【動物醫(yī)學專業(yè)畢業(yè)論文】豬組織中新霉素殘留的微生物檢測方法探究.doc

畢業(yè)設計(論文) 題 目 名 稱： 豬組織中新霉素殘留的微生物檢測方法探究 題 目 類 別： 畢業(yè)論文 學 院 （系）： 專 業(yè) 班 級： 學 生 姓 名： 指 導 教 師： 日 期： 至 目錄任務書開題報告指導老師審查意見評閱老師記錄答辯會議記錄中文摘要英文摘要1 前言11.1 抗生素殘留的危害11.2 新霉素的應用2 1.3 新霉素在動物機體中的殘留21.4 新霉素的化學結構與理化性質31.5 新霉素等首要殘留的原因41.6 新霉素在動物性組織中的殘留的檢測方法51.7 研究的目的62 材料與方法62.1 材料72.2 方法83 結果114 討論與分析164.1 標準曲線164.2 回收率試驗164.3 菌懸液174.4 蛋白質變性方法的選擇175 小結18參考文獻19致謝21外文參考資料原文 viii外文參考資料譯文 ix豬組織中新霉素殘留的微生物學檢測方法的研究學 生： 鄧 艷 長江大學動物科學學院指導老師： 趙紅梅 長江大學動物科學學院摘要 目的 新霉素是由鏈霉菌屬弗氏鏈霉菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，目前，它作為一種常用獸藥和具有發(fā)展前途的飼料添加劑在畜牧業(yè)中廣為使用。為了控制新霉素在動物性食品中的殘留，保障食品衛(wèi)生和公共健康，本次試驗對豬肌肉和腎臟組織中新霉素殘留的微生物學檢測方法做了研究。方法 本試驗用測試菌為表皮葡萄球菌的微生物學瓊脂擴散法，測定豬肌肉組織和腎臟組織提取液中的新霉素的含量。結論 本方法靈敏度和回收率高，本方法的靈敏度為0.150.2ug/ml,檢測限為0.50.75ug/g組織，回收率為，回收率比fda的傳統(tǒng)方法有顯著的提高，標準曲線在0152.4ug/ml范圍具有良好的線性范圍。且其操作簡便，不需要特殊設備，樣品用量少，易于推廣，適用于新霉素的定量分析.關鍵詞 新霉素 ; 殘留檢驗 ; 微生物學 ;瓊脂擴散法 determination of neomycin residues in pig tissues by microbiolmgical methodstudent: deng yan animal science department tutor:zhao hongmei animal science departmentabstract neomycin is classified as a broad-spectrum antibiotic that is used for preventing diseases and increasing the efficiency of feed utilization in veterinary medicine.in order to control neomycin residues in food derived from animals and ensure public health,we have studied on determination of neomycin in pig tissues (muscle and kindey).we take staphylococcus epidermidis as the test microorganism.the sentitivety of the method was 0.15-0.2ug/ml,the limits of detecationfor neomycin in tissue were0.5-0.72ug/g, and the calibration curve was liner within the range of 0.152.4ug/ml.the method is accurate,precise,simple and useful for the deternation of neomycin residue in the pig tiusse .key word neomycin;microbiological method;residues;ager diffusion method1前 言1.1抗生素殘留的危害伴隨著新霉素等抗生素在獸醫(yī)防治,特別是在飼料添加劑方面的廣泛使用,動物性食品中藥物殘留及其耐藥性問題倍受關注.動物性食品安全問題已經(jīng)引起全世界范圍的廣泛關注.1.1.1 細菌耐藥性的增加抗生素的濫用可能產(chǎn)生耐藥性,從細菌產(chǎn)生耐藥性方面來說, 耐藥菌和飼料中添加抗菌藥物，實際上等于持續(xù)低劑量用藥。這樣會導致動物性食品中的藥物殘留量雖然很低,但是如果人長期食用這種低殘留抗生素的食品,就能抑制后殺滅各種體內敏感菌,由于藥物對細菌的選擇壓力,導致體內耐藥菌不斷增加,耐藥性不斷增強.動物機體長期與藥物接觸，造成耐藥菌不斷增多，耐藥性也不斷增強?？咕幬餁埩粲趧游镄允称分校瑯邮谷艘查L期與藥物接觸，導致人體內耐藥菌的增加。如今，不管是在動物體內，還是在人體內，細菌的耐藥性已經(jīng)達到了較嚴重的程度。1.1.2 正常菌群的破壞正常機體內寄生著大量菌群，如果長期與動物性食品中低劑量的抗菌藥物殘留接觸，就會抑制或殺滅敏感菌，耐藥菌或條件性致病菌大量繁殖，微生物平衡遭到破壞。各種條件菌大量增殖,人體內正常菌群被破壞, 使機體易發(fā)感染性疾病,因細菌產(chǎn)生耐藥性而很難治愈.1.1.3 毒性作用(1)急性中毒:若一次攝入殘留物的量過大，會出現(xiàn)急性中毒反應. 當然急性中毒的事件發(fā)生相對來說是很少的，一般動物性食品中殘留的抗生素對人并不表現(xiàn)為急性毒性作用,藥物殘留的危害絕大多數(shù)是通過長期接觸或逐漸蓄積而造成的.(2)慢性作用:人們長期攝入低劑量的殘留抗生素的食品后,一定時間后則可能由于殘留抗生素在體內的逐漸蓄積而導致慢性作用,主要表現(xiàn)為毒性作用,細菌耐藥性,致畸,致突變,和致癌作用等.某些過敏體質的人,接觸殘留的抗生素,也可能引起一系列的過敏反應(變態(tài)反應) .過敏反應癥狀多種多樣，輕者表現(xiàn)為麻疹、發(fā)熱、關節(jié)腫痛及蜂窩織炎等。嚴重時可出現(xiàn)過敏性休克，甚至危及生命。當這些抗菌藥物殘留于肉食品中進入人體后，就使部分敏感人群致敏，產(chǎn)生抗體。當這些被致敏的個體再接觸這些抗生素或用這些抗生素治療時，這些抗生素就會與抗體結合生成抗原抗體復合物，發(fā)生過敏反應。因此,為保障食品衛(wèi)生和公共健康,建立一套經(jīng)濟,簡單,靈敏度高,易推廣的最廣泛使用的抗生素-新霉素殘留檢測的方法已勢在必行.1.2 新霉素的應用新霉素抗菌譜廣,歸革蘭氏陽性菌和結核桿菌均有良好的抑制作用.新霉素因起其抗菌活力強,作用范圍廣泛,用量少,價格低,口服安全性能高等優(yōu)點,而作為一種常用獸藥及具有發(fā)展前景的飼料添加藥物在畜牧也生產(chǎn)中廣為使用.獸醫(yī)臨床上,新霉素主要用于治療畜禽細菌性腸炎;另外,新霉素還被普遍用于治療乳腺炎,角膜炎,結膜炎,耳言,皮言,外傷感染,足腐爛等疾病.在畜禽養(yǎng)殖上,可提高飼料利用律,促進生長,但是其吸收毒性大,在動物性食品中的殘留可對消費者產(chǎn)生較大的潛在危害,對食品衛(wèi)生和公共健康產(chǎn)生了威脅.1.3 新霉素在動物體中的殘留1.3.1 新霉素在動物體中是藥代動力學研究有關新霉素在動物機體,尤其是在牛機體中的動力學研究很多,但是結果不盡相同.有關新霉素藥代動力學的早期研究主要是采用微生物分析的方法,shaikh和pedersoli使用hplc法分析得到了較長的半衰期值,這說明動力學 參數(shù)明顯受到分析法的影響.black等(1982年)對給牛肌肉注射新霉素后,新霉素在體內的分布情況進行了分析研究.black的實驗提示新霉素在體內的主要排泄途徑是通過腎臟而不是膽汁;另外,在腦組織中也未檢測出新霉素,說明此類化合物是很那通過血腦屏障的.目前,大量文獻已證實新霉素在體內的主要排泄途徑是通過腎臟，腎是新霉素在動物體內的靶組織，并且新霉素與腎臟皮質以較強的離子鍵結合，在腎臟中蓄積時間很長，通常需要2830天的休藥期，但很難通過血腦屏障。新霉素在體內的代謝主要是在消化道內發(fā)生磷酸化、腺苷酸化或乙?；?，被吸收的新霉素絕大部分以原形存在，故新霉素在體內的殘留標志物為新霉素母體化合物.1.3.2 新霉素在動物體中消除規(guī)律的研究ronning和fagerberg在1994年向fda提交了有關新霉素在牛,羊,山羊和豬體內消除規(guī)律的研究報告.用20頭動物(雌雄各半)飲水給藥(劑量約為22mg硫酸新霉素kg體重),連續(xù)給藥14天;另外,2頭(雌雄各半)作為對照,分別在休藥期0,1,2,7小時和14天(牛和豬);1,3,7,14小時和14天(羊);12,24,48,72和96小時(山羊)屠宰后采樣,每次采樣4頭動物(雌雄各半),未給藥的對照組的動物在停藥當天屠宰采樣,采用微生物杯碟法進行殘留分析.實驗結果表明,對照組的每種動物組織中均未檢測出新霉素的殘留;在給藥組動物各種動物中,除了腎組織以外,在肌肉組織以及脂肪組織中均為檢測出新霉素殘留.豬在休藥期0,1,和3天時,腎組織中新霉素平均含量分別為2.174,1.920和0.958ug/g組織,休藥期14天時3頭豬的腎臟組織中未檢出新霉素.從ronning和fagerberg等人的實驗中可以看出,不同的動物中新霉素殘留的消除快,慢不同,但是消除的規(guī)律是一致的,在休藥期的各階段,在上述各動物的肌肉,肝臟和脂肪中都未檢出新霉素;腎臟是新霉素的靶組織,連續(xù)給藥14天(22mg硫酸新霉素/kg體重)后,在休藥期14天個組織均未檢出新霉素的殘留.1.4 新霉素的化學結構與理化性質1.4.1 新霉素的化學結構新霉素的化學結構是以堿性環(huán)己醇為糖苷元與氨基糖縮合而成的苷，其結構中含有6個陽離子位置，可與生物大分子以離子鍵結合，在測定可食用組織里新霉素殘留的提取程序中就要求充分打破新霉素與生物大分子間的鍵，新霉素結構中沒有發(fā)色團存在，故用紫外檢測器和熒光檢測器進行殘留分析之前需要將新霉素結構中的6個伯胺基團是衍生化試劑與之反應的主要部位。、圖1 新霉素的分子式fig.1 molccuar formula structure of neomycin1.4.2 新霉素的理化性質新霉素（neomycin）是有waksman和lechevalieil1949年從鏈霉菌屬弗氏鏈霉菌(streptomyces fradiac)竟發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，新霉素中含有新霉素a.b.c三種成分，主要為新霉素b.c兩種，新霉素a為其水解產(chǎn)物。新霉素是以2-去氧鏈霉胺(2-deoxy streptamine)為母體得到的衍生物。新霉素為堿性水溶性抗生素，穩(wěn)定性很強，對堿、酸，熱等的耐受性比其它抗生素強。新霉素在水中極易溶解，在乙醇、乙醚、丙酮或氯仿中幾乎不溶。1.5 新霉素等獸藥殘留的原因 殘留的原因歸結起來既有質量的問題,又有違規(guī)使用的問題.1.5.1 獸藥質量現(xiàn)狀我國畜牧業(yè)的迅速發(fā)展,帶動了獸藥業(yè)的大力發(fā)展.近些年來獸藥質量雖然有所提高,但仍不能使人滿意,產(chǎn)品合格率一直在6570左右徘徊,合格率未曾有過突破.農(nóng)業(yè)部2002年行文公布的不合格產(chǎn)品中,大多數(shù)是地方產(chǎn)品,而地方產(chǎn)品在獸藥市場中占有很大的份額.1.5.2 獸藥的違規(guī)使用美國在20世紀70年代對獸藥殘留進行調查,發(fā)現(xiàn)其原因有76是不遵守休藥期所致,飼料加工或運輸過程中污染占12,儲藏不當占6,其余6是藥品的使用不正確所致.從中可以看出不遵守休藥期占主要方面.目前,我國動物產(chǎn)品中獸藥殘留超標的主要原因是:非法使用禁用獸藥及其化合物;不遵守休藥期的規(guī)定;超劑量,超范圍用藥;違反有關標簽的規(guī)定等.1.6 新霉素在動物性組織中的殘留的檢測方法 有關新霉素含量測定的化學方法報告很多,主要有薄層層析,紙層析,高壓液相色譜法,氣相色譜法,分光光度法,電泳法以及離子交換法等.這些方法主要是用來測定發(fā)酵肉湯和藥片中的新霉素的含量,很少被應用到生物材料中.據(jù)文獻報道,用于測定生物材料中新霉素殘留的方法有微生物方法,高壓液相色譜法,薄層層析法和電泳法.其中以前二種為主要方法.目前,國外新霉素殘留檢測的方法也主要是這兩種方法,即微生物方法和高壓液相色譜法兩種.其中,國外的微生物方法以fda的傳統(tǒng)方法為代表.下面就以上幾種測定生物材料中新霉素的方法做一簡單介紹.1.6.1 微生物學方法用微生物發(fā)測定新霉素含量所應用的菌群主要為金色葡萄球菌(staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)兩種.groves等人(1955年)描述了生物體液和組織中新霉素的微生物分析方法,其中主要的是應用于檢測臨床生物樣品中微生物.kavangh等人(1963年)描述了用表皮葡萄球菌為測試株,測定血清,尿液和組織中的新霉素含量.groves和kavangh發(fā)方法均沒有針對動物性食品中新霉素殘留的測定,但是為微生物學方法測定新霉素殘留測定奠定了基礎.siddique等人（1965年）報道了一套靈敏度較高的微生物方法測定牛奶中的新霉素，測試菌為表皮葡萄球菌。barbiers等人（1967年）報道了組織中新霉素的分析程序，其法在肝臟，腎臟，肌肉中的靈敏度低于0.5ppm，脂肪中可達到0.2ppm。neff等人（1970年）報道了一套由18家實驗室合作研究的測定飼料中新霉素含量的微生物學方法，方法測試菌為表皮葡萄球菌。平均回收率達到95.5。neff等人的方法成為美國aoac規(guī)定的測定飼料中新霉素的標準方法。1.6.2 液相色譜法液相色譜法（lc）技術在分析化學上具有很高的靈敏度和特異性。自1985年shaikh等人首次報道用lc法檢測動物組織中的新霉素殘留量以來，lc法在新霉素殘留上的應用被日益完善。1.6.3 薄層層析法 薄層層析法（thin layer chromatography, tlc ）在實驗室中被廣泛用于提純混合物中的新霉素或是測定新霉素片劑中的有效成分新霉素b、c的含量。在動物性組織中新霉素殘留量的測定中，tlc主要用來進行hplc分析法前和質譜法確定前新霉素的醇化，但是也有報道用tlc法直接測定新霉素殘留。1.6.4 電泳法smither等（1978年）報道了用電泳法鑒定動物組織和飼料中含新霉素在提內的五十種抗生素，由于方法中的提取液（乙晴甲醇蒸餾水）和菌種（蠟狀芽孢桿菌與藤黃微球菌）不適合新霉素，新霉素沒有得到理想的回收率，靈敏度也不高.在新霉素殘留分析的幾種方法中,薄層層析主要被作為一種提純手段應用于新霉素殘留測定,而電泳法也因為其過程的繁瑣和靈敏度不高而在新霉素殘留分析上受到限制，因此，高壓液相色譜法和微生物法是兩種主要的測定動物組織中新霉素殘留的方法。高壓液相色譜法具有其他方法不可比擬的高靈敏，高特異性以及檢測速度，但其預處理過程復雜，不適合進行大批量樣品的同時檢測。而微生物法操作簡便，樣品用量少，預處理簡單，易推廣，具有一定的靈敏度，在大批量樣品同時分析中占有很大的優(yōu)勢,但只能測定有生物活性的殘留物,且只有當藥物代謝標志殘留物具備生物活性時才能測定總的殘留量,而新霉素在動物體內殘留標志物為具有生物活性的新霉素母體化合物.1.7 研究的目的 綜上所述，本次試驗的目的就是要為保障動物性食品衛(wèi)生和公共健康而建立一套經(jīng)濟、方便、具有有一定靈敏度的檢測豬組織中新霉素殘留量的微生物學檢測方法。2 材料與方法2.1 材料2.1.1 儀器與試劑 勻漿機 am-6 日本nihoseiki kaisha ltd離心機 ld4-2a 北京醫(yī)用離心機廠 電子天平 bs210s(max=210g d=0.1mg)手提式壓力蒸氣滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠電熱恒溫數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華hh-4牌電熱鼓風干燥器 101a-2型 上海市實驗儀器總廠電熱恒溫真空干燥箱 康樂牌dzk88-a型 上海醫(yī)療器械七廠電熱恒溫培養(yǎng)箱 hh.b11.600.s 上海躍進醫(yī)療器械廠渦旋混合器 wh-1微型(轉速2000r/min) 上海滬西分析儀器廠培養(yǎng)皿 20100mm游標卡尺 精確度0.02mm 北京分光光度計 722型組織剪，吸量管，電爐，錐形瓶，酒精燈，接種環(huán)2.1.2 藥品與試劑 新霉素標準品 含量703iu/mg蛋白胨 生化試劑瓊脂粉 生化試劑酵母粉 生化試劑牛肉浸膏 生化試劑葡萄糖 分析純氯化鈉 分析純磷酸氫二鉀 分析純磷酸二氫鉀 分析純氫氧化鈉 分析純氯仿 化學試劑2.1.3 實驗菌種 表皮葡萄球菌(指導老師提供)2.2 方法2.2.1 溶液配制:(1) 0.1mol/l滅菌磷酸鹽溶液（ph 8.0） 準確稱取16.73g無水磷酸氫二鉀（k2hpo4）和0.523g無水磷酸二氫鉀（kh2po4），加蒸餾水溶解并稀釋至1000ml，用121滅菌20min，備用。(2) 新霉素標準品儲備溶液將新霉素標準品置于37干燥箱48h后，精密稱定0.01422g。用無菌磷酸鹽緩沖溶液溶解稀釋至100ml，得到濃度為100ug/ml的標準儲備液，置4冰箱保存，有效期為4周。2.2.2 培養(yǎng)基的制備 培養(yǎng)基i及培養(yǎng)基ii的組成見表1。 表1 培養(yǎng)基組成table 1 the composing of the culture medium培養(yǎng)基i（累代保存用培養(yǎng)基）培養(yǎng)基ii（檢定培養(yǎng)基）蛋白胨/g10.010.0酵母粉/g 3.0 3.0牛肉浸膏/g 1.5 1.5無水葡萄糖/g 1.0 1.0瓊脂粉/g 15.0 15.0蒸餾水/ml 1000 1000(1) 培養(yǎng)基i（斜面培養(yǎng)基）溶解蛋白胨10g，酵母粉3.0g，牛肉浸膏1.5g，無水葡萄糖1.0g和瓊脂15g于蒸餾水中，并稀釋至950ml用1.0mol/ml naoh溶液調節(jié)培養(yǎng)基ph值為6.56.6，最后定容至1000ml。將培養(yǎng)基分裝于試管中，121高壓滅菌20min，制成斜面，用于菌種復活和傳代培養(yǎng)。(2) 培養(yǎng)基ii（分析培養(yǎng)基）溶解蛋白胨10g，酵母粉3.0g，牛肉浸膏1.5g，無水葡萄糖1.0g和瓊脂粉15g于蒸餾水中，并稀釋至950ml，用1.0mol./l naoh溶液調節(jié)ph值為7.98.0。最后定容至1000ml，將培養(yǎng)基分裝于500ml錐形瓶中，在121高壓滅菌20min。2.2.3 菌液的制備 將表皮葡萄球菌在新鮮培養(yǎng)基i（斜面培養(yǎng)基）上連續(xù)傳代3次，用56ml 0.85%無菌溶液沖洗斜面培養(yǎng)物并倒入300ml錐形瓶中，然后用0.85%無菌溶液稀釋成菌懸液。在722型分光光度計560nm波長下，控制其透光率為80%左右，菌懸液由試驗當天制備。2.2.4 平板的制備(1) 底層：加10ml融化分析培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中，均勻鋪平，在水平面上待其凝固。(2) 菌層：加適量（0.20.5ml）新制備的菌懸液至100ml預先融化并冷卻至48h分析培養(yǎng)基中，徹底混勻后，在每個含有底層的培養(yǎng)平板中加入4.0ml，使培養(yǎng)基均勻分散鋪平，并待其冷卻凝固，在使用的當天制備平板。2.2.5 標準曲線的制備(1) 標準曲線稀釋液的制備分別取豬的空白肌肉、腎臟組織，經(jīng)搗碎后，于-20冷凍保存，臨用前解凍。分別稱取10g肌肉組織，10g腎臟組織，裝于50ml帶蓋塑料離心管中，加入20ml磷酸鹽緩沖溶液（ph 8.0），置旋渦混合器混合1min，然后在04放置30min后防如100水浴加熱5min，冷卻，4000r/min的速度離心15min，收集上層液。用少量1mol/ml溶液調節(jié)上層液至ph 8.0，于33下平板培養(yǎng)20h，不出現(xiàn)抑菌圈即可作為標準曲線稀釋液備用，04下保存，不超過一周。(2) 肌肉組織的標準曲線用0.1mol/ml磷酸鹽緩沖液（ph 0.8）稀釋新霉素標準品儲備液（100ug/ml）10ug/ml，然后用空白肌肉組織提取液（制備見2.2.5（1）稀釋為0.075，0.15，0.3，0.6，1.2和2.4ug/ml(稀釋標準參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，動物源食品中新霉素殘留的檢測方法微生物檢測法z，農(nóng)業(yè)發(fā)200138號)的一系列標準曲線濃度，0.6ug/ml為參照濃度，按一劑量法的原理制備各標準曲線，即取新霉素標準品儲備液（1000ml），再把100ug/ml標準品溶液稀釋成10ug/ml，最后，10ug/ml標準品儲備液稀釋成所需要的各個工作標準濃度（0.15，0.3，0.6，1.2，2.4ug/ml），中心濃度標準設為其中一個（如0.6ug/mg）。每個工作標準液濃度點制備3個培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中等距打六個孔,間隔的3個孔中分別滴入250ml中心濃度標準液，另間隔3個孔中分別滴入250ul工作標準液，于（361）恒溫培養(yǎng)（161）h用游標卡尺測量抑菌直徑，得到回歸方程和標準曲線。在坐標紙上繪出，以各濃度的對數(shù)值為縱坐標，平均抑菌圈直徑的校正值為橫坐標繪制標準曲線。(3) 腎臟組織的標準曲線用0.1mol/ml磷酸緩沖液（ph 0.8）稀釋新霉素標準品儲備液（100ug/ml）至10 ug/ml，然后用空白腎臟組織提取液（制備見2.2.5（1）稀釋為0.1，0.2，0.4，0.8，1.6和3.2 ug/ml的一系列標準曲線濃度，0.8 ug/ml為參照濃度，按一劑量法的原理制備標準曲線，在坐標紙上繪圖，以各濃度的對數(shù)值為縱坐標，以平均抑菌圈直徑的校正值為橫坐標繪制標準曲線。2.2.7 回收率測定（1）樣品準備稱取5.0g搗碎的空白肌肉、腎臟組織于50ml塑料離心管中，稱2份，分別加入0.5ml不同濃度的工作液和磷酸鹽緩沖溶液，使加入溶液的總量為10ml，肌肉組織中新霉素濃度為分別0.25，0.5，1.0和2.0ug/g，腎臟組織中的新霉素濃度分別為0.375，0.75，1.5和3.0 ug/g。將空白組織和新霉素標準工作液的混合物放置在旋渦混合器上1min，使之充分混勻，然后至04放置30min，使新霉素充分滲透到組織中去。（2）提取在各樣品中分別加入9.5ml 0.1mol/ml磷酸鹽溶液，放置在旋渦混合器上混合1min，使之充分混勻，然后置04放置30min，使新霉素在混合物中充分分散。(3) 去蛋白將樣品中加入10ml氯仿,置于漩渦混合器上振蕩均勻，4000r/min速度離心15min，分離的上層液用少量1mol/ml（12滴）調至ph8.0。(4) 測定用上清液做抑菌試驗，每皿間隔3個孔中滴加標準品參照濃度工作液，另3 個孔中滴加樣品上清液，37培養(yǎng)1820h，量取抑菌圈直徑，根據(jù)標準曲線計算出實測藥物的濃度。2.2.8 計算(1) 新霉素殘留量的計算公式 x=cv/m其中 x組織樣品中新霉素殘留量（ug/g） c-試樣液中新霉素濃度(ug/ml) v-試樣總體積(ml) m-豬組織樣品重(g)(2) 回收率計算實際測出的藥物濃度與豬組織中添加的藥物濃度之比計算回收率,以百分數(shù)表示.3 結果 3.1 標準曲線的制備本研究方法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內的擴散作用，采用量平行線的原理設計，即計量法，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，結果見表2和表3，以測定供試品效價的一種方法。本研究制備標準曲線采用的方法是：用提取空白組織（肌肉、腎臟）的緩沖液為介質制備標準曲線。該方法須要進行回收率實驗（明新霉素能夠從組織中回收）。其結果見表4和表5。 表2 肌肉組織抑菌試驗結果table 2 the result of the test of bacterria hibition of the musclu tissue d1 d2d3d0.15（ug/ml12.02 10.8012.7912.2811.2912.9813.0111.8813.1012.230.3 ug/ml15.0213.8715.6014.6414.1515.1214.9014.2614.8614.710.6 ug/ml16.7317.2217.3416.8617.6917.9616.8616.9018.2017.311.2 ug/ml19.1119.7019.9419.2419.8420.1619.6020.0019.1419.632.4 ug/ml21.2221.9821.6821.4822.1022.0021.4622.2122.4021.84表3 腎臟組織抑菌試驗結果table 3 the result of the test of bacterria hibition of kidney tissued1d2d3d0.2 ug/ml9.9011.1610.8111.4810.7911.2411.2610.4311.4810.950.4 ug/ml12.8813.2613.2012.9613.5612.9613.0413.4613.1613.160.8 ug/ml18.817.0817.8817.4017.9818.6617.8017.4218.2017.911.6 ug/ml20.4320.8621.0820.5620.6720.1619.8819.5620.7620.443.2 ug/ml22.2021.8821.2322.1822.2622.8823.7622.8623.0022.25 d-抑菌圈直徑;d-抑菌圈平均值.以下相同表4 肌肉組織的標準曲線table 4 the standard response curve for muscle 標準曲線濃度新霉素添加濃度(ug/ml)0.0750.150.30.61.22.4平均抑菌圈直徑(mm)11.7415.0118.0219.2421.80樣本數(shù)：n=3;-表示未檢出，以下表格都相同。圖1 肌肉組織標準曲線圖fig.1 the standard response curve for muscle圖2 腎臟組織標準曲線圖(fig.2 the standard response curve for kidney)3.2 回收率 對新霉素添加水平為0.25，0.5,1.0和2.0ug/g組織的肌肉組織以及添加水平為0.375、0.75、1.5和3.0ug/g組織的腎臟組織進行回收率測定，結果見表6.表6 肌肉和腎臟組織的回收率table 6 recovery of muscle and kidney樣本新霉素添加水平(ug/g組織)新霉素平均回收水平 (ug/g組織)新霉素平均回收率(ug/g組織)肌肉0. 250. 51. 02. 00.390.821.9385.274.483.2腎臟0. 3750. 751. 53. 00. 71.322.7378.188.081.1樣本數(shù)：n=3. 從表3可以看出，組織中的檢測限為0.50.75ug/g組織，在0.53.0ug/g組織的添加水平下，平均回收率為81.7.4 討論與分析4.1 標準曲線shaikh等用提取空白組織的緩沖液為介質制備標準曲線的方法得到的標準曲線斜率十分一致。本試驗中測得兩種組織標準曲線斜率的變異系數(shù)很小，表明本研究支持了shaikh的結論。本研究結果中兩種組織標準曲線的斜率不同，不同組織中方法的靈敏度也不同，這說明組織材料的成分會影響新霉素的測定。bielecka等報道分別用磷酸緩沖液、雞空白肝臟組織提取液稀釋青霉素、四環(huán)素以及鏈霉素，結果發(fā)現(xiàn)在任一給出的抗生素濃度，抑菌圈大小隨著稀釋物不同而變化。 4.2 回收率試驗fda的分析方法中將提取之后的樣品離心，然后直接用上層液為待檢溶液，本研究發(fā)現(xiàn)這種方法得到的上層液比較渾濁，不能在培養(yǎng)基中充分擴散，因此回收率的值不高，本研究中此方法對新霉素添加水平為1.0ug/g的肌肉組織的平均回收率只有74.4%用微生物學方法檢測雙氫鏈霉素和四環(huán)素殘留時采用酸化樣品使蛋白質變性，然后進行離心的方法，結果使回收率的比fao方法有顯著提高。本研究采用injlis等方法后發(fā)現(xiàn)酸化樣品，然后用堿調ph值的過程麻煩，并且難以計算樣品的終體積，另外，培養(yǎng)平板上抑菌圈的邊緣比較模糊，不容易進行準確測量。vilim等 報道在微生物學方法檢測動物組織中青霉素類抗生素時，對提取之后的樣品加熱后進行離心，平均回收率達94.6%99.1%；shaikh等在用hplc法檢測新毒素殘留時將樣品在沸水中加熱10min，使蛋白質充分變性沉淀。新霉素是耐熱性很強的抗生素，在沸水中加熱不會破壞其活性。因此，本研究將加入氯仿去蛋白這一步驟加入fda方法中，結果得到的待檢溶液澄清，新霉素添加水平為1.0ug/g的肌肉組織平均回收率為74.4%，比用fao方法得到的回收率提高近12.8%.fao方法中所用提取液體體積為組織樣品的3倍。當提取液體積增大時，樣品稀釋的倍數(shù)隨之增加，因此組織中藥物含量低事難以檢測出來。本研究結果發(fā)現(xiàn)2倍于組織樣本重量的提取液可以使藥物添加水平為0.53.0ug/g的組織的樣品得到滿意的回收率，本研究的結論同katz和bielecka的相一致。4.3 菌懸液細菌的濃度要控制在一定適當?shù)臄?shù)量，一般在722型分光光度計560nm波長下，控制菌旋液的光透率在80%.細菌濃度過高過低都會影響藥敏試驗的結果。4.4 蛋白質方法的選擇本試驗過程中遇到最大的問題是蛋白質變性的問題。由于未變性的組織均漿有一定的的粘稠度，在瓊脂擴散法測定時，影響藥物的均勻擴散，因此必須選擇合適的方法使其變性沉淀。新霉素對熱、酸、堿都很穩(wěn)定，可以考慮用磷酸鹽緩沖液處理后用以下方法使蛋白質變性。4.4.1 加熱 將處理后的樣液于04靜置30min，放入100水浴加熱5min，取出冷卻，以4000r/min.本方法能使蛋白質完全變性，但加熱后雞蛋完全凝固，難以獲取上清液。4.4.2 紫外線照射 將處理后的樣液于紫外燈下放置處理過夜。此法不能使蛋白質完全沉淀。4.4.3 調節(jié)ph值 該方法是根據(jù)蛋白質在等電點時有最大沉淀的原理進行設計，先用磷酸調節(jié)處理液ph值為4.04.5之間，使一部分酸性蛋白沉淀，以4000r/min離心15min，再用30%氫氧化鈉溶液將ph調至8.0，以4000r/min的速度離心15min，得上清液。該方法你能使蛋白質完全沉淀，而且無法去除脂肪，抑菌圈小。4.4.4 乙睛或乙醇 處理后的樣液加入倍量（10ml）乙睛或乙醇，振搖，4000r/min離心15min,得上清液.該法能有效的使蛋白沉淀,并去處脂肪.但由于上述兩種有機溶劑都能與水互溶,用此法處理的上清液進行抑菌試驗時,有機溶劑影響了細菌的生長以及藥效,無抑菌圈出現(xiàn).4.4.5 氯仿 處理后的樣液加入1倍量(10ml)氯仿,振搖.4000r/min離心15min,得上清液. 不同方法處理豬組織漿的試驗結果表明,以氯仿處理豬組織勻漿的效果最好,抑菌圈邊緣清晰,檢出限最低.筆者認為,氯仿是一種脂溶劑,豬組織經(jīng)氯仿處理后,可使脂蛋白變性,離心后介于中層,脂肪溶于氯仿沉于下層,藥物留在上清液中,排除了脂肪和蛋白質的干擾,達到較好的提取效果.5 小結 本試驗用提取空白組織(肌肉和腎臟)的緩沖液為介質制備標準曲線,并進行了回收率的試驗,以表明新霉素能夠從組織中回收. 標準曲線的斜率在0.152.4ug/ml之間比較一致，具有良好的線性范圍。組織中的檢測限為0.50.75ug/g組織，在0.53.0ug/g組織的添加水平下，平均回收率為81.7% 。說明本次試驗所用的方法能夠有效的檢測出豬組織中的新霉素殘留量，是一套較可靠的動物性食品中新霉素殘留量檢測的微生物學方法。在本次試驗中用氯仿去除脂肪的影響有效的提高了組織中新霉素的藥液的提取效果，比以往只去除蛋白的效果更好。但回收率應需在試驗方法改進的情況下有所提高。參考文獻：1王蘇華，周楊,雞肉中新霉素殘留的微生物學檢測方法,中國獸藥雜志j，2003,3（2）：1619。2王春奕，馬睿麟，馬玉蘭，馬北莉,雞和豬肉中抗菌素殘留和檢測,中國家禽j，1997,11。3張治錟，抗生素藥品檢驗、1991年版m.北京：人民衛(wèi)生出版社。4中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，動物源食品中新霉素殘留的檢測方法微生物檢測法z，農(nóng)業(yè)發(fā)200138號。5鄭均鏞，王光寶，藥品微生物學及檢測技術m.北京：人民衛(wèi)生出版社，1989，364388。6沈川，肖希龍，新霉素在動物機體中的殘留及其測定方法，中國獸藥雜志j，1998，32（2）：5356。7馬成林，動物性食品理化檢驗學m.長春：中國