長度融合基因突變體的植株 用組織化學(xué)方法或其他方法,分析基因的5上游區(qū)缺失到什么部位就不能使 報(bào)告基因表達(dá),或失去正確時(shí)空表達(dá)專一性,或失去對(duì)脅迫因素的應(yīng)答能力。 找到調(diào)控元件存在的區(qū)域 從該區(qū)域的5端作小范圍的缺失突變,或從該區(qū)域中間的不同部位造成缺 失突變 找出調(diào)控元件存在的準(zhǔn)確位點(diǎn) 人工合成此位點(diǎn)內(nèi)的核苷酸序列,或?qū)⒋诵蛄兄械膫€(gè)別核苷酸調(diào)換,或?qū)⑦@段 序列與突變后的序列分別連接在基礎(chǔ)啟動(dòng)子上游 檢測它們是否能調(diào)節(jié)報(bào)告基因的表達(dá),2.反式作用因子(trans-acting factor) 反式作用因子是指那些結(jié)合到順式作用元件上特 異dna序列，并相互作用而實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)效應(yīng)的蛋白質(zhì) 因子，它們可以增強(qiáng)或阻遏基因的表達(dá),或者決定著基 因表達(dá)的組織與發(fā)育階段專一性。,主要的反式作用因子有：,基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子，是與tata盒/啟動(dòng)子結(jié)合的蛋白質(zhì)因子； 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是一些與啟動(dòng)子上游序列結(jié)合的蛋白質(zhì)因子； 誘導(dǎo)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它是與基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)內(nèi)一小段短的dna序列結(jié)合從而完成該基因的誘導(dǎo)表達(dá)過程蛋白質(zhì)因子； 細(xì)胞專一基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，這些因子通常都在某一特定組織中合成或激活并誘發(fā)細(xì)胞專一基因的轉(zhuǎn)錄。,轉(zhuǎn)錄因子的作用方式,研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子通常由dna結(jié)合區(qū)和轉(zhuǎn)錄激活 區(qū)兩個(gè)功能區(qū)組成。,(1) dna結(jié)合區(qū)的類型,螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu) 由兩個(gè)的-螺旋通過-折疊相互 垂直連接構(gòu)成：兩個(gè)的-螺旋 中的一個(gè)通過與磷酸作用，與 dna形成非特異的結(jié)合；另一 個(gè)叫識(shí)別螺旋，與dna上的堿 基序列特異的接觸結(jié)合。,左圖,右圖,鋅指(zinc finger)結(jié)構(gòu),由多個(gè)重復(fù)的結(jié)構(gòu)組成，每個(gè) 分子中結(jié)合有7-11個(gè)鋅原子， 每2個(gè)半胱氨酸（cys）和2個(gè) 組氨酸（his）與一個(gè)zn原子結(jié) 合形成鋅指，一個(gè)完整的分子 可形成多個(gè)“指頭”，這有利于 dna結(jié)合。,由亮氨酸豐富區(qū)組成兩個(gè)-螺旋：每7個(gè)氨基酸就有1個(gè)亮氨酸，螺旋中每兩圈出現(xiàn)一個(gè)亮氨酸；二個(gè)蛋白質(zhì)因子的-螺旋通過亮氨酸的疏水作用形成一個(gè)拉鏈（二聚體）,其作用只是使兩個(gè)蛋質(zhì)分子能形成雙體，從而有助于堿性功能區(qū)與dna 結(jié)合。,亮氨酸拉鏈(leucine zipper)結(jié)構(gòu),(2)激活功能區(qū),轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)一般 由30個(gè)到150個(gè)氨基酸組成，其結(jié) 構(gòu)主要有三種類型：酸性功能區(qū)、 谷氨酰胺豐富功能區(qū)和脯氨酸豐富 功能區(qū)。其作用機(jī)制可能有兩種模 式： 一是激活功能區(qū)直接與rna聚合 酶相互作用，從而提高其活性。 二是激活功能區(qū)與其他轉(zhuǎn)錄因子 （tfd）作用，然后再作用于 rna聚合酶。,3.體細(xì)胞胚發(fā)生中基因表達(dá)的激素調(diào)節(jié),(1) 細(xì)胞分裂素對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控 細(xì)胞分裂素能夠直接調(diào)控細(xì)胞核基因的活性： 例如，從豌豆染色質(zhì)中分離到一種細(xì)胞分裂素受 體蛋白,在rna合成實(shí)驗(yàn)體系中加入這種蛋白質(zhì)及細(xì) 胞分裂素時(shí)可以使rna合成速度增加20%到50% （細(xì)胞分裂素受體蛋白能作為一種反式作用因子識(shí) 別dna中某些基因的順式作用元件）。,細(xì)胞分裂素可調(diào)控蛋白質(zhì)的磷酸化； 細(xì)胞分裂素還可調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯： 例如，一種稱為異戊間二烯腺嘌呤(ipa)細(xì)胞分裂 素存在于trna分子的反密碼子鄰近處。 實(shí)驗(yàn)證 實(shí)，ipa具有是維持密碼和反密碼子之間的相互協(xié)調(diào) 的作用。,(2)生長素對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控,植物生長素能誘導(dǎo)mrna的合成，而且能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)mrna的含量水平： 已克隆出幾個(gè)受植物生長素誘導(dǎo)的mrna的cdna 2,4-d可以誘導(dǎo)苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生中編碼富含脯氨酸的小分子蛋白質(zhì)基因(msprp5)的表達(dá)；用100 mol/l的2,4-d處理愈傷組織20min，其msprps 的mrna量開始增加,處理24-48h， mrna的量達(dá)到峰值。,生長素受體在基因表達(dá)調(diào)控中的作用方式： 激素受體是一類特殊的識(shí)別蛋白, 生長素先與靶 細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中的激素受體結(jié)合,形成“生長素- 受體”復(fù)合物，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，復(fù)合物特異 性、高親和地與dna上特定序列相互作用（激活反 式作用因子），形成新的rna，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控 基因表達(dá)：,(3) aba對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控,aba對(duì)植物的生理及發(fā)育過程都有調(diào)控作用，包括胚胎形態(tài)