生物化學(xué)第24章生物氧化.pptVIP

第24章 生物氧化電子傳遞和氧化磷酸化作用,(Biological oxidation electron transport and oxidative phosphorylation),一、氧化還原電勢 二、電子傳遞和氧化呼吸鏈 三、氧化磷酸化作用,一、氧化還原電勢,1. 電池：電子由負(fù)極流向正極，電流由正極流向負(fù)極，正極發(fā)生還原反應(yīng)，負(fù)極發(fā)生氧化反應(yīng)。 2. 電解：與外加電源的正極相連的是陽極，與外加電源的負(fù)極相連的是陰極，陽極上發(fā)生氧化反應(yīng)，陰極上發(fā)生還原反應(yīng)。 3. 可充電電池：當(dāng)電池放電時(shí)，正極發(fā)生還原反應(yīng)，負(fù)極發(fā)生氧化反應(yīng)；當(dāng)給電池充電時(shí)，正極成為陽極，發(fā)生氧化反應(yīng)，負(fù)極成為陰極，發(fā)生還原反應(yīng)。,電極的名稱與電極上發(fā)生的反應(yīng),原電池的結(jié)構(gòu),檢流計(jì),正極，還原反應(yīng),負(fù)極，氧化反應(yīng),電解裝置,陽極，氧化反應(yīng),陰極，還原反應(yīng),電極電勢和電動(dòng)勢,能斯特方程,兩個(gè)電極組成電池的電動(dòng)勢,F: 法拉弟常數(shù) 96.5 kJ/Vmol,式中E 0 為標(biāo)準(zhǔn)電極電勢，即反應(yīng)物和產(chǎn)物的活度都為1（如果是氣體則為1atm），溫度25下的電極電勢。規(guī)定氫電極的標(biāo)準(zhǔn)電極電勢為0。令標(biāo)準(zhǔn)氫電極為負(fù)極，其它電極為正極，得到電池的電動(dòng)勢，此電動(dòng)勢即為其它電極的標(biāo)準(zhǔn)電極電勢。,反應(yīng)物和產(chǎn)物濃度與電動(dòng)勢的關(guān)系式,對于一個(gè)氧化還原反應(yīng) aAr + bBo cAo + dBr,氧化還原反應(yīng)的判據(jù),對于氧化還原反應(yīng)來說， 反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行， 是反應(yīng)進(jìn)行的限度。 如果已知兩個(gè)氧還電對的標(biāo)準(zhǔn)電極電勢，可以根據(jù)G0=nFE 0計(jì)算出該反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)自由能變化值。,生物體中某些重要的氧化還原電勢,見P117表24-1,呼吸電子傳遞鏈中某些重要的氧化還原電勢,二、電子傳遞和氧化磷酸化,檸檬酸循環(huán)及其它降解代謝途徑產(chǎn)生還原型輔酶，包括NADH和FADH2，將其攜帶的電子經(jīng)過電子傳遞，最終交給分子O2，形成H2O。在電子傳遞過程中釋放出大量的自由能，這些自由能被用來推動(dòng)ATP的合成。在呼吸電子傳遞鏈中，總反應(yīng)式為 NADH + H+ + 1/2 O2 NAD+ +H2O G0= 220.07 kJ/mol FADH2 + 1/2 O2 FAD +H2O G0= 181.58 kJ/mol,線粒體結(jié)構(gòu)圖,檸檬酸循環(huán)在線粒體基質(zhì)中進(jìn)行，電子傳遞和氧化磷酸化在線粒體內(nèi)膜上進(jìn)行。,還原型輔酶中的能量,在糖酵解和檸檬酸循環(huán)中，1分子葡萄糖完全氧化可以生成10個(gè)NADH和2個(gè)FADH2，它們氧化后可以釋放出的自由能為 220.0710 + 181.582 = 2563.86 kJ/mol 1分子葡萄糖完全氧化釋放的自由能為 2870.23 kJ/mol 還原型輔酶中貯存的能量比例為 （2563.86/2870.23）100% = 89.3%,電子傳遞的方向,在電子傳遞鏈中，有一系列電子傳遞體，這些電子傳遞體的排列順序是根據(jù)它們的電極電位決定的。電子由電極電位低的氧還電對中的還原態(tài)電子傳遞體傳向電極電位高的氧還電對中的氧化態(tài)電子傳遞體。,電子傳遞形成跨膜的質(zhì)子梯度,在電子傳遞過程中，還伴隨有H+從線粒體內(nèi)膜的基質(zhì)側(cè)，向內(nèi)膜的外側(cè)運(yùn)輸，結(jié)果造成跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子梯度，這樣在膜內(nèi)外既造成質(zhì)子的濃度梯度，又造成電勢梯度，這種電化學(xué)勢梯度貯存有能量。也就是電子傳遞過程中釋放的能量轉(zhuǎn)變成跨線粒體內(nèi)膜的電化學(xué)勢梯度中貯存的能量。當(dāng)質(zhì)子由膜的外側(cè)向內(nèi)側(cè)運(yùn)動(dòng)時(shí)，推動(dòng)ATP合成。這個(gè)過程稱為氧化磷酸化。,電子傳遞鏈,呼吸電子傳遞鏈主要由蛋白質(zhì)復(fù)合體組成，在線粒體內(nèi)膜上有4種參與電子傳遞的蛋白質(zhì)復(fù)合體，分別為 NADHQ還原酶（NADH-Q reductase） 琥珀酸Q還原酶（succinate-Q reductase） 細(xì)胞色素還原酶（cytochrome reductase） 細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome oxidase）,電子傳遞鏈標(biāo)準(zhǔn)氧還電勢、自由能變化和ATP形成部位示意圖,上半圖,下半圖,Protein Complexes of the Mitochondrial Electron-Transport Chain,電子傳遞鏈各個(gè)成員,1.NADHQ還原酶,NADHQ還原酶又稱為NADH脫氫酶，簡稱為復(fù)合體。該酶含有FMN輔基和Fe-S聚簇，催化反應(yīng)時(shí)，先將NADH的電子傳遞到FMN上，再傳給Fe-S聚簇，最后傳給輔酶Q。Fe-S聚簇有幾種類型，含有Fe-S聚簇的蛋白質(zhì)稱為鐵硫蛋白，又稱為非血紅素鐵蛋白。 Fe-S聚簇通過其中的Fe2+和Fe3+的變化來傳遞電子。,三種類型的Fe-S cluster,Fe Fe2-S2 Fe4-S4,NADH-Q還原酶催化的電子傳遞,每傳遞2個(gè)電子，可驅(qū)動(dòng)4個(gè)H+從膜內(nèi)側(cè)運(yùn)到膜外側(cè)。,Negative,Positive,FP:黃素蛋白 IP:鐵硫蛋白 HP:疏水蛋白,電子傳遞鏈各個(gè)成員,2.輔酶Q,輔酶Q（Coenzyme Q ）又稱泛醌（ubiquinone），有時(shí)簡稱為Q或UQ，是一種脂溶性物質(zhì)，它可以接受1個(gè)電子還原成半醌中間體，再接受1個(gè)電子還原成對苯二酚形式。由于其脂溶性強(qiáng)，可以在線粒體內(nèi)膜中擴(kuò)散。它有一個(gè)長長的碳?xì)鋫?cè)鏈，哺乳動(dòng)物中最常見的是具有10個(gè)異戊二烯單位的側(cè)鏈，簡寫為Q10，在非哺乳動(dòng)物中這個(gè)側(cè)鏈可能只有68個(gè)異戊二烯單位。,輔酶Q的結(jié)構(gòu)和氧化還原態(tài),輔酶Q的space-filling模型,電子傳遞鏈各個(gè)成員,3.琥珀酸Q還原酶,琥珀酸Q還原酶又稱為復(fù)合體，完整的此酶包括檸檬酸循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶，琥珀酸氧化為延胡索酸時(shí)脫下的氫還原了FAD，F(xiàn)ADH2將電子傳遞給琥珀酸Q還原酶的Fe-S聚簇，再傳遞給輔酶Q。,琥珀酸Q還原酶催化的電子傳遞,電子傳遞鏈各個(gè)成員,4.細(xì)胞色素還原酶,細(xì)胞色素還原酶又稱復(fù)合體、輔酶Q細(xì)胞色素c還原酶。它的作用是將還原型輔酶Q的電子傳遞給細(xì)胞色素c。細(xì)胞色素還原酶中含有細(xì)胞色素b，也含有2Fe-2S聚簇。,細(xì)胞色素（cytochrome),細(xì)胞色素是一類含有血紅素輔基的電子傳遞蛋白質(zhì)的總稱。還原型細(xì)胞色素具有明顯的可見光吸收，可以看到、和三個(gè)吸收峰，其中峰的波長隨細(xì)胞色素種類的不同而各有特異的變化，可用來區(qū)分不同的細(xì)胞色素。氧化型細(xì)胞色素在可見光區(qū)看不到吸收峰。細(xì)胞色素中的血紅素有三種，分別稱為細(xì)胞色素a、b和c，同一種細(xì)胞色素血紅素因結(jié)合的蛋白質(zhì)不同，其吸收峰的波長會(huì)發(fā)生小的變化，如細(xì)胞色素還原酶中含有的細(xì)胞色素b就分為bH（b562）和bL（b566）兩種。,血紅素的結(jié)構(gòu),細(xì)胞色素c的光吸收峰,還原態(tài) 氧化態(tài),幾種細(xì)胞色素的最大吸收峰,細(xì)胞色素還原酶催化的電子傳遞,前半個(gè)Q循環(huán)，運(yùn)出去2個(gè)質(zhì)子。,細(xì)胞色素還原酶催化的電子傳遞,后半個(gè)Q循環(huán)，運(yùn)出去2個(gè)質(zhì)子。,電子傳遞鏈各個(gè)成員,細(xì)胞色素 c 是一個(gè)分子量13000的單鏈球形蛋白質(zhì)，直徑3.4nm，由104個(gè)氨基酸殘基組成，含有一個(gè)血紅素輔基。它是唯一能溶于水的細(xì)胞色素，并且是了解最為透徹的蛋白質(zhì)之一。,5.細(xì)胞色素c,細(xì)胞色素c 的三維結(jié)構(gòu),第三個(gè)硫原子來自Met，配位到Fe上。,電子傳遞鏈各個(gè)成員,細(xì)胞色素氧化酶又稱為復(fù)合體、細(xì)胞色素 c 氧化酶。它的作用是將還原型細(xì)胞色素 c 的電子傳遞給分子O2，生成H2O。,6.細(xì)胞色素氧化酶,細(xì)胞色素氧化酶的傳遞電子作用,每傳遞2個(gè)電子可以運(yùn)出2個(gè)質(zhì)子。,氧與a3及Cub結(jié)合的關(guān)系示意圖,Binuclear center,Cys,電子傳遞給氧生成水,Power stroke phase,Electron-filling phase,電子傳遞的抑制效應(yīng),電子傳遞鏈中的抑制劑,三、氧化磷酸化作用,伴隨著線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞，ADP與Pi合成ATP的過程稱為氧化磷酸化作用（oxidative phosphorylation）。相應(yīng)地，我們將在代謝途徑中由含磷酸的底物直接把磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)到ADP上形成ATP的過程，稱為底物水平磷酸化。,P/O比,用組織勻漿以及組織切片做的實(shí)驗(yàn)表明，組織利用O2的同時(shí)，ATP含量隨之增加，每消耗1個(gè)O原子約合成3個(gè)ATP分子。這個(gè)比例稱為P/O比。P/O比又可以看作是一對電子通過呼吸電子傳遞鏈傳至O2所產(chǎn)生的ATP分子數(shù)。根據(jù)P/O比為3，人們認(rèn)為在電子傳遞鏈中，ATP是在3個(gè)不連續(xù)的部位生成的，根據(jù)電子傳遞鏈中各環(huán)節(jié)釋放的能量，也確實(shí)有3個(gè)部位釋放的能量大于合成ATP所需的能量。FADH2進(jìn)入電子傳遞鏈后的P/O比為2，說明它繞過了1個(gè)生成ATP的部位?，F(xiàn)在認(rèn)為氧化1個(gè)NADH可以產(chǎn)生2.5個(gè)ATP，氧化1個(gè)FADH2可以產(chǎn)生1.5個(gè)ATP。,ATP的合成部位,線粒體內(nèi)膜上有許多球形突起，稱為內(nèi)膜球體（inner membrane sphere）。這些球體通過一個(gè)柄連接到內(nèi)膜中的基座上，我們把球體和柄合稱為F1，基座稱為Fo，F(xiàn)1和Fo合稱復(fù)合體。在離體條件下，這種復(fù)合體有水解ATP的活性，所以開始稱它為ATP酶，后來發(fā)現(xiàn)在完整的線粒體中它的功能是合成ATP，現(xiàn)在稱它為ATP合酶。,亞線粒體的電鏡照片,ATP合酶簡圖,ATP合酶重組實(shí)驗(yàn),能量偶聯(lián)假說,（1）化學(xué)偶聯(lián)假說,化學(xué)偶聯(lián)假說是1953年Edward Slater最先提出來的。他認(rèn)為電子傳遞過程中產(chǎn)生一種活潑的高能共價(jià)中間物，它隨后的裂解驅(qū)動(dòng)合成ATP，就像底物水平磷酸化那樣。但是在氧化磷酸化中一直沒有找到任何一種活潑的高能中間產(chǎn)物。,能量偶聯(lián)假說,（2）構(gòu)象偶聯(lián)假說,這一假說是1964年P(guān)aul Boyer最先提出來的。他認(rèn)為電子沿電子傳遞鏈傳遞使線粒體內(nèi)膜蛋白質(zhì)發(fā)生了構(gòu)象變化，形成一種高能態(tài)。通過合成ATP使蛋白質(zhì)恢復(fù)到原來的構(gòu)象。這一假說至今也未能找到有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。但是在ATP的合成過程中仍可能包含有不同形式的構(gòu)象偶聯(lián)現(xiàn)象。,能量偶聯(lián)假說,（3）化學(xué)滲透假說,這一假說是1961年由英國生物化學(xué)家Peter Mitchell最先提出的。他認(rèn)為電子傳遞釋放出的自由能及ATP合成是與一種跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子梯度相偶聯(lián)的。也就是說，電子傳遞釋放的自由能驅(qū)動(dòng)H+從線粒體基質(zhì)跨過內(nèi)膜進(jìn)入到膜間隙，從而形成跨線粒體內(nèi)膜的H+電化學(xué)梯度。這個(gè)梯度的電化學(xué)勢驅(qū)動(dòng)ATP合成。,化學(xué)滲透假說的原理圖,合,化學(xué)滲透假說的實(shí)驗(yàn)證據(jù), 氧化磷酸化作用需要封閉的線粒體內(nèi)膜存在。 線粒體內(nèi)膜對H+、OH、K+、Cl等離子都是不通透的。 破壞H+濃度梯度的形成都必將破壞氧化磷酸化作用。 線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞能夠?qū)+從基質(zhì)運(yùn)輸?shù)侥らg隙。 人造的脂質(zhì)小泡上重組細(xì)菌紫膜質(zhì)和F1Fo ATP合酶后，在照光時(shí)有ATP的合成。,質(zhì)子梯度驅(qū)動(dòng)合成ATP的實(shí)驗(yàn)證明,細(xì)菌紫膜質(zhì),脂質(zhì)小泡,線粒體F1Fo ATP合酶,The Nobel Prize in Chemistry 1978,“for his contribution to the understanding of biological energy transfer through the formulation of the chemiosmotic theory“,Peter D. Mitchell,Glynn Research Laboratories Bodmin, United Kingdom b. 1920 d. 1992,質(zhì)子泵出是需能過程,質(zhì)子逆電化學(xué)梯度跨過線粒體內(nèi)膜的自由能變化可以用下式表示 G = 2.3RT pH(膜內(nèi))pH(膜外)ZF 式中，是膜電勢，即膜內(nèi)外的電勢差。 = (膜外)(膜內(nèi)),質(zhì)子轉(zhuǎn)移的兩種假設(shè)機(jī)制,（1）氧化還原回路機(jī)制,該機(jī)制由Mitchell提出。他認(rèn)為電子傳遞鏈中有一些電子傳遞體既可以傳遞電子，也可以結(jié)合H+，當(dāng)它們被還原時(shí)，在膜內(nèi)側(cè)結(jié)合H+，而被氧化時(shí)，在膜外側(cè)釋放H+，這樣就把H+從膜內(nèi)運(yùn)到了膜外。,氧還回路機(jī)制示意圖,質(zhì)子轉(zhuǎn)移的兩種假設(shè)機(jī)制,（2）質(zhì)子泵機(jī)制,這個(gè)機(jī)制的內(nèi)容是，電子傳遞導(dǎo)致復(fù)合體構(gòu)象的變化，氨基酸殘基在膜內(nèi)側(cè)結(jié)合H+，構(gòu)象變化后在膜外側(cè)釋放H+，從而把H+從膜內(nèi)側(cè)運(yùn)到膜外。,合成ATP與跨膜質(zhì)子的數(shù)量關(guān)系,在生理?xiàng)l件下合成1個(gè)ATP所需的自由能大約為4050kJ/mol。至少需要兩個(gè)質(zhì)子跨膜回流釋放的能量才夠合成1個(gè)ATP。因?yàn)檗D(zhuǎn)移出膜外的質(zhì)子有一部分漏回膜內(nèi)，測定的結(jié)果表明，每合成1個(gè)ATP需要泵出23個(gè)質(zhì)子。,電子傳遞與質(zhì)子泵出相偶聯(lián),Go = -69.5kJ/mol,Go = -36.7kJ/mol,Go = -112kJ/mol,線粒體跨內(nèi)膜的質(zhì)子梯度,F1和Fo的亞基組成,F1由5種肽鏈組成，33。Fo由3種疏水亞基組成，a 1b 2 c 9-12。Fo形成跨膜的管道，質(zhì)子通過此管道流回到膜內(nèi)側(cè)時(shí)驅(qū)動(dòng)ATP合成。F1的、和亞基分別由510、482、272、146和50個(gè)氨基酸殘基組成，F(xiàn)1的總分子量為371kD。、亞基是同源的，每一個(gè)亞基有1個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)，催化位點(diǎn)在亞基上，亞基上ATP結(jié)合位點(diǎn)的功能還不清楚，因?yàn)槿笔н@個(gè)位點(diǎn)并不影響F1的活性。,ATP合成與蛋白質(zhì)構(gòu)象變化,John Walker及其同事測定了F1的結(jié)構(gòu)，F(xiàn)1ATP合酶是一個(gè)不對稱的結(jié)構(gòu)，3個(gè)亞基有3種不同的構(gòu)象。Walker研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)亞基ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合有AMP-PNP（一種不能被水解的ATP類似物），另一個(gè)結(jié)合有ADP，第三個(gè)位點(diǎn)是空的。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與Paul Boyer提出的關(guān)于ATP合成的結(jié)合變化機(jī)制（binding change mechanism）相符，結(jié)合變化機(jī)制認(rèn)為，3個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)協(xié)調(diào)地依次通過ATP合成的3種中間狀態(tài)進(jìn)行循環(huán)。,ATP的結(jié)構(gòu)類似物AMP-PNP,App(NH)p(,-imidoadenosine 5-triphosphate),Nonhydrolyzable -bond,33的不對稱結(jié)構(gòu),側(cè)面觀 頂面觀,ATP合酶的結(jié)構(gòu)和工作原理,從FO往F1方向觀,分子馬達(dá),Fo的c亞基排列成環(huán)，c亞基的構(gòu)象是一對反平行的跨膜螺旋，在內(nèi)膜外側(cè)由一個(gè)短的發(fā)卡環(huán)連接。c亞基環(huán)形成一個(gè)轉(zhuǎn)子（rotor），相對于a亞基旋轉(zhuǎn)，a亞基作為定子（stater），a亞基由5個(gè)跨膜的螺旋組成，在膜的每一側(cè)有質(zhì)子流動(dòng)的通道（proton access channels）。亞基將F1和Fo連接起來，在ATP合成時(shí)亞基也相對于()3復(fù)合體旋轉(zhuǎn)。亞基固著在c亞基轉(zhuǎn)子上，它們可以一起轉(zhuǎn)動(dòng)。b亞基有1個(gè)跨膜片段和1個(gè)長的親水頭部，完整的定子由b亞基固著在a亞基的一端，并通過亞基與()3結(jié)合在一起。,分子馬達(dá),Fluorescencetly labeled,The worlds smallest molecular motor: rotational catalysis.,(K. Kinosita, 1997),Avidin： 抗生物素蛋白,分子馬達(dá),Rotation of thesubunit and the ring of c subunits in the FoF1 complex as directly observed by in vitro studies using fluorescence microscopy: they rotate in 120-degree increments, with each step consume one ATP; operation efficiency near 100%.,質(zhì)子從膜外側(cè)返回內(nèi)側(cè)的通道,c 轉(zhuǎn)子每一個(gè)亞基上有一個(gè)重要的殘基Asp61，將這個(gè)Asp突變成Asn將失去ATP合酶活性。c轉(zhuǎn)子相對于定子的旋轉(zhuǎn)可能依賴于Asp61上負(fù)電荷的中和。質(zhì)子從a亞基的胞質(zhì)溶膠側(cè)的通道進(jìn)入，質(zhì)子化Asp61，推動(dòng)轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)，直到到達(dá)a亞基的基質(zhì)側(cè)質(zhì)子通道，Asp61上的質(zhì)子再解離通過此通道進(jìn)入膜內(nèi)側(cè)。這樣的旋轉(zhuǎn)能夠引起亞基相對于()3復(fù)合體旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致3個(gè)亞基依次發(fā)生構(gòu)象變化。,Model of the E. coli ATP synthase: the proton gradient drives the rotation of the c ring using two half-channels on the a subunit.,ATP合酶的亞基構(gòu)象循環(huán)變化與ATP合成,ADP+Pi,ADP+Pi,Energy,The Nobel Prize in Chemistry 1997,“for their elucidation of the enzymatic mechanism underlying the synthesis of adenosine triphosphate (ATP)“,Paul D. Boyer,USA University of California Los Angeles, CA, USA,United Kingdom MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom,John E. Walker,F1Fo ATP合酶的抑制劑,在ATP合酶的柄部有一種寡霉素敏感性授予蛋白（oligomycin-sensitivity-conferring protein，OSCP），這種蛋白使復(fù)合體對寡霉素敏感，使得寡霉素抑制ATP的合成。Fo的名稱即來自于此。 二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodi-imide，DCCD）能夠修飾Fo蛋白中某亞基的Glu殘基，導(dǎo)致抑制質(zhì)子通過Fo，這種能被DCCD