酶聯(lián)免疫吸附測定法ELISA在.ppt

酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA)在 抗生素殘留檢測中的應用,藥物殘留快速檢測試劑盒 實驗操作指導,1、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）簡介,1.1、基本概念：抗原、抗體、抗原抗體的特性 1.2、ELISA方法簡介： 1.3、ELISA方法的原理 1.4、ELISA方法的分類,2、ELISA試劑的組成,2.1、 ELISA試劑盒的組成 2.1.1、已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標板）； 2.1.2、酶標記的抗原或抗體（酶標記物）； 2.1.3、酶的底物； 2.1.4、參考標準品（定量測定）； 2.1.5、酶標記物及樣本的稀釋液； 2.1.6、洗滌液； 2.1.7、酶反應終止液。,2.2、各ELISA組成試劑的作用,2.2.1、固相載體 2.2.2、免疫吸附劑 2.2.3、酶標記物 2.2.4、酶的底物 2.2.5、洗滌液 2.2.6、反應終止液 2.2.7、參考標準品,3、ELISA實驗過程,3.1 、試劑的準備 3.2 、加樣 3.3 、保溫 3.4、 洗滌 3.5 、顯色和比色,4、ELISA試驗的質量控制,4.1、分析前質控 4.1.1、人員培訓 4.1.2、儀器質控 4.1.3、標本采集及處理過程的質控 4.2、分析中質控,4.3、幾種常用的質控方法,4.3.1、灰區(qū)概念 4.3.2、外添加回收率試驗方法 4.3.3、確證陽性樣品質控 4.3.4、室間質評的方法 ：發(fā)質控物進行調查,5、膠體金試紙 5.1、免疫層析法簡介及特點 5.2、免疫層析法的結構及原理 二、培訓內容（操作部分） 6、操作過程演示 7、計算軟件應用說明,1、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）簡介 1.1、基本概念： 抗原：抗原是指進入人或動物機體后，可刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，從而引起動物產生抗體或形成致敏淋巴細胞，并能和抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應的物質。 抗體：是由抗原刺激動物的免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)產生分泌的能和相應抗原發(fā)生特異性結合的免疫球蛋白。 抗原抗體的基本特性：a、反應的特異性；b、反應的等比例性 1.2、ELISA方法簡介： ELISA屬于標記免疫學技術的一種，1971年由荷蘭和瑞典的學者提出，由于其操作過程簡單易行并可以定量，從而使其在食品安全和衛(wèi)生檢測中得到了廣泛的應用。目前市場上有多種基于ELISA方法開發(fā)的用于食品中抗生素檢測的試劑盒產品。 返回,1.3、ELISA方法的原理 基于抗原抗體反應的特異性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑料微孔板（又稱酶標板）為載體，在適當的技術條件下使抗原或抗體包被（吸附）在酶標板微孔的內壁上成為所謂的包被（固相）抗體或抗原，沒有被吸附（游離）的抗原或抗體通過洗滌除去，然后直接加入酶標記抗體或抗原（或先加入適當的抗體或抗原與包被抗原或抗體反應后，再加入相應的酶標記抗體或抗原），形成酶標記的抗原抗體復合物固定在微孔內，沒有吸附的酶標記物洗滌去除，加入底物溶液于微孔中，復合物上的酶催化底物使其水解、氧化或還原成為有色的底物。在一定的條件下，復合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗體復合物的量）和酶產物呈現(xiàn)的色澤成正比，因此可以用分光光度計進行測定，從而計算出參與反應的抗原和抗體的量。這就是ELISA的原理。 返回,1.4、ELISA方法的分類 ELISA可以分為直接法、間接法和夾心法等幾種。 直接法： 直接法是指酶標抗原或抗體直接與包被在酶標板上的抗體或抗原結合形成酶標抗原抗體復合物，加入酶反應底物，測定產物的吸光值，計算出包被在酶標上的抗體或抗原的量。見圖2-17（a） 間接法： 是將酶標記在二抗上，當抗體（一抗）和包被在酶標板的抗原結合形成復合后，再以酶標二抗和復合物結合，通過測定酶反應產物的顏色可以（間接）反應一抗和抗原的結合情況，進而計算出抗原或抗體的量。見圖2-17（b） 夾心法： 是先將未標記的抗體包被在酶標板上，用于捕獲抗原，在用酶標的抗體與抗原反應形成抗體-抗原-酶標抗體復合物；也可以象間接法一樣應用酶標二抗和抗體-抗原-抗體復合物結合，形成抗體-抗原-抗體-酶標二抗復合物，見圖2-17（C）。前者稱為直接夾心法，后者稱為間接夾心法。 返回,ELISA原理及分類（圖2-17）,上述三種方法又可以分為競爭法和非競爭法。由于我公司的試劑盒產品絕大部分屬于直接法中的競爭法。下面對直接法中的酶標抗原競爭法作重點說明。 在進行測定時首先將包被了抗體的酶標板的微孔分為測定孔和對照孔，在對照孔中加入系列標準品溶液和酶標記物；在測定孔中同時加入酶標記物和非酶標抗原（通常來自于待測樣品），酶標記物和樣品互相競爭包被抗體的結合點，經過溫浴后，沒有結合到包被抗體上的酶標記物和樣品經過洗滌去除。拍干后加入底物溶液，經溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值。其反應原理如（圖2-18） 返回,競爭法ELISA原理（圖2-18）,如圖所示.在進行測定時首先將包被了抗體的酶標板的微孔分為測定孔和對照孔，在對照孔中加入已知濃度的系列標準品溶液和酶標記物；在測定孔中同時加入酶標記物和待檢樣本（抗原），酶標記物和樣品互相競爭包被抗體的結合點，形成酶標記的抗原抗體復合物固定在微孔內，沒有吸附的酶標記物通過洗滌去除，加入底物溶液于微孔中，復合物上的酶催化底物使其水解、氧化還原成為有色的產物。當測定孔內的樣本不含抗原時，固相上的抗體將和酶標記物結合加入底物后呈色較深，當樣本含有抗原時，樣本中的抗原和酶標記物共同競爭抗體的結合位點，酶標抗原的比例越高，結合在固相抗體上的酶標抗原就越多，酶標抗原的比例越低，結合在固相上的抗體就越少，而在一定的條件下，復合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗體復合物的量）和酶產物呈現(xiàn)的色澤成正比，因此可以用分光光度計進行測定，從而計算出參與反應的抗原和抗體的量，從而進一步得知樣本中抗原的多少。這就是競爭法ELISA的原理。,測定孔,酶標記物,底物溶液,對照孔,酶標記物,底物溶液,參考液(不含抗原),樣本(含抗原),競爭法ELISA原理簡述,如圖所示.在進行測定時首先將包被了抗體的酶標板的微孔分為測定孔和對照孔，在對照孔中加入已知濃度的系列標準品溶液和酶標記物；在測定孔中同時加入酶標記物和待檢樣本（抗原），酶標記物和樣品互相競爭包被抗體的結合點，形成酶標記的抗原抗體復合物固定在微孔內，沒有吸附的酶標記物通過洗滌去除，加入底物溶液于微孔中，復合物上的酶催化底物使其水解、氧化還原成為有色的產物。當測定孔內的樣本不含抗原時，固相上的抗體將和酶標記物結合加入底物后呈色較深，當樣本含有抗原時，樣本中的抗原和酶標記物共同競爭抗體的結合位點，酶標抗原的比例越高，結合在固相抗體上的酶標抗原就越多，酶標抗原的比例越低，結合在固相上的抗體就越少，而在一定的條件下，復合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗體復合物的量）和酶產物呈現(xiàn)的色澤成正比，因此可以用分光光度計進行測定，從而計算出參與反應的抗原和抗體的量，從而進一步得知樣本中抗原的多少。這就是競爭法ELISA的原理。,樣本濃度的計算,所獲得的每個濃度標準溶液或樣本吸光度值的平均值（B ）除以第一個標準（O 標準）的吸光度值（B 。）再乘以100 % ，即百分吸光度值。 百分吸光度值（% ) = ( B / BO ) / 100 % 公式中B 為樣本溶液的平均吸光度值，B0為0PPb標準溶液的平均吸光度值。以克倫特羅濃度的半對數值為x 軸，百分吸光度值為Y 軸，繪制標準曲線圖，（標準曲線如圖一）相對應每一個樣品中殘留的克倫特羅的濃度可以從標準曲線上讀出，在實際的計算中只需用酶標測出標準品和樣品的吸光值，其他過程可通過專用的計算軟件完成。 返回,2、ELISA試劑的組成,2.1、完整的ELISA試劑盒應包含以下各組分： （1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標板）； （2）酶標記的抗原或抗體（酶標記物）； （3）酶的底物； （4）系列參考標準品（定量測定）； （5）酶標記物及樣本的稀釋液； （6）洗滌液； （7）反應終止液。 返回,2.2、ELISA試劑的作用,2.2.1、固相載體： 固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應。可作ELISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產品稱為ELISA板，國際上標準的微量滴定板為812的96孔式。 2.2、免疫吸附劑： 已包被抗原或抗體的固相載體，是ELISA方法中的核心試劑。 返回,2.3、酶標記物： 即酶標記的抗原或抗體，是ELISA中最關鍵的試劑。良好的酶標記物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。酶標記物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當的分子比例，在酶標記物中應盡量不含有或少含有游離的（未結合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外酶標記物還要有良好的穩(wěn)定性。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 返回,2.4、酶的底物 2.4.1、HRP的底物 HRP催化過氧化物的氧化反應，最具代表性的過氧化物為H2O2，其反應式如下： DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB) OPD氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度 高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質，與過氧化氫混合成底 物應用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應用液。,TMB經HRP作用后產物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。 2.4.2 AP的底物 AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。 AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。 返回,2.5、洗滌液 洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。 返回,2.6酶反應終止液 常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式 ELISA中一般采用2mol/L。 2.7 參考標準品 定量測定的ELISA試劑盒應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。 返回,3、ELISA實驗過程 3.1 試劑的準備 按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA實驗中應用蒸餾水或去離子水，。自配的緩沖液的PH應用pH計進行較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。 返回,3.2 加樣 在ELISA實驗中一般有5次加樣步聚，即加標準品、加樣本、加酶標記物、加底物、加反應終止液。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。 加樣時一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發(fā) 生交叉污染。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。 返回,3.3 保溫 在ELISA中一般加標本和加酶標記物后會有一次抗原抗體反應?？乖贵w反應的完 成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)。 ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。 溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。為了便于操作目前絕大部分的試劑盒均采用室溫進行溫育反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25，但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。,3.4 洗滌 洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物 質洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。 洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作主要為浸泡式，過程如下： a.吸干或甩干孔內反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內液體。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。,3.5 顯色和比色 3.5.1、 顯色 顯色是ELISA中的最后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應 的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確。 底物顯色一般在室外溫或37反應20-30分鐘后即不再加深，約40分鐘將達到顯色的頂峰，再延長反應時間，可使本底值增高。底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。產物用各類酸性終止液終止后會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。,3.5.2 比色 比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比 色架中。 比色結果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下 角，如TMB的吸收波長為450nm，表示方法為“A450nm“或“OD450nm“。,3.6.3 酶標比色儀 酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀ELISA結果吸光度的光度計。針對固相載 體形式的不同，有特制的適用于板、珠和小試管的設計。許多試劑公司配套供應酶標儀。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數一般可精確到0.001，準確性為1%，重復性達0.5%。舉例說，若某孔測得的A值為1.083，則該孔相對于空氣的真實A值應為1.0830.01（1.0731.093），重復測定數次，其A值均應1.0830.05（1.0781.088）在之間。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。酶標儀的檢測范圍一般在0.0003.000之間，甚至更高。超出可測上限的A值常以“*“或“over“或其它符號表示。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在1530，使用前先預熱儀器15-30分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。,測讀A值時，要選用產物的敏感吸收峰，用單波長進行測讀。也可用雙波長進行測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的位置。例如TMB用450nm為W1，625nm為W2，最終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。 各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀使用說明書。 返回,4.ELISA試驗的質量控制 4.1、分析前質控,4.1.1、人員培訓 實驗人員操作的技巧及熟練程度直接影響到檢驗結果，因此檢驗人員需經過培訓，熟練掌握相關的技術知識和操作要點： 檢驗項目的基本原理 （ELISA原理）； 熟悉檢測技巧，了解實驗的關鍵環(huán)節(jié)及操作要點； 熟悉檢測試劑性能（包括試劑盒組成，包被片段及其組成）；,4.1.2、儀器質控 為使儀器保持最佳工作狀態(tài)應建立維護和校正儀器的標準操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱），洗板機和酶標儀。 移液器：ELISA加樣量?。?-100l），其準確性直接影響實驗結果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應在2%以內； 水浴箱：經常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內）實測溫度是否一致，允許有1的誤差； 洗板機：每個廠家設置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul ，人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞； 酶標儀：經常維護其光學部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。,4.1.3、標本采集及處理過程的質控 取樣：保證取樣有代表性，即要遵循一定的取樣方法又要保證一定的取樣比例（如：隨機多點取樣、四分法等） 樣品選取過程中需要避免產生交叉污染。如：處理不同批次的樣品時應更換使用的工器具或對使用的工具進行徹底的清洗。,4.2、分析中質控 ELISA實驗的結果受操作影響很大，每個步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標儀讀數均應認真負責才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強特異的優(yōu)點。 因此,應建立實驗項目的標準操作程序(SOP)。 加樣 加樣應用微量移液器（加樣槍)按規(guī)定的量加入微孔板的底部避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。加樣槍的槍頭不要觸及微孔的內壁。 每次加樣應更換吸嘴，做到一樣一吸頭，以免發(fā)生交叉污染。 溫育 大多數的試劑盒抗原抗體反應需要在室溫度下，經過一定的時間才能達到反應的平衡點 ELISA邊緣效應是由溫育形成的。所以溫育一般采用能 使反應液溫度迅速達到平衡的水浴法。一種放在水浴箱的隔板上，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置。,洗滌 ELISA是靠洗滌來達到分離結合與未結合抗原抗體復合物及酶標記物的目的，同時洗滌也可將非特異吸附的蛋白質的干擾以及血球、細菌中的酶干擾清除掉。 手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內反應液； 2）用洗滌液過洗一遍（即注滿孔后即甩去）； 3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動； 4）甩去孔內液體，拍板，用紙吸干。 重復以上操作至少5次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。 洗板機洗板一定要預先把板架放平，使洗板機上的每個放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內液體全部吸干，同時要設置一定的浸泡時間。如出現(xiàn)機洗后拍板有較多殘留液時應再用手工洗2次以上。關機前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。,顯色 HRP催化底物是一步呈色反應，同樣需要一定的時間和溫度，一定要按照說明書規(guī)定的時間溫度（一般為室溫C，15-20分鐘）。達到規(guī)定的反應時間后需要立即終止。 酶標儀判讀結果 顯色反應終止后應立刻比色（一般在30分鐘內有效）。 常見的顯色系統(tǒng)有OPD和TMB二種，以后者最為常見，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結果。 TMB終止后顯黃色，測定波長為450nm， 參比波長為630nm。 使用雙波長的優(yōu)點可以消除反應板條上的劃痕手印的干擾。同時要注意反應孔底部應用紙吸干后才能置酶標儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負值或損壞濾光片。 返回,4.3、幾種常用的質控方法,4.3.1、灰區(qū)概念 把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO值上下的一段區(qū)域定為陽性可疑，需重復實驗或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區(qū)范圍內則報告+（陽性）。 灰區(qū)的設置方法為：C.O（1CV） CV為該試劑的批內CV (一般為510%）；,4.3.2、外添加回收率試驗方法 A、什么是外添加回收率 外添加回收率是指向陰性樣中加入一定濃度的標準溶液，使之達到某一確定濃度（稱為加標樣），然后將其與該陰性樣同時測定，進行對照試驗，以觀察加入的標準品的量能否定量回收，以回收率表示。 B、如何添加標準品 原則上我們建議使用較高濃度的標準溶液進行外添加，下面以我公司的試劑盒為例進行說明：假設使用4.05ppb標準品進行添加，一般魚肉的檢測下限為0.1ppb，建議將魚肉添加到0.1ppb作為回收樣品進行檢測。所以假設需要添加X ml 4.05ppb的標準品于1克魚肉中，得到0.1ppb的魚肉樣本。按公式(1)計算X值 （1+X）0.1=4.05X (1) 則X即為所添加的4.05PPb標準溶液的體積。,C、如何計算回收率 添加前的陰性魚肉設為樣品A，添加后的魚肉設為樣品B，將A和B同時進行檢測，其檢測結果分別為CA、CB，按公式(2)進行計算回收率 回收率=（CB CA）/0.1100% (2) D、外添加回收率的意義。 外添加回收率的意義在于，通過外添加一定已知濃度的標準品，從而驗證試驗方法的穩(wěn)定性和有效性。,4.3.3、用確證樣品質控 選取與被測樣本性質接近的經過確證的樣本為質控樣本，在每次進行檢測時將該樣本同時進行檢測，通過判斷該樣品檢出值與確證值之間的變異度來判斷檢驗結果的有效性。 4.3.4、室間質評的方法 ：發(fā)質控物進行調查 這是國內外室間質評的常用形式。有關管理部門或相關的行業(yè)檢驗協(xié)會采用定期發(fā)放質控物至各實驗室，各實驗室在規(guī)定的日期進行檢驗，并將檢驗結果報至部管理中心。由管理中心進行統(tǒng)計分析，將評價結果寄回各實驗室。通過評價，各實驗室了解本室工作質量，發(fā)現(xiàn)差距，并設法改進，以不斷提高檢驗質量。 返回,5、膠體金